Name: 肝灌流による肝細胞の精製した生体肝エンドサイトーシスに (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 35 s
Description: 学ぶ肝灌流による肝細胞の精製とエンドサイトーシス評価法。ラット肝臓から肝洞静脈内皮細胞を単離し、生体でのマクロ分子除去や肝疾患研究への応用を可能にする実験手法を解説します。

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私たちは、大学で博士ポールワイゲルに感謝したいと思います。 HARE/Stabilin-2受容体の検出のためのモノクローナル抗体を30使用するためのオクラホマとジャネットヴァイゲルの彼女の技術支援のための。この研究はネブラスカ州の研究費の大学によって資金を供給される。

1。肝臓の切除（修正14,15とPO Seglen 12とR. Blomhoff 13から採用された） <ol><li>クローズ5.5 Lチャンバー内のペトリ皿にポリエチレングリコールのイソフルラン10mLの30％を追加。それは、チャンバー内で安定な雰囲気を作成するにはイソフルランの添加後10〜15分を待つことが最適です。 </li><li>密閉チャンバーにラットを置き、それが麻酔になることができます。麻酔の完全な効果は、動物がぐったりなったときに、応答のない明白であり、そして深呼吸を示す。 </li><li> 30mLの注射器のチューブの下部にある綿球のポリエチレングリコールのイソフルランの場所を2mL。 </li><li>おむつに覆われたトレイに、その背中にラットを置き、鼻を介して注射器のチューブを置きます。 </li><li>直ちに70％エタノールで腹部を濡らすことによって、深い麻酔を確認してください。動物はイソフルラン過剰摂取で死ぬようにしてください。 </li><li>包帯のはさみや鉗子を使用して、全体のABDを公開ominal空洞。 </li><li>静脈ポルタを検索して、鉗子を使用して、すぐに腸間膜枝の上に静脈ポルタ下外科シルクやポリエステル糸（合字）の二本鎖を引く。 </li><li>鉗子を撤回し、緩い結び目の結び目を作る。 </li><li>静脈ポルタの下に鉗子を使用して、ゆっくりと静脈をまっすぐに引いて、Insyte Autoguardのカテーテル（18 GA、1.3 × 300ミリメートル、BDバイオサイエンス）または同様のカテーテルを静脈にカニューレを挿入する。カテーテルは、スレッドによって形成されるループを超えて数mmを行く必要があります。 </li><li>カテーテルにあるバネトリガーを解放することによって針を収納して削除する。血液は、適切な合字の配置を示すカテーテルにまで浸透開始する必要があります。 </li><li>オーバーハンドノットを締め、別のオーバーハンドノットで固定します。 </li><li>血液が循環系から排出できるように、どちらかの下大静脈や下行大動脈（腹部大動脈）を断ち切る。 </li><li>酸素と肝臓のフラッシュを開始する37 TBS℃で20 mL /分の流量で血液（白化）を除去する。肝臓は赤紫色からローム層の色に変わるはずです。 </li><li>肝臓がフラッシュされている間、消費税消化管と結合組織を離れて切断することによって肝臓。肝臓または穿刺グリソン鞘を裂くようにすることが重要です。 </li><li>バッファの収集と再循環を可能にする漏斗上にプラスチックのネット上で肝臓を置きます。この時点でバッファは循環が、廃棄物のビーカー内に流入してはいけません。フラッシングは、10分以上続くことはありません。 （ 図2A）。ステップ2.1で必要なエンドサイトーシスの溶液を調製します。 </li></ol> 2。 125 I - SA - B - HEP（または他の適切な標識リガンド）の内在化<ol><li>小さ ​​なビーカーに50mlのRPMI培地に、最終濃度0.05％のBSAと0.01 mCiの125 I - SA - B - HEPまたはエンドサイトーシスのための他の適切な標識リガンドに追加します。 </li><li> apparatuにこのビーカーを取り付けますの酸素化を可能にする。 </li><li> 、ポンプの電源をオフにインレットチューブを切り替え、その後、20mL /分でポンプの電源を入れます。 </li><li>というラベルのRPMIが肝臓に近づくと、ポンプの電源を切り、漏斗とチューブドレインで余分な水分を許可する。 </li><li>ラベルを付けたメディアの再循環を可能にしてポンプを再起動するためにメディアのビーカーにドレインチューブを置きます。 </li><li>流体がこれ以上より1時間肝臓を通して循環することができます。 </li><li>この内部化のステップの間、肝臓内の温度がそれをカバーし、消化のためにコラゲナーゼを準備することで安定であることを確認してください。 </li></ol> 3。コラゲナーゼ消化により肝臓の消化<ol><li>たて溶解し、ろ過（0.45μm）のコラゲナーゼ（100 mg / kgのラットの体重）を37で60 mLを超えないように総量で2をバッファに追加されるべき℃にボリュームは、チューブの長さ/内部容積に依存しており、それに応じて調整する必要があります。 </li><li>ポンプと交換停止メディアのビーカーからTBSへの入口チューブ。 </li><li>カルシウム依存しているdesmosomal細胞の接合部のゆるみを可能に50mL /分で2分間の肝臓をフラッシュします。 </li><li>肝臓がフラッシュされている間、装置のコラゲナーゼを含むビーカーにメディアのビーカーを交換。 </li><li>すぐに洗浄後、15分間20mL /分の流量で循環ループにおけるコラゲナーゼで消化を始めます。コラゲナーゼのバッチは、ロット番号によって異なりますので、消化の量と時間の変動は、コラゲナーゼのすべての新しいロットのために最適化する必要があります。コラゲナーゼはまた、カルシウム依存性である。ポンプの電源をオフにして、フラスコBに（ 図2B）フラスコBに廃棄物の容器からの流出ラインを転送フラスコからバッファおよびガスラインを切り替える。 </li><li>ポンプを停止し、カテーテルを取り外し、20〜30 mlのBuffer 1を含む皿に肝臓を転送する。 </li><li>肝臓のグリソン鞘戻って皮をむき、細胞を振る液体での出。 </li><li>液体が細胞物質と不透明になると、30μmのメッシュを介して、次に50 mLコニカルに氷上でろ過により、100μmのメッシュを介して細胞を移す。 </li><li>肝臓に多くのバッファ1を追加し、メッシュフィルターと円錐に液体を移す、肝臓のマトリックスから細胞を振り続ける。 </li><li>これ以上の細胞が肝臓の揺れ合理的に外れないことができるまで、ステップを3.9から3.7を繰り返します。 </li></ol> 4。肝細胞とSEC精製<ol><li> 3分間150 × gで細胞を含有する50mLのconicalsを遠心分離します。ペレット肝細胞へ。 </li><li>氷の上で新鮮な50mLのconicalsする非実質細胞を含む液体フラクションを転送する。 </li><li>肝細胞は、バッファ3にペレットを再懸濁し、ステップ4.1と4.2を3回繰り返すことが洗う。 </li><li>洗浄の最後に、ペレットは≥97パーセント純粋な肝細胞です。 SECSを取得するには、管cのすべてを遠心10分間、200 xgで（造血幹細胞、SECS、およびKCSといくつかの小さな肝細胞を含む）上清をプールontaining。 4℃ </li><li>バッファーを吸引除去し、4で5 mLのRPMI / BSA内のすべてのペレットを再懸濁℃を</li><li> 2チューブに一緒に細胞をプールし、35 mLのボリュームを最大RPMI / BSAを加える。 </li><li> 3分を100 × gでconicalsを遠心分離します。 </li><li>液体ときれいな50 mLコニカルへの転送の上位25 mLを収集する。 </li><li>残りの10 mLの培地でペレットを再懸濁し、バック冷RPMI / BSAと3分を100 × gで遠心分離を25 mLを加え。 </li><li>もう一度手順3.8と3.9を繰り返して、細胞ペレットと下位10 mLのメディアを破棄する。 </li><li> 10分間、200 xgでペレットSECS、KCS、および造血幹細胞にsupernatentsを遠心分離します。 4℃ </li><li>氷上でPBSで20mLの25％パーコールを含む3つの50 mLの試験管を準備します。各チューブに15 mLの50％パーコールとアンダーレイ。 </li><li> 30 mLのRPMI / BSAの合計容積に細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>慎重にオーバーレイEAC4℃20分、900​​ xgで細胞と遠心を10 mL℃の時間勾配</li><li> SECSとKCSは非常に好調な密度を閉じて、50分の25％のインタフェースにありますしている。 25％/メディアは、脂質を格納する細胞としての高い浮力に起因する界面での造血幹細胞は、通常です。残りのすべての肝細胞と血液細胞は、低いbuoyanciesを持っているし、ペレット化。 50分の25％の界面付近のトップダウンから吸引し、この材料を捨てる。 </li><li> 50分の25％のインタフェースと冷RPMIと新鮮な円錐への転送に細胞を回収。最終容量は、パーコールを希釈するために〜40 mLのはずです。 </li><li> 4時10分、350 × gで円錐形を遠心° Cの細胞をペレット化する。 </li><li> 〜10 mLを予め温めておいたRPMIは酸洗浄ガラスペトリ皿または結晶皿の中で100 U / mLのPenicillin/100 g / mlのストレプトマイシンおよび場所の細胞を含むで細胞を再懸濁します。 </li><li> 15分間細胞をインキュベートする。組織培養インキュベーターで37℃。 </li><li>ロックまたはスワールプレートを少しし、上清中のSECSを収集する。 KCSは、はるかに急速にSECS以上のガラスに付着する。また、SECSは、磁気ビーズに結合した抗CD31またはanti-Stabilin2/HARE抗体を用いた免疫精製によってKCSから分離することができる。 </li><li>生存率と細胞数は血球計算盤を用いてトリパンブルー排除により、または自動細胞カウンターを用いて評価することができます。 </li><li> 37フィブロネクチンでコーティングされたプラスチック製の皿° C、5％CO 2、40 ng / mLのVEGF、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシンを持つまたは肝細胞馴化培地とRPMI/0.25％のBSAでの文化は、SECS。 </li><li>これらの培養方法を用いて肝細胞、KCS、およびSECSガンマカウンターで標識された物質の内部化のために評価し、細胞のタンパク質や顕微鏡での合計に正規化されることがあります（蛍光標識されている場合）。 </li></ol> 5。代表的な結果： 肝細胞精製は≥97％であるとSECの精製はtypicです味方≥95％このメソッドを使用する。腹腔の切除、門脈のカニューレ挿入、および肝臓のブランチングは、すべての最良の結果を得るためには分以内に発生する必要があります。 HARE/Stabilin-2は、肝臓のSECS上の特定の受容体であり、他の肝臓の細胞型で発現されていません。このサンプルでは、肝細胞及びSECS両方の細胞溶解液を5％SDS - PAGEにより分離し、Stabilin - 2の両方のアイソフォーム（ 図3）に対するモノクローナル抗体でプローブ。 血流に注入された未分画ヘパリンは肝臓16でクリアされます。クリアランスは、主に肝細胞およびKCS 17〜対照的に、肝臓のSECSによって実行されます。 Stabilin-2/HARE受容体が結合し、SECS 18にヘパリン内部化メインクリアランス受容体である。ここに私たちの例では、我々はN -アセチルグルコサミン/ NSのカルボキシレート基上にビオチンタグを使用してヘパリンというラベルが付いて。ビオチンは、内部化ヘパリンのprotの検出のためのヨウ素化されたストレプトアビジンと結合させたeoglycan。放血30分後の注射に続いて標識したヘパリンの注入は、私たちはヘパリンのこの形式を内部化なる器官を監視することができます。この短い時間間隔で、肝臓は主なクリアランスの器官（ 図4）です。 より明確に細胞型がクリアランスに責任があるかを理解するために、我々は、0.05％BSAを添加したRPMI培地にI - SA - B - HEP 125を追加し、それが20分間肝臓を通って循環することができました。コラゲナーゼ消化し ​​、細胞の精製の ​​後、標識したヘパリンの大部分は肝細胞（ 図5）とは対照的に、SECSによって内在化されています。 <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1基本的な肝臓のアーキテクチャ。 SECSは、正弦波の壁を形成し、通常は（円の小さなクラスター）窓のあるされています。星状細胞（HSC）は、クッパーCとは対照的にDisseのスペースに記載されています通常、正弦波の微小血管に存在するells（KCS）。肝細胞はDisseのスペースの反対側を占める。 <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。灌流装置の回路図。 A）肝臓の類洞のフラッシュ/洗濯時の装置のセットアップ。 TBSは1Lフラスコにあります。 B）コラゲナーゼで〜60 mlのBuffer 2を含む125mLのフラスコに、閉回路における肝臓の消化のために使用されます。排水ラインは、ゴム栓でノッチのカットを通じて廃棄物の容器からフラスコBに変更されます。酸素ラインは発泡避けるために、コラゲナーゼ（フラスコB）を含む緩衝液に浸漬されていません。各フラスコでストッパーは排水ラインの効率的な転送を可能にすると酸素ガスからの上昇圧力を防ぐために、ノッチです。 <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。 <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4。器官の標識ヘパリンの分布。ラットを30分間125 I - SA - B - HEPの待機と外側尾静脈を介して注入し、放血した。血液は人工的にあらゆる臓器に高い測定値を与えるためにしないように、収集した。各器官の分当たりのカウント数（CPM）は、グラムの臓器の重量に対して正規化された。 <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig5.jpg" alt="図5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5"> 図5肝細胞及びSECSで標識したヘパリンの量。 RPM125 I - SA - B - HEPを含む私のメディアは、コラゲナーゼ消化し ​​、細胞の精製に続いて20分間そのままに肝臓を通って循環させた。肝細胞およびSEC細胞の蛋白質の溶解物の等量のBradfordアッセイで定量し、ガンマカウンターでカウントした。 <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig6.jpg" alt="図6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図6"> 図6。クッパー細胞は、ガラス上に付着によってSECSから分離されています。細胞は酸洗浄ガラス結晶皿に入れ、37℃で15分間、5％CO 2のために付着させた。非付着細胞を含む上清を静かに旋回し、遠心管に入れていた。ガラスの両方の接着細胞（レーン1）から、非接着細胞（レーン2）から溶解液を8％SDS - PAGEにより分離、ブロッティング、およびクッパー細胞に特異的であるCD163に対する抗体でプローブした。 <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig7.jpg" alt="図7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図7"> フィブロネクチン被覆プラスチックにメッキを図7。SECSを6ウェルディッシュは、0.1％BSAを添加したRPMIで一晩インキュベートした。位相コントラスト画像は、（A）100倍と（B）200倍の倍率で撮影した。

<ol><li>Elvevold, K., Smedsrod, B., Martinez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+liver+sinusoidal+endothelial+cell%3A+a+cell+type+of+controversial+and+confusing+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The liver sinusoidal endothelial cell: a cell type of controversial and confusing identity.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver. Physiol. 294, G391-G400 (2008).</li>
<li>Friedman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+stellate+cells%3A+protean%2C+multifunctional%2C+and+enigmatic+cells+of+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver.</a> Physiol. Rev. 88, 125-172 (2008).</li>
<li>Smedsrod, B., Pertoft, H., Gustafson, S., Laurent, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scavenger+functions+of+the+liver+endothelial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Scavenger functions of the liver endothelial cell.</a> Biochem. J. 266, 313-327 (1990).</li>
<li>Shiratori, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+sinusoidal+cell+function+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Liver.+Dis%22%5BJournal%5D)">Quantification of sinusoidal cell function in vivo.</a> Semin. Liver. Dis. 13, 39-49 (1993).</li>
<li>Smedsrod, B., Pertoft, H., Eriksson, S., Fraser, J. R., Laurent, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+in+vitro+on+the+uptake+and+degradation+of+sodium+hyaluronate+in+rat+liver+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Studies in vitro on the uptake and degradation of sodium hyaluronate in rat liver endothelial cells.</a> Biochem. J. 223, 617-626 (1984).</li>
<li>Harris, E. N., Kyosseva, S. V., Weigel, J. A., Weigel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+processing%2C+and+glycosaminoglycan+binding+activity+of+the+recombinant+human+315-kDa+hyaluronic+acid+receptor+for+endocytosis+%28HARE%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Expression, processing, and glycosaminoglycan binding activity of the recombinant human 315-kDa hyaluronic acid receptor for endocytosis (HARE).</a> J. Biol. Chem. 282, 2785-2797 (2007).</li>
<li>Alkhouri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Combination+of+the+Pediatric+NAFLD+Fibrosis+Index+and+Enhanced+Liver+Fibrosis+Test+Identifies+Children+with+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">A Combination of the Pediatric NAFLD Fibrosis Index and Enhanced Liver Fibrosis Test Identifies Children with Fibrosis.</a> Clin. Gastroenterol. Hepatol. , (2010).</li>
<li>Huebert, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+liver+endothelial+cells%3A+a+cell+culture+model+for+studies+of+motility+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Immortalized liver endothelial cells: a cell culture model for studies of motility and angiogenesis.</a> Lab. Invest. 90, 1770-1781 (2010).</li>
<li>Zhou, B., Weigel, J. A., Fauss, L., Weigel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+hyaluronan+receptor+for+endocytosis+%28HARE%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of the hyaluronan receptor for endocytosis (HARE).</a> J. Biol. Chem. 275, [pii]- (2000).</li>
<li>Krause, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte-supported+serum-free+culture+of+rat+liver+sinusoidal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte-supported serum-free culture of rat liver sinusoidal endothelial cells.</a> J. Hepatol. 32, 718-726 (2000).</li>
<li>Esser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor+induces+endothelial+fenestrations+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor induces endothelial fenestrations in vitro.</a> J. Cell. Biol. 140, 947-959 (1998).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+isolated+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods. Cell. Biol. 13, 29-83 (1976).</li>
<li>Blomhoff, R., Berg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+cultivation+of+rat+liver+stellate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Isolation and cultivation of rat liver stellate cells.</a> Methods. Enzymol. 190, 58-71 (1990).</li>
<li>Harris, E. N., Baggenstoss, B. A., Weigel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+and+human+HARE%2Fstabilin-2+are+clearance+receptors+for+high-+and+low-molecular-weight+heparins%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rat and human HARE/stabilin-2 are clearance receptors for high- and low-molecular-weight heparins.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, G1191-G1199 (2009).</li>
<li>Karaa, A., Kamoun, W. S., Clemens, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+disrupts+nitric+oxide+synthase+activation+in+liver+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Free.+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress disrupts nitric oxide synthase activation in liver endothelial cells.</a> Free. Radic. Biol. Med. 39, 1320-1331 (2005).</li>
<li>Gustafson, S., Bjorkman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+hyaluronan%2C+chondroitin+sulphate+and+dextran+sulphate+bind+to+a+liver+receptor+that+does+not+recognize+heparin%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj.+J%22%5BJournal%5D)">Circulating hyaluronan, chondroitin sulphate and dextran sulphate bind to a liver receptor that does not recognize heparin.</a> Glycoconj. J. 14, 561-568 (1997).</li>
<li>Oie, C. I., Olsen, R., Smedsrod, B., Hansen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+sinusoidal+endothelial+cells+are+the+principal+site+for+elimination+of+unfractionated+heparin+from+the+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Liver sinusoidal endothelial cells are the principal site for elimination of unfractionated heparin from the circulation.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 294, 520-528 (2008).</li>
<li>Harris, E. N., Weigel, J. A., Weigel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+hyaluronan+receptor+for+endocytosis+%28HARE%2FStabilin-2%29+is+a+systemic+clearance+receptor+for+heparin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The human hyaluronan receptor for endocytosis (HARE/Stabilin-2) is a systemic clearance receptor for heparin.</a> J. Biol. Chem. 283, 17341-17350 (2008).</li>
<li>Knook, D. L., Sleyster, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+Kupffer+and+endothelial+cells+of+the+rat+liver+by+centrifugal+elutriation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Separation of Kupffer and endothelial cells of the rat liver by centrifugal elutriation.</a> Exp. Cell. Res. 99, 444-449 (1976).</li>
<li>Graupera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sinusoidal+endothelial+COX-1-derived+prostanoids+modulate+the+hepatic+vascular+tone+of+cirrhotic+rat+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sinusoidal endothelial COX-1-derived prostanoids modulate the hepatic vascular tone of cirrhotic rat livers.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 288, 763-770 (2005).</li>
<li>Yannariello-Brown, J., Zhou, B., Ritchie, D., Oka, J. A., Weigel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+ligand+blot+assay+detects+different+hyaluronan-binding+proteins+in+rat+liver+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">A novel ligand blot assay detects different hyaluronan-binding proteins in rat liver hepatocytes and sinusoidal endothelial cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 218, 314-319 (1996).</li>
<li>Duryee, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+is+a+cofactor+for+malondialdehyde-acetaldehyde+adduct-mediated+cytokine%2Fchemokine+release+by+rat+sinusoidal+liver+endothelial+and+Kupffer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide is a cofactor for malondialdehyde-acetaldehyde adduct-mediated cytokine/chemokine release by rat sinusoidal liver endothelial and Kupffer cells.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 28, 1931-1938 (2004).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

イソフルラン蒸気が無意識を誘導するハンギングドロップ法によるラットの麻酔は、私たちの研究のための好ましい方法である。気化器は、チャンバ外部に動物を維持するために綿で注射器の代わりに使用される場合がありますが、外科手術が非常に速くなる、これは必須ではありません。ポリエチレングリコールは、蒸気圧および蒸発速度を減少させるためにイソフルランに追加されます。あまりにも多くのイソフルラン蒸気は、早すぎる死を誘発する。肝臓は、カニューレを挿入し、TBS、肝臓におけるプーリングの血液5月の血栓をブランチングとコラゲナーゼと正弦波と消化の効率的な洗浄を防止する前に動物が死亡した場合。ヘパリンの添加は、抗凝固剤として有用かもしれないが、我々はプローブとして標識したヘパリンを使用するので、これらの研究では使用されません。 Geyの緩衝生理食塩溶液（GBSS）が頻繁にSECSの精製のために他の研究室で置換されている。それは、SECの精製、HEPのに便利ですが、atocytesは1-3 GBSSだけでなく、バ​​ッファを許容しないと生存率がほぼ高くありません。エンドサイトーシスを測定するとき、それは臓器で、肝細胞を精製でバックグラウンドレベルを測定することをお勧めします。 このメソッドは、コラゲナーゼによる肝灌流は、次のSECSの効率的な精製のための2つのうちの1つです。他の方法は、水簸の遠心分離19の代わりに、Percoll勾配による非実質細胞を分離する。パーコール勾配上の水簸を使用するための利点は、わずかに高い細胞生存率と数字です。欠点は、水簸の遠心分離は、特殊なローター、専用の遠心機、そして何万ドルものコストがかかる一緒に蠕動ポンプを必要とすることです。このメソッドは、多くの研究室で標準となっている冷蔵テーブルトップ遠心機と蠕動ポンプを使用する必要があります。 選択的接着によるSECSとKCSの分離は、標準的な方法です。20から22。それはSECSは、ガラスやプラスチックに付着することは確かですが、キーポイントは、37℃で15分間のインキュベーションを超えないで酸洗浄きれいなガラスを使用することです。℃、5％のCO 2。 KCSは、常にSECSより速く付着し、それは静かにゆるく付着して残りのSECSを抽出するためにメディアとKCSを洗うことをお勧めします。プロナーゼと他のプロテアーゼは、細胞の生存率を高めるためにこのプロトコルのコラゲナーゼ消化のステップから省略されています。プロテアーゼは細胞外受容体を消化し、最終精製工程における細胞接着を阻害する可能性があります。 ここで紹介する方法は、多種多様なアプリケーションを持っています。我々はヘパリンが最初にクリアランスのためにとられている最終的な結果を示していますが、初代肝細胞、KC、SECS、および造血幹細胞を得るための肝臓の灌流は、代謝経路、免疫調節、スカベンジャーの活動、および他を含む数多くの研究に役立つことがあります生理トゥディES。この手順の中で最も難しい部分は、門脈からカテーテルの滑りをしなくても良いカニュレーション、肝臓の消化、および肝臓の処理です。

<ul><li>バッファ1：142 mMのNaCl 6.7 mMのKCl、10mMのHEPES、1.5％BSA、pH7.4の</li><li>バッファ2（灌流緩衝液）：67.0 mMのNaCl、6.7 mMの塩化カリウム、4.8 mMのCaCl 2を - H2O、101.0 mMのHEPES、BSA 1.5％、pH7.4の。 </li><li>バッファ3：137 mMのNaCl、4.7 mMの塩化カリウム、0.7 mMのMgSO 4を 、1.2 mMのCaCl 2で - 2H 2 O、10mMのHEPES、1.5％BSA、pH7.4の</li><li> RPMI / BSA：RPMIで15グラム/ L BSA </li><li>トリス緩衝食塩水（TBS）：154 mMのNaCl、10mMのTrizmaベース塩。 </li><li>コラゲナーゼ：コラゲナーゼワーシントンからロシュからA（＃11088785103）、コラゲナーゼタイプI（＃LS004691）生化学的またはコラゲナーゼI（＃C0130）またはIA（＃C9891）Sigma - Aldrich社から。 </li></ul>すべての塩はSigma - Aldrich社からです。 <table border="1"><tbody><tr><td>の名前</td><td>会社</td><td>モデル/カタログ＃ </td><td>コメント</td></tr><tr><td> 20L水浴</td><td> ThermoFisher </td><td> 2231 </td><td>水は約45 ° Cの冷却を補正するためです。 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>チューブ内。 </td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>コー​​ル - パーマー</td><td> 7553〜70 </td><td> Masterflexシリーズ</td></tr><tr><td>冷凍遠心器</td><td>ソーバル</td><td>レジェンドXTR </td><td></td></tr><tr><td>カテーテル</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 381444 </td><td></td></tr><tr><td>デシケーター室</td><td>フィッシャー</td><td> 08595E </td><td>内部プレートを使用してください</td></tr><tr><td>パーコール</td><td>シグマ</td><td> P4937 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td> SeraCare </td><td> AP - 4510から01 </td><td></td></tr><tr><td> 100μmのメッシュ</td><td>スペクトラムラボ</td><td> 146488 </td><td></td></tr><tr><td> 30μmのメッシュ</td><td>スペクトラムラボ</td><td> 146506 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td>インビトロジェン</td><td> 21870 </td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール</td><td>スペクトラムラボの</td><td> PO107 </td><td></td></tr></tbody></table>

肝灌流による肝細胞の精製した生体肝エンドサイトーシスに

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

肝臓は哺乳類の体の代謝の中心であり、血液用のフィルタとして機能します。肝臓の基本的なアーキテクチャは、肝臓の質量の85％以上が肝細胞で構成されていると、細胞塊の残り15％はクッパー細胞（KCS）、星状細胞（HSC）で構成されている図1に示​​されている、と類洞内皮細胞（秒）。 SECSは、肝臓内の血管壁を形成し、細胞質の内fenestraの複数形と呼ばれる特殊な形態が含まれています。細胞質の開窓最もカイロミクロン、カイロミクロンレムナントと高分子のふるいとしてSECS行為そのため、細胞内の穴の外観（〜100μm程度）ではなく、細胞が、肝細胞および造血幹細胞に通過さ1（ 図1）。基底膜の欠如に起因する、SECSと肝細胞間のギャップは、Disseの空間を形成する。造血幹細胞は、このスペースを占有し、規制やiへの応答に重要な役割を果たすnjury、レチノイン酸と肝2の免疫調節の記憶。 SECSは、その細胞表面3上のスカベンジャー受容体の配列を表示する体の最もendocyticallyアクティブセルの一つです。これらは、SR - A、Stabilin - 1とStabilin - 2が含まれています。大きな粒子と細胞残渣がKCS 4で（貪食）エンドサイトーシスされ、一方、一般的に、バッファの段階で小さなコロイド粒子より小さい230 nmにおよび高分子は、SECSで取り上げられている。従って、このような血液からグリコサミノグリカンなどの細胞外物質のバルククリアランスは健康とSECS 5,6のエンドサイトーシスの機能に大きく依存している。例えば、血中ヒアルロン酸濃度の増加は軽度からより重症7までの範囲の肝疾患の指標である。 つのレポート8を除いて、存在には不死化SECの細胞株はありません。さえこの不死化細胞株は、非差別です。それは主要なSECS（私たちのデータは、図示せず）上に存在するスカベンジャー受容体を発現しないという点でated。すべての細胞生物学的な研究は、新鮮な動物から得られた初代培養細胞上で実行する必要があります。残念ながら、SECSは標準的な培養条件下で脱分化すると動物からの分離によって1〜2日以内に使用しなければなりません。 SECSの分化はStabilin - 2またはHARE受容体9の発現、CD31、および細胞質の開窓1の存在によってマークされています。 SECSの分化は、培地中のVEGFを添加することによりまたは肝細胞の馴化培地10,11の培養細胞による拡張することができます。 このレポートでは、我々はSEC固有Stabilin - 2受容体に対するヒアルロン酸のための無線標識ヘパリンを使用して無傷の器官でSECSのエンドサイトーシス活性を示すだろう。我々は、その後、エンドサイトーシスを測定するために灌流した肝臓から肝細胞とSECSを浄化します。

ない細胞株が存在しないと肝類洞内皮細胞（SECS）の研究は、動物から得られた初代培養細胞を使用して実行する必要があります。このメソッドは、その後の培養と実験のためのSECの浄化のための肝臓の消化および分画遠心法に依存しています。

肝臓は哺乳類における代謝の中心であり、血液のフィルターとしての役割を果たしています。肝臓の基本構造は、...に示されています。

本手順の全体的な目的は、肝細胞のエンドサイトーシス活性を評価し、続いてプラスチックディッシュで培養可能な生存した肝類洞内皮細胞の純粋な集団を単離することです。これは、生存動物の肝臓にカニューレを挿入して摘出後、生理食塩緩衝液で肝臓を洗浄して血液を除去することで達成されます。その後、肝細胞を標識リガンドに曝露させ、細胞内取り込みを行います。次のステップは、コラゲナーゼで肝臓を消化し、肝細胞の懸濁液を作成することです。次に、ペロール勾配を用いた差分遠心分離を行い、SECを星細胞、小型肝細胞、残存血液細胞、および細胞デブリから分離します。最終ステップでは、ガラスへの接着性を利用して、SECをクッパー細胞から分離します。最終的に、リガンドの取り込み能を評価したり、下流のアプリケーションのために培養したりすることが可能な、生存した精製済み LSEC が得られます。この手法は、肝内皮細胞の役割や血液中の高分子物質のクリアランス、あるいは肝損傷、脂肪肝、全身性炎症反応症候群（SIS）、線維症、老化などのさまざまな生理的条件下での反応など、肝生物学分野における重要な疑問を解明するのに役立ちます。不死化した他の肝細胞とは異なり、分化した肝類洞内皮細胞株は存在しません。したがって、これらの初代細胞は動物から直接誘導する必要があります。本日ご紹介する手順では、遠心分離や溶出といった大型機器を使用せずに、肝類洞内皮細胞を精製します。本手順では、短期間の培養を前提とした細胞の回収を行い、全工程において無菌操作は行いません。ただし、長期培養を行う場合は、無菌操作を行い、バイオセーフティキャビネットを使用してください。カテーテルの配置、縫合糸の締め付け具合、肝臓を切断せずに動物から摘出する方法、およびカテーテルの取り外しは非常に重要であるため、これらの手順を視覚的に提示することが不可欠です。コラゲナーゼを計量して氷上に置き、実験の準備をしてください。次に、TBSを温めて酸素を飽和させ、必要な器具を準備します。続いて、200 gのラットを選別し、イソフルランチャンバー内で深く麻酔します。腹側を70% ethanolで濡らし、麻酔状態であることを確認します。反応がない場合は、最善の結果を得るために、ハサミとピンセットを用いて腹腔を開いてください。以下の手順から肝臓の漂白までの操作は、数分で完了します。門脈を特定し、腸間膜枝の直上の静脈下に2か所縫合糸をかけます。次に、18ゲージのカテーテルを用いて静脈にカニューレを挿入します。カテーテルに装着された針を、糸のループから数ミリメートル先に進め、針を抜去します。その後、オーバーハンドノット（グラニートノットまたはスクエアノットとしても知られる）を2回結んで縫合糸を締め付けます。TBSを用いて、10分以内に肝臓から血液を洗い流してください。肝臓のフラッシング中に、主要動脈の1本を切断します。消化管と結合組織を切り離して、肝臓を摘出します。摘出した肝臓を、液体の再循環が可能な漏斗の上に置きますが、この時点では液体を50 millilitersまで再循環させないでください。小型ビーカーにRPMI培地を準備します。最終濃度が0.05% BSAおよび0.01 millicuriesの放射標識ヘパリン、またはその他の適切に標識されたリガンドになるように添加します。エンドサイトーシスを行う場合は、酸素供給ができるようにこのビーカーを装置に取り付けます。ポンプを停止し、流入チューブを切り替えた後、20 milliliters per minuteでポンプを再始動します。ラベル化されたRPMIが肝臓に到達しそうになったら、ポンプを停止し、ファンネルおよびチューブ内の余剰液を排出させます。ドレンチューブを培地ビーカーに入れ、ラベル化された培地を再循環できるようにしてから、ポンプを再始動します。液体を肝臓内で1時間以内に再循環させます。この内部移行ステップの間、肝臓をカバーして温度を安定させるとともに、リガンドのエンドサイトーシスを停止させるための消化用コラゲナーゼを準備してください。コラゲナーゼ消化に備え、TBSで肝臓を2分間再洗浄し、肝類洞内の未結合リガンドを除去します。TBSによる2分間の再灌流の間、あらかじめ計量したcollagenase Aをバッファー2に溶解させ、濃度を0.45 µMにします。肝臓の灌流後、直ちに溶液をろ過し、ポンプを停止して、collagenase Aを灌流するように流体を切り替えます。collagenase Aの投与後、最大数分間、同じ流速で再循環灌流を開始します。灌流後、カテーテルを取り除き、肝臓をディッシュに移します。ピンセットで肝被膜を剥離し、バッファー1の中で細胞を振り出します。液体が不透明になったら、細胞を100 µmのメッシュ、続いて30 µmのメッシュに通し、50 mLのコニカルチューブに回収します。室温にて、ディッシュにバッファー1を追加し、さらに肝細胞を機械的に分散させます。その後、それらをフィルターに移します。適度な振盪で細胞が剥離しなくなるまで、この工程を繰り返します。まず細胞を洗浄し、細胞が沈殿するまで150 ×gで遠心分離します。次に、非実質細胞を含む上清を氷上の50 mLコニカルチューブに移し、ペレットを40 mLの溶液で再懸濁します。バッファー1を使用します。バッファー3で洗浄工程を2回繰り返し、肝細胞が少なくとも97%含まれるペレットを作成し、95%以上の純度のS細胞集団を得ます。遠心分離機を用い、上清を4°Cで200×gで10分間遠心分離します。その後、液体を廃棄し、すべての細胞ペレットを4°CのR-P-M-I-B-S-A 5mLで再懸濁します。細胞を2本のチューブに分け、R-P-M-I-B-S-Aを加えて35 mLにします。次に、細胞を100 ×gで3分間遠心分離し、細胞を含む上清の上層25 mLを氷上の50 mLコニカルチューブに移します。その後、残りの10 mLの培地でペレットを再懸濁し、25 mLの冷 R-P-M-I-B-S-A溶液を加えます。洗浄ステップをもう一度繰り返し、S natinとsecsを含む回収液をさらに2回分採取します。次に、回収した上清を4°Cで10分間、200 ×gで遠心分離します。3本のコニカルチューブに、PBSで調製した25% per callを20 mLずつ満たします。それらを氷上に置き、各チューブに50% Percoll 15 mLを下層に敷いて密度勾配を作成します。細胞を合計30 mLのBSA含有RPMIで再懸濁し、それらを合わせてから、各勾配の上に合わせた細胞懸濁液を10 mLずつ慎重に重層します。密度勾配を4°Cで900 ×g、20分間遠心分離します。SECsおよびcofer細胞は25%と50%の界面に集まるため、上部から25%と50%の界面付近まで吸引します。これにより星状細胞が除去されます。次に、25%と50%の界面にある細胞を回収し、冷RPMIを用いて最終容量が約40 mLになるようにコニカルチューブに移します。これによりペリカル細胞を希釈します。SECsおよびfer細胞を4°Cで350 ×g、10分間遠心分離します。ペレットを、あらかじめ加温した無添加のRPMI 約10 millilitersで再懸濁します。懸濁液をペトリ皿または結晶化皿に移し、37 degrees Celsiusで15分間インキュベートします。インキュベーション後、皿を静かに撹拌し、上清中の細胞を回収します。クッパー細胞はガラスに付着します。また、これらの細胞は、修飾RPMI培地を用いてフィブロネクチン被覆プレートで培養することが可能です。ディッシュに付着した細胞と懸濁液に残った細胞から得られた細胞溶解物をSDS-PAGEで分離し、anti CD163抗体でプローブしました。CD163マーカーを含むクッパー細胞は、ガラスへの付着によりCCSから分離されました。ガラスに付着しなかった細胞は、フィブロネクチン被覆プラスチックの6ウェルディッシュに播種し、0.1% BSAおよびペニシリン・ストレプトマイシンを添加したRPMIを用いて一晩インキュベートしました。位相差顕微鏡に類似した観察下において、SECは生体内構造を彷彿とさせる非常に平坦な細胞質形態を示します。SEC分化のマーカーである、S Stalin two受容体の両方のアイソフォームに対するモノクローナル抗体を用いて、肝細胞溶解液および概説プロトコルに従って回収したSECを解析しました。予想通り、secsはstepin.Twoに対して陽性でした。先行実験では、ヘパリンのカルボキシ基にビオチンタグで標識したヘパリンを注入しました。二糖類は注入後30分間にヨウ素化ストレプトアビジンと結合しました。本手順において、標識ヘパリンを主として除去した臓器は肝臓でした。このビデオでは、標識ヘパリンの大部分がSECによって内部移行することを示します。肝細胞とは異なり、これらの内部移行イベントは、細胞が本来の状態にある完全な肝臓内で行われました。このビデオを視聴することで、生体動物から肝類洞内皮細胞を精製する方法について十分に理解できたはずです。肝類洞内皮細胞は培養下では非常に短期間で本来の特性を失うため、これらの細胞を24時間から48時間以内に使用することが重要です。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、肝細胞を単離する前にコラゲナーゼ溶液を使用して門脈をマウスの肝臓灌流する手順について説明しています。...

In vivoマウス肝灌流:門脈を介してげっ歯類の肝臓に溶液を注入する方法

ヒト肝細胞の単離のための修飾された二工程コラゲナーゼ灌流手順が記載されている。この方法はまた、他の哺乳動物の肝臓にも適用することができる。単離された肝細胞は、それらのような肝臓の再生、薬物動態および毒物学などの分野での科学的研究に適したモデル作り、高い収率および生存度で提供されています。...

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マウス初代肝細胞単離のための時間と労力の効率的なプロトコルの改善

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マウス眼の前房に移植された肝スフェロイドのin vivoイメージング

このプロトコールでは、ラットモデルにおける最適化された2ステップコラゲナーゼ肝灌流技術を示し、3Dオルガノイドの in vitro...

ラットの肝臓灌流と初代肝細胞の単離:最先端の3Dオルガノイド培養に不可欠な古い手順(英語)

学ぶ肝灌流による肝細胞の精製とエンドサイトーシス評価法。ラット肝臓から肝洞静脈内皮細胞を単離し、生体でのマクロ分子除去や肝疾患研究への応用を可能にする実験手法を解説します。

肝灌流による肝細胞の精製した生体肝エンドサイトーシスに

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