Name: パーキンソン病における神経ペプチドのMALDIイメージングマススペクトロメトリー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 57 s
Description: 学ぶMALDIイメージングマススペクトロメトリーによるラット脳内神経ペプチドの空間分布解析法。L-DOPA誘発ジスキネジアにおけるオピオイドペプチド変化を可視化し、パーキンソン病治療の理解を深める技術です。

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私たちは貴重な入力については、図3と教授ジョナス伝のためにデータを提供するためハンナワーナーに感謝します。スウェーデンの研究評議会（グラント522-2006-6416（MA）、521-2007-5407（MA）、オーケウイバーグ財団（MA、JH）、スウェーデン王立科学アカ​​デミー（MA、JH）と、スウェーデンの化学社会（JH）は感謝して財政支援のために承認されています。

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著者らは、開示することは何もありません。

神経ペプチドの研究ではMALDIイメージング質量分析を用いることのいくつかの利点があります。 MSデータの公平な分析は、特定の脳核を明らかにするか、線条体の背の部分は特定の病態生理学的状態に関連付けられているところここでしか示された結果のようにすることができます。空間情報を保持することにより、全体の脳切片の解析やペプチド抽出物を従来のペプチドミクス研究を使用した場合に比べて高い感度と低い変動と統計分析を実行するために関心領域を再定義することが可能である。また、MALDI IMSが容易に未知の翻訳後修飾を検出することができます実現するために重要であるが、構造解析では、変更された正確なアミノ酸の位置を決定するために従わなければなりません。 MALDI IMSデータを可視化する一般的な落とし穴がBLから線形光学スケールの最大ピーク強度のマッピングを含む代わりに、100％すべてのセクションの最大ピーク強度である共通の絶対的なスケールに、すべてのセクションをマッピングの実験シリーズ内の各セクション（図3）の色（100％）（0％）、ACK（図5） 。後者の方法は、グループデータと治療群間差の可視化の比較が可能になります。 MALDI IMS分析の主要な障害は、特定の質量ピークのペプチドの割り当てです。上の組織タンデム質量分析法は、可能な場合もありますが、多くの場合、13,14は非常に困難証明しています。我々は、逆相LC-MS/MSに続いて強陽イオン交換クロマトグラフィーで分取画など、多くの伝統的なアプローチが成功したシーケンスの多くの神経ペプチド、特にオピオイドペプチドに使用することができることがわかります。それはまだそのようなマスコットとして一般的な検索エンジンを使用して、任意のデータベースのエントリと一致しない良質のMS / MSスペクトルを取得することも珍しくありません。これらのケースでは手動でのde novoシーケンシングは、ONLです。yオプション。ピーク身元の最終的な証拠は、適切なノックアウトマウスからの組織切片のMALDI IMSすることによって得ることができる、しかし、これは常に可能か可能ではありません。代わりに、西部のイムノブロッティングや免疫組織化学によって、例えば、直径方向に異なる方法で結果を検証することです。これは多くの場合、抗体と新しい抗体を検証する作業のかなりの量を高めることを含めることができます。 このプロトコルで提示一般的な戦略は、いくつかのセクションに、実験条件を含む大規模な神経ペプチドMALDI IMS実験のために最適化されています。痛みのメカニズムと依存症の薬物に対する内因性の応答を含む研究の多様な分野で採用されるようにプロトコルは、特にオピオイドペプチドのために最適化されており、今後の研究に大きな影響を与えます。

1.1サンプルの収集と準備<ol><li>イソフルラン（Apoteksbolaget AB、スウェーデン） </li><li>手術ツール、はさみの2ペア、骨鉗子、へら</li><li>細かく粉砕ドライアイス</li><li>ストレージ用のアルミ箔とビニール袋</li><li>クライオスタット（マイクロモル、ハイデルベルク、ドイツ） </li><li>インジウム - スズ酸化物（ITO）でコーティングされたMALDIスライド（ブルカーダルト、ドイツ） </li><li>最適な切削温度媒体（OCT）（サクラファインテックヨーロッパ、オランダ） </li><li>真空デシケーター</li></ol> 1.2マトリックスアプリケーション<ol><li>のアセトニトリル（ACN）、メタノール（MeOH）、エタノール（EtOH）プロ分析グレード（メルク、ドイツ）。 </li><li>トリフルオロ酢酸（TFA）（シグマアルドリッチ、セントルイス、MO）。 </li><li>水のMilli-Q精製システム（ミリポア、ベッドフォード、MA）で精製した。 </li><li> CHIP-1000（島津製作所、日本）またはPortrait 630スポッター（LabCyte、サニーベール、カリフォルニア州） </li></ol> 1.3質量分析<ol><li> ULtraflex II（ブルカーダルト） </li><li> FlexImagingソフトウェア（V 2.0、ダルトニクス） </li><li>ペプチドまたはタンパク質校正標準（ブルカーダルト） </li></ol> 1.4データ処理<ol><li>原点v.8.1（OriginLabