JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Essentials of
Neuroscience

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Arabic was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Clinical and Translational Medicine

تقييم الخلية الجذعية السرطانية الهجرة عن طريق أجهزة ميكروفلويديك Compartmentalizing والتصوير لايف الخليوي

*1,2, *3, 3, 1,2,3, 3,4

1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 2Materials Science Program, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Neurological Surgery, University of Wisconsin-Madison, 4Carbone Comprehensive Cancer Center and Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Wisconsin-Madison

* These authors contributed equally
Article
    Downloads Comments Metrics
     

    Summary

    ووصف الجهاز ميكروفلويديك compartmentalizing للتحقيق في الهجرة سرطان الخلايا الجذعية. هذه الرواية يخلق منصة قابلة للحياة المكروية الخلوية ويتيح التصور المجهرية للتنقل الخلية الحية. متحركة عالية يتم عزل الخلايا السرطانية لدراسة الآليات الجزيئية للتسلل العدوانية، مما قد يؤدي إلى المزيد من العلاجات الفعالة في المستقبل.

    Date Published: 12/23/2011, Issue 58; doi: 10.3791/3297

    Cite this Article

    Huang, Y., Agrawal, B., Clark, P. A., Williams, J. C., Kuo, J. S. Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging. J. Vis. Exp. (58), e3297, doi:10.3791/3297 (2011).

    Abstract

    في السنوات ال 40 الماضية، استثمرت الولايات المتحدة أكثر من 200 مليار دولار على أبحاث السرطان، مما أدى إلى انخفاض 5٪ فقط في معدل الوفيات. A عقبة رئيسية لتحسين نتائج المرضى هو سوء فهم الآليات الكامنة والهجرة الخلوية المرتبطة العدوانية ورم خبيث الخلايا السرطانية، ومقاومة الغزو العلاجية 1. ورم أرومي دبقي الأشكال (GBM)، الأكثر انتشارا الأولية الدماغ الكبار ورم خبيث تجسد هذه الصعوبة. على الرغم من مستوى الإشعاع والجراحة والكيميائي، وبقاء متوسط ​​المريض فقط خمسة عشر شهرا، وذلك بسبب تسلل إلى الدماغ عدوانية GBM المجاورة وتكرار سرطان السريع 2. تفاعلات الخلايا الشاذة آليات المهاجرة والمحتمل المكروية الورم التفريق السرطان من الخلايا الطبيعية 3. لذلك، وتحسين طرق علاجية لGBM تتطلب فهم أفضل لآليات الهجرة سرطان الخلية. العمل الحديثة تشير إلى ثاتا حيوانية صغيرة من الخلايا داخل GBM، قد ورم خلايا الدماغ الجذعية (أنظمة BTSC)، مسؤولة عن المقاومة العلاجية وتكرارها. الآليات الكامنة والقدرات المهاجرة أنظمة BTSC بدأت فقط ليكون 1،4 تتميز.

    وتقتصر بسبب وجود قيود في الفحص البصري والتلاعب هندسية، المقايسات الهجرة التقليدية من 5 إلى قياس السكان الخلية بشكل عام. في المقابل، تسمح أجهزة ميكروفلويديك واحد تحليل الخلية بسبب التوافق مع المجهري الحديثة والسيطرة على البيئة الصغرى 6-9.

    نقدم طريقة لتوصيف مفصل للهجرة أنظمة BTSC استخدام أجهزة ميكروفلويديك compartmentalizing. يلقي هذه الأجهزة من صنع PDMS البيئة وزراعة الأنسجة إلى ثلاث حجرات متصلة: بذر غرفة، غرفة استقبال وردم microchannels. قمنا بتصميم الجهاز بحيث مجلسي عقد سائل الإعلام كافية لدعم أنظمة BTSC قابلة للدا 4-5YS دون تبادل وسائل الاعلام. يتم عزل BTSCs كثيري التنقل قدم في البداية إلى غرفة البذر بعد الهجرة على الرغم من سد microchannels إلى الدائرة الموازية المستقبلة. هذه الهجرة يحاكي سرطان الخلوية من خلال انتشار المساحات فراغي من الدماغ. يتم تسجيل الصور الحية من مرحلة التشكل الخلية أثناء الترحيل على مدى عدة أيام. يمكن أن تكون أنظمة BTSC الكثيرة الارتحال بالتالي معزولة، recultured، ومزيد من التحليل.

    يمكن أن يكون على microfluidics Compartmentalizing منصة متعددة لدراسة سلوك المهاجرة من BTSCs وغيرها من الخلايا الجذعية السرطانية. من خلال الجمع بين مولدات الانحدار، التعامل مع السوائل، والأقطاب الكهربائية الدقيقة وحدات ميكروفلويديك أخرى، يمكن أيضا أن تستخدم هذه الأجهزة لفحص المخدرات وتشخيص الأمراض 6. سوف العزلة لحيوانية عدوانية من الخلايا المهاجرة تمكين دراسات الآليات الجزيئية الكامنة وراء.

    Protocol

    1. التفكك خلية في أنظمة BTSC

    وتستمد BTSCs من القائمة من قبل الثقافات التي تزرع في مصل خالية المتوسطة الجذعية الخلية كما neurospheres. وسبق وصفها ثقافة التي 10 و 11.

    1. إعداد تعليق خلية من أنظمة BTSC المستمدة neurospheres. يتم جمع المستمدة من أنظمة BTSC neurospheres في أنبوب مخروطي 15 مل وبالطرد المركزي عند 900 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. يمكن أسرع الطرد المركزي القص و / أو الضرر neurospheres. ويستنشق طاف ومعلق الثقافة neurosphere في 0.5 مل من قبل تحسنت Accutase. وحضنت هذا الحل لمدة 5-10 دقائق عند 37 درجة مئوية مما يتيح للneurospheres لتخفيف. تتعطل الخلايا ميكانيكيا مع 10-20 السكتات الدماغية لطيف من ماصة P100 ثم يضاف 1.5 مل من الخلايا الجذعية متوسطة إلى الخلايا لتحييد Accutase.
    2. وطرد بعد ذلك في 1300 دورة في الدقيقة BTSCs لمدة 5 دقائق، ومعلق في 1 مل من الخلايا الجذعية متوسطة.
    3. تتم إزالة A قسامة 50 ميكرولتر من suspensأيون، ووضع في أنبوب microcentrifuge لفرز الخلايا. يضاف 50 ميكرولتر من اللون الأزرق التريبان إلى أنبوب إيبندورف ويتم وضع التعليق في عدادة الكريات لفرز الخلايا.
    4. إذا لزم الأمر بعد فرز الخلايا، يتم إضافة إضافية المتوسطة الخلايا الجذعية إلى تعليق أنظمة BTSC لإعطاء كثافة الخلية من 20،000 الخلايا الحية / وسائل الإعلام ميكرولتر.

    2. تصنيع ثنائي الطبقات سو 8-الماجستير وطحن طابع PDMS (انظر الشكل 1)

    نستخدم الطباعة الحجرية الضوئية والطباعة الحجرية الناعمة لصنع سو-8 الماجستير وختم PDMS، التي تعتبر أساسية لتجميع الأجهزة ميكروفلويديك. مختلف قليلا من الإجراء العادي 12، ويتكون لدينا سو-8 ماجستير في طبقتين. ومسبوكة و microchannels 3-ميكرون طويل القامة في الطبقة الاولى / أسفل في وقت سابق من العملية، في حين أن 250-ميكرون طويل القامة البذر واستقبال غرف في الطبقة الثانية / العلوي. من أجل الاتصال الصحيح بين حجرات ثقافة اثنين (متناهيةق وغرف)، وطبقتين يجب أن تكون محاذاة بدقة في الموقف. ومع ذلك، سمك وغموض الطبقة الثانية هي كبيرة بما يكفي لمنع اليجنر الإيمانية / البصرية من الوصول إلى ميزات القاع. هنا نحن تصميم أقنعة يجري وضعه مع علامات إيمانية عن بعد. وهكذا، يمكن هذه العلامات في الطبقة الاولى محمية بشكل انتقائي في حين الغزل الطبقة الثانية. ونتيجة لذلك، يتم إجراء كل من طبقات من الميزات في واحدة رئيسية وجاهزة للتشكيل في النحت الغائر من الطابع PDMS.

    1. تصميم وإعداد الصور 2 الأقنعة. قناع واحد يتكون من اثنين من علامات إيمانية ومجموعة من microchannels (400 ميكرومتر طولا و 10-50 ميكرون) للطبقة الأولى. قناع آخر يتكون من البذر واستقبال غرف (2 مم طولا و 600 ميكرومتر) للطبقة الثانية. تم تصميم كل الأقنعة في Illustrator (أدوبي، كاليفورنيا)، ليزر طبع الأفلام على الشفافية (قطع معدنية رقيقة، كولورادو)، وتنظيفها مع الأيزوبروبانول والهواء المجفف.
    2. جعل الطبقة الأولى معسو-8 مقاومة للضوء (MicroChem، ماساتشوستس) وفقا لدليل المنتج من المورد. أولا، تدور معطف الرقاقة مقبض (مواد WRS، كاليفورنيا) مع 3-ميكرومتر سميكة مقاومة للضوء من SU-8 (5)، تليها الخبز لينة. ومقاومة للضوء فوق البنفسجي ومن ثم المعرضة للومملح مع قناع المقابلة على اتصال وثيق-، تليها مرحلة ما بعد الخبز والنامية.
    3. تدور معطف الطبقة الثانية مع 250 ميكرون سميكة SU-8 (2100). من أجل منع مقاومة للضوء سميكة من حظر علامات إيمانية من الطبقة الأولى، فإننا تغطية هذه المناطق مع لاصق شفاف في قبل طلاء تدور من الطبقة الثانية. ومقشر ثم إيقاف الشريط للكشف عن علامات لغرض المحاذاة.
    4. UV-فضح الطبقة الثانية مع قناع الثاني. مع علامات المحاذاة كشف، فإنه واضح ومباشر لمواءمتها لتلك الموجودة في الثانية باستخدام قناع اليجنر قناع البصرية. الطبقة الثانية من مقاوم الضوء فوق البنفسجية ومن ثم المعرضة للومملح على اتصال وثيق-، تليها مرحلة ما بعد الخبز والنامية. </ لى>
    5. مكافحة عصا معطف سيد نتجت عن ذلك. للمساعدة في إزالة PDMS الشفاء، يمكن silanized سو-8 الرئيسية عن طريق ترسيب البخار لجعل سطح طلاء نونستيك من نوع. ضع ببساطة إلى مجفف للمدة ساعة على الأقل، مع عدة قطرات من ثلاثي كلورو (1H، 1H، 2H، 2H-perfluorooctyl) حل سيلاني تحت الفراغ.
    6. العفن PDMS مع السيد. مزيج قاعدة سابق البلمرة وكيورير من Sylgard PDMS 184 (داو كورنينج، ميشيغان) في 10:01 نسبة بدقة. ضعها في مجفف التفريغ للفراغ حتى لا ينظر فقاعة الهواء. صب الخليط على القناع وديغا من جديد اذا ما قدم جديدة فقاعة الهواء. علاج العفن على موقد المستوى لمدة 2 ساعة في 90 C. بعد أن يبرد إلى درجة حرارة الغرفة، وإطلاق سراح بلطف الطابع PDMS. وهكذا، نقشت القنوات زراعة في PDMS وجاهزة للجمعية الجهاز. سيد هو قابل لإعادة الاستخدام لصب حتى يتم متصدع أو البالية. طلاء مضاد للعصا يحتاج إلى أن يقوم مرة أخرى عندما يستعيد الحساسية.

    3.جمعية ميكروفلويديك الأجهزة وزراعة الخلية (الشكل 2)

    من أجل ثقافة الخلايا، يتم إرفاق ميزة ختم محفور PDMS ساترة لزجاج لتشكيل قنوات المغلقة. يتم إنشاء مداخل ومنافذ لتحميل ثقافة / وسائل الإعلام. وفي الوقت نفسه، تنظيف وغيرها من الإجراءات لالركيزة الزجاج وختم PDMS ضرورية لضمان التوافق مع الخلية.

    1. جعل الخزانات من خلال الطابع PDMS باستخدام الخزعة الناخس حفرة. نختار قطر على أن تكون 6 مم. هذه الخزانات خدمة لغرضين. واحد هو اجراء اضافي المغذيات لنمو الخلايا. والآخر هو وصول لتحميل ماصة والشفط.
    2. نقع الطابع PDMS في 70٪ من الإيثانول لمدة 30 دقيقة ثم يشطف ومع غير المتأينة المياه لمدة 10 دقيقة. والغرض من ذلك هو لمسح مخلفات العضوية المحتملة قدم خلال عملية تصنيع، وuncrosslinked PDMS التلوث. عمليات التنظيف أكثر كثافة وشاملة مثل استخراج العضوية 13 14 في مكان آخر. ومع ذلك، وجدنا أنه لا لزوم لها في الثقافة أنظمة BTSC.
    3. تعقيم الطابع PDMS باستخدام الأوتوكلاف (121 ° C، 35 دقيقة). اكتمال هذه الخطوة المزيد من التفاعل تشعبي من PDMS. بدءا من هذه الخطوة والخطوة حتى 3.6، وتتخذ جميع الإجراءات بطريقة عقيمة.
    4. ثم وضعت الطابع PDMS ساترة على الزجاج، والذي سبق المغلفة مع البولي-L-يسين 15-17 الجهاز وهي مغلفة ثم مع laminin عن طريق ملء القناة مع الحل بين عشية وضحاها في 37 laminin ° C. ويستنشق Laminin من الجهاز ويتم غسل الجهاز مع الخلايا الجذعية متوسطة.
    5. تحميل التعليق الخلية من الخطوة 1 إلى خزانات وقنوات. يتم وضع 11 ميكرولتر من الخلايا في فصل البذر خزان واحد. يستخدم الشفط لإجبار الخلايا في غرفة البذر، إذا لزم الأمر. يتم وضع مبلغ إضافي بمقدار 7 ميكرولتر من الخلايا الخزان بذر المجاورة. ملاحظة: متوسط ​​كثافة الخلية هو 20،000 خلية / ميكرولتر وسائل الإعلام. الخلفوغمرت المياه إيه خمس دقائق، والبذر والخزانات تلقي مع وسائل الإعلام.
    6. وضع 0،5-1 ملم ورقة PDMS قبل تعقيمها على القمة. فإن التصاق سطح طبيعيا وقعت بين قطع PDMS اثنان صنع ثقافة الخلية مختومة وجاهزة للحضانة والنقل والتصوير المجهري.

    4. على المدى الطويل الوقت الفاصل بين التصوير للهجرة مع أنظمة BTSC IM BioStation (نيكون أدوات المؤتمر الوطني العراقي، ميلفيل، الولايات المتحدة الأمريكية).

    الجمع بين الكاميرا، والبرمجيات، وجميع الحاضنة في صندوق واحد، وهذا النظام المجهرية يجعل من الممكن زراعة الخلايا صورة مع أي اضطراب لعدة أيام. وبالإضافة إلى ذلك، تصميمه الفريد للسيارات تتحرك العدسة الهدف ويبقي المرحلة عينة ثابتة في ميزة نقطة الزائر. وهذا يجعل من عملية لتجارب صورة موازية ومسار تنقل الخلية في مقايسة عالية الإنتاجية.

    1. قبل أن تتوازن IM Biostation لمدة 45 دقيقة لتحقيق الاستقرار في درجة الحرارة العرض، والرطوبة والهواء. إضافة العديد من المقاولات في المياهيتم استخدام الأطباق ained في حجرة العينة للحفاظ على الرطوبة المناسبة.
    2. تحميل الجهاز الخلوي الواردة في حجرة العينة من المجهر، وذلك باستخدام ملاقط مركز الجزئي.
    3. تعيين التركيز، ضع نقاط والوقت في برنامج نقاط Biostation وبدء مرور الزمن.

    5. ممثل النتائج:

    ويوضح أمثلة من الفحص البصري وتوصيف الهجرة الخلايا السرطانية باستخدام جهاز ميكروفلويديك compartmentalizing في الشكل 3 والشكل 4. الخلية الخط هو أنظمة BTSC. مع الإعداد الحالية لدينا، يمكن الصور من مرحلة زراعة الخلايا سجلت بشكل مستمر لطالما 5 أيام (الشكل 3) ومتكررة، وكما في كل ثانية 2 (الشكل 4). إلى ما بعد 5 أيام، وسائل الإعلام الثقافة تحتاج إلى استبدال لتجديد المغذيات والنفايات إزالتها. لدينا على المدى الطويل ويحدد الوقت الفاصل بين الدوار سلسلة من المراحل الخلية الستة خلال الهجرة التي تقوم على التغييرات الشكلية. كما illustrated في الشكل 3، ونحن يصفونها بأنها (ط) قبل الهجرة، (الثاني) بدء، (ثالثا) مسار الاستكشاف، (الرابع) المبحرة، (V) الوجهة-exloration و(السادس) آخر بالهجرة. في غرفة الاستقبال، المغزل على شكل خلايا البقاء في مرحلة (ط) كما هو الحال في معظم الأورام التي تكون قادرة على النمو، وتقسيم الهجرة تدريجيا. لأنها تقترب من مدخل متناهية، بضع خلايا في المضي قدما إلى المرحلة (الثانية) عندما توسيع وتوليد بروز لاصقة. واحد منهم فقط قادرة على احتلال مدخل والشروع في مرحلة (الثالث)، والتي يمكن استكشاف اتجاه الهجرة. مرة واحدة الخلية يحدد اتجاه الهجرة، تشرع في المرحلة (IV) لكروز من خلال متناهية في سرعة ثابتة وعالية، والتي يتم من خلال متناهية بأكمله. في نهاية العائدات، متناهية الخلية إلى مرحلة (V) لاستكشاف الفضاء المفتوح من تلقي غرفة، وبعد ذلك إلى مرحلة (السادس). في متناهية، يتم إنشاء معظمها من قبل السلطة المهاجرة blebbing النشاط كما هو موضح في الشكل 4، مماثلة لتلك التي سل amoeboidلتر. وتسجل بشكل كامل blebbing الخلايا وتشوه الغشاء هنا.

    الشكل 1
    الشكل 1. من نوعي Schematics تصنيع جهاز ميكروفلويديك. يتم تنفيذ العملية برمتها على رقاقة السيليكون مقبض 3-بوصة من خلال تقنية معدلة من الطباعة الحجرية الناعمة. مصنوعة 3-ميكرون طويل القامة وعلامات المحاذاة microchannels كما هو الحال في الطبقة الأولى. ثم 250-ميكرومتر سميكة سو-8 هو تدور المغلفة، في حين تتم تغطية علامات المواءمة مع لاصق شفاف، بحيث يمكن الوصول إليها في وقت لاحق يمكن أن يكون لإخفاء اليجنر دون عرقلة من قبل البصر مقاومة للضوء سميكة. وبالتالي، يمكن إجراء الميزات غرفة والطبقة الثانية والانحياز بدقة إلى الطبقة الأولى. ومصبوب في نهاية المطاف قبالة PDMS ختم سيد الناتجة عن ذلك.

    الشكل 2
    الشكل 2. نوعي Schematics التجمع الجهاز وعملية البذر الخلية. محاطة PDMS وGLساترة الحمار، وتتكون مساحة زراعة 3D الخزانات وغرف وmicrochannels. يتم تعبئة الغرفة مع بذر زراعة الخلايا، في حين يتم تعبئة في البداية غرفة استقبال مع الخلية خالية من وسائل الإعلام. و microchannels التي تربط بينهما درب خلية تقديم المهاجرة من الجانب البذر إلى تلقي الجانب.

    الشكل 3
    الرقم الهجرة أنظمة BTSC 3. من خلال متناهية. العلوي: لقطات من مرور الزمن تظهر خلية واحدة (تمييز باللون الأخضر) يهاجر أكثر من 400 ميكرون من الجانب إلى الجانب بذر المستقبلة. رحلة بأكملها يستغرق حوالي 2 أيام، تشمل سلسلة من التغيرات المورفولوجية الخلية. شريط النطاق هو 40 ميكرومتر. خفض: أ كارتون تمثيل مراحل الهجرة الستة. قبل الهجرة (ط): في غرفة البذر، وخلايا المغزل على شكل ويمكن تقسيمها على طول ترحيل تدريجيا بعضها البعض. الخلايا بالقرب من مدخل سباق متناهية مع بعضها البعض من خلال استقطاب خلايا الجسم والبريد xerting أقدام صفاحية بروز. بدء (الثاني): هي الخلية المهاجرة وفقا لأعلى قدرة تحتل مدخل قناة منافسيها في حين سوف تتراجع. استكشاف مسار (الثالث): إن التغيرات الخلايا المهاجرة إلى وضع amoeboid مع الأقطاب قليلا. هذا الوضع هو الهجرة متحركة للغاية وقادرة على استكشاف الطريق في كل الاتجاهات من قبل blebbing نتوءات صغيرة الغشاء. المبحرة (الرابع): مرة واحدة يتم تحديد مسار الهجرة، وتحول الخلايا إلى وضع amoeboid تكييفها من خلال المحافظة على بروز إضافية كبيرة تتجه إلى الأمام. بهذه الطريقة، خلية حركية عالية وتتمسك فضلا عن اتجاه ثابت والسرعة. المقصد الاستكشاف (الخامس): عند نهاية الطريق، الخلية يبطئ تطور وfilopodias لاستكشاف غرفة للاستقبال أي هدف الغزو. بعد الهجرة (السادس): بعد دخول غرفة الاستقبال، يتحول إلى خلية على شكل نجوم ويحتفظ الحركة عالية ولكن بدون اتجاه وتحديدها.

    "/>
    . الشكل 4 لقطات من مرور الزمن تظهر دائرة النشاط blebbing وتشوه الغشاء من أنظمة BTSC: (AB). بدء، (BD). التوسع؛ (DF). تراجع. الأسهم ومنحنى خطوط تمثل اتجاه وموقع تشوه الغشاء، على التوالي. يتم جمع كل 8 ثوان لقطات.

    Discussion

    الجهاز ميكروفلويديك وتقنية لتسجيل الصورة المعروضة هنا يمكن توصيف البصرية من التشكل الخلوي أثناء الهجرة. مقارنة بالطرق التقليدية القائمة، ومنصة ميكروفلويديك يضم مزايا الفعالية من حيث التكلفة، وإنتاجية عالية المرونة التصميم. وقدم نظام يسمح التصور المجهرية دراسة وتسجيل على المدى الطويل الهجرة الخلية الحية. ميزة العدسة آلية يجعل من الممكن تتبع مسارات الهجرة متعددة في صورة عالية الدقة دون إزعاج العينة.

    خلال تجميع الجهاز، الطابع PDMS هو غير دائم المستعبدين إلى ساترة الزجاج لتوفير الراحة للطلاء PDL (الخطوة 3.4). فمن الأهمية بمكان لتحقيق ختم جيدة لنجاح هذا البروتوكول. يمكن عرض التلوث من تصنيع الجهاز، مثل فقاعة الهواء في الطابع أو الغبار / الحطام على الركيزة، ويعرض للخطر نتيجة الترابط في السائل تسرب. ولذلك، treatiنانوغرام الجهاز بطريقة خالية من الغبار المهم لمنع فشل الجهاز. قبل طلاء PDL، وcoverslips الزجاج هي حمض النيتريك المعالجة ويتم طرد الحل للقضاء على الغبار PDL / الحطام. نجد لاصق شفاف، والكحول شطف، وحمام الماء مفيدة جدا في إزالة الغبار / الحطام من الطابع PDMS، إذا كان غرفة نظيفة لا يمكن الوصول إليه. بعد ختم PDMS إجراء اتصالات مع ساترة الزجاج، والتنصت على الطابع بلطف مع ملاقط يسهل الختم.

    يمكن إثراء BTSCs من العينات البشرية عبر غرفة العمليات في مجال الثقافة المتوسطة الخلايا الجذعية، على غرار ثقافة طبيعية الخلايا الجذعية العصبية 10. BTSCs المخصب بهذه الطريقة تظهر الخلايا الجذعية مثل الخصائص، مثل التعبير عن علامات الخلايا الجذعية (CD133، nestin)، والتمايز لالأنساب العصبية متعددة (الدبقية والخلايا العصبية)، وبدء الورم في الفأر نموذج العوز المناعي مثلي مع عدد قليل إلى 100 الخلايا 18. على الرغم من وجود بعض الجدل حول purifiالموجبة وصيانة BTSCs 1، 19-21، المجال نابعة من الحفاظ على أفضل BTSCs النمط الظاهري والنمط الوراثي للورم الوالدين 22-24.

    مساحة التجزئة يحاكي البيئة الفسيولوجية للهجرة الخلية. في الجهاز لدينا، أنظمة BTSC يحمل قدرة قوية للهجرة من خلال الفضاء حجم مقيدة من خلال تنظيم مورفولوجيا الخلوية. لدينا توصيف التغيرات المورفولوجية الخلية يشير الوضع التحولات في تسلسل مرحلة الستة التي قد تصميم نموذج لأمكن وصف مفصل جديد من الغزو أنظمة BTSC من الدماغ المجاورة. في المراحل المبكرة، والخلايا الحصول على كمية كبيرة من الاستقطاب وتوليد نتوءات لاصقة لترسيخ أنفسهم بفعالية داخل متناهية. بعد أن يتم تأسيس خلية في إشغال متناهية، فإنه يتحول إلى وضع المبحرة ويحافظ على هذا الوضع طوال الرحلة من خلال متناهية. في هذه المرحلة، الحفاظ على أنظمة BTSC الحركة عالية ومتسقة الاتجاه ولكن الحفاظ على الطاقة. فيterestingly، يبدو أن يقتصر 1 إلى الخلية متناهية المبحرة في وقت واحد، مثل ما يحدث من خلية واحدة إلى حصيلة هذه المرحلة، وغيرها من الخلايا متناهية تراجع عن. هذه الآلية تضمن المرجح فعالية الورم ويمنع نشر الإفراط في المواد الغذائية في متناهية. بعد الانتهاء من الهجرة عبر متناهية، خلية يستعيد نزوعها للنتوءات متعددة الاتجاهات والأهداف لمواصلة استكشاف مسارات الهجرة أو الغزو الجديد. الجهاز ميكروفلويديك compartmentalizing يقدم رواية في المختبر يعني إنشاء المكروية لدراسة أنظمة BTSC من تسلل حمة الدماغ.

    يمكن بسهولة أن تتكيف هذه الطريقة لدراسة الخلايا الجذعية السرطانية (CSC) وخطوط الخلايا المهاجرة المستمدة من أنواع الأورام الأخرى. لا يمكن أن يؤديها الخلايا زراعة في الجهاز ميكروفلويديك في أي مختبر البيولوجيا الحديثة التي تم تجهيز مع حاضنة والأنسجة الخبرة الثقافة. مجهزة على درجة الماجستير سو 8-، PDMSالصب والتجمع الجهاز قابلة للتنفيذ مع بعض التدريب الأساسية في الطباعة الحجرية الناعمة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن تمتد هذه المنصة لتطبيقات أخرى مع دمج وحدات وظيفية أخرى مثل خلاط الانحدار، الزخرفة السطح، ومراقبة السوائل ومسرى مكروي.

    Disclosures

    الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

    Acknowledgements

    ويدعم جزئيا من منحة PAC T32 NIH لجامعة ولاية ويسكونسن خلية الجذعية برنامج التدريب (PA كلارك). وأيد جزئيا من قبل JSK الأستاذية الدماغ HEADRUSH بحوث الاورام روجر Loff التذكارية صندوق البحث GBM، ومؤسسة UW / البحث جراحة المخ والأعصاب واستئصال ورم من الدماغ صندوق التعليم. ويدعم جزئيا JCW وYH من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح NIBIB 1R01EB009103-01.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM), high glucose GIBCO, by Life Technologies 11965 Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
    Ham’s F12 GIBCO, by Life Technologies 31765 Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
    B27 supplement minus vitamin A GIBCO, by Life Technologies 12587-010 Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
    Antibiotic-Antimycotic (PSA) GIBCO, by Life Technologies 15240 Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
    Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant GIBCO, by Life Technologies PHG0313 Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
    basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) , human recombinant GIBCO, by Life Technologies PHG0021 Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
    Heparin sodium salt, from porcine intestinal mucosa Sigma-Aldrich H1027-250KU Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
    Laminin (natural mouse) GIBCO, by Life Technologies 23017-015 Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
    Accutase EMD Millipore SCR005 Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
    Stem cell medium
    • 30 % Hams F12
    • 70% DMEM
    • 1% antibiotic-antimycotic
    • 2% B27 without vitamin A
    • EGF (20 ng/mL) and bFGF/heparin (20 ng/mL bFGF, 5 mg/ml heparin) Mix ingredients and sterile filter before use
    Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)/ Heparin
    • Aliquot concentration 20 μg/ml
    • For 25 μg: Add 1.25 mL of 5mg/mL Heparin to 25 μg bFGF.
    • For 250 μg: Add 1 mL 5mg/mL Heparin to 250 μg bFGF. Transfer to 15 mL conical and add 11.5 mL 5 mg/mL Heparin to conical.
    • Store as 50 μl or 250 μl aliquots at -80°C.
    Epidermal Growth Factor (EGF)
    • Aliquot concentration 20 μg/ml
    • For 200 μg: Add 1 mL sterile DMEM (Gibco 11965-118) to 200 μg EGF. Transfer to 15 mL conical and add 9 mL DMEM.
    • For 500 μg: Add 1 mL sterile DMEM (Gibco 11965-118) to 200 μg EGF. Transfer to 50 mL conical and add 24 mL DMEM.
    • Store as 50 μl or 250 μl aliquots at -80°C.
    Heparin
    • Aliquot concentration 5 mg/ml
    • Weigh out 100 mg heparin.
    • Add 100 mg heparin to 20 mL (70%)DMEM-(30%)F12-(1%)PSA (14 mL DMEM, 6 mL F12, 200 μL PSA)
    • Sterile filter
    • Store as 50 μl or 250 μl aliquots at -80°C
    su-8 photoresist MicroChem Corp.
    Silicon handle wafer WRS Materials 3P01-5SSP-INV
    trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma-Aldrich 448931
    PDMS Sylgard 184 Dow Corning
    laminin BD Biosciences 50 μg/ml in PBS buffer for the final concentration
    Biostation IM Nikon Instruments

    References

    1. Carke, M.F., et al. Cancer Stem Cells-Perspectives on Current Status and Future Directions: AACR Workshop on Cancer Stem Cells. Cancer Research. 66, 9339-9344 (2006).
    2. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352, 987-996 (2005).
    3. Sahai, E. Mechanisms of cancer cell invasion. Current Opinion in Genetics & Development. 15, 87-96 (2005).
    4. Shackleton, M., Quintana, E., Fearon, E.R., & Morrison, S.J. Heterogeneity in Cancer: Cancer Stem Cells versus Clonal Evolution. Cell. 138, 822-829 (2009).
    5. Karnoub, A.E., et al. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis. Nature. 449, 557-U4 (2007).
    6. Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J.S., & Williams, J.C. Microfluidics-based Devices: New Tools for Studying Cancer and Cancer Stem Cell Migration. Biomicrofluidics. 5, ASAP (2011).
    7. Rolli, C.G., Seufferlein, T., Kemkemer, R., & Spatz, J.P. Impact of Tumor Cell Cytoskeleton Organization on Invasiveness and Migration: A Microchannel-Based Approach. Plos One. 5, - (2010).
    8. Chung, S., et al. Cell migration into scaffolds under co-culture conditions in a microfluidic platform. Lab on a Chip. 9, 269-275 (2009).
    9. Irimia, D. & Toner, M. Spontaneous migration of cancer cells under conditions of mechanical confinement. Integrative Biology. 1, 506-512 (2009).
    10. Svendsen, C.N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. Journal of Neuroscience Methods. 85, 141-152 (1998).
    11. Clark, P.A., et al. Glioblastoma cancer stem cells exhibit decreased dependence on exogenous growth factors for proliferation and survival. submitted.
    12. Xia, Y.N. & Whitesides, G.M. Soft lithography. Angewandte Chemie-International Edition. 37, 551-575 (1998).
    13. Millet, L.J., Stewart, M.E., Sweedler, J.V., Nuzzo, R.G., & Gillette, M.U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab on a Chip. 7, 987-994 (2007).
    14. Regehr, K.J., et al. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab on a Chip. 9, 2132-2139 (2009).
    15. Dent, E. W., et al. Filopodia are required for cortical neurite initiation. Nature Cell Biology. 9, 1347-U28 (2007).
    16. Hu, X. D., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., & Dent, E. W. Activity-Dependent Dynamic Microtubule Invasion of Dendritic Spines. Journal of Neuroscience. 28, 13094-13105 (2008).
    17. Vitzthum, L., et al. Study of Na(+)/H(+) exchange-mediated pH(i) regulations in neuronal soma and neurites in compartmentalized microfluidic devices. Integrative Biology. 2, 58-64 (2010).
    18. Clark, P.A., Treisman, D.M., Ebben, J., & Kuo, J. S. Developmental signaling pathways in brain tumor-derived stem-like cells. Developmental Dynamics. 236, 3297-3308 (2007).
    19. Chen, R.H., et al. A Hierarchy of Self-Renewing Tumor-Initiating Cell Types in Glioblastoma. Cancer Cell. 17, 362-375 (2010).
    20. Pollard, S.M., et al., Glioma Stem Cell Lines Expanded in Adherent Culture Have Tumor-Specific Phenotypes and Are Suitable for Chemical and Genetic Screens. Cell Stem Cell. 4, 568-580 (2009).
    21. Lobo, N.A., Shimono, Y., Qian, D., & Clarke, M.F. The biology of cancer stem cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 675-699 (2007).
    22. Singh, S.K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
    23. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).
    24. Galli, R., et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Research. 64, 7011-7021 (2004).

    Comments

    1 Comment

    Very elegant, esthetically pleasing and potentially powerful method you have. Would you be able to test the hypothesis that the simple and old psychiatric medicine risperidone inhibits GBM cell migration? Kast RE. Glioblastoma chemotherapy adjunct via potent serotonin receptor-7 inhibition using currently marketed high-affinity antipsychotic medicines. Br J Pharmacol. ²010 Oct;161(3):481-7. Review. PubMed PMID: ²0880389; PubMed Central PMCID: PMC²990148.

    Reply

    Posted by: AnonymousJanuary 9, 2012, 7:04 PM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter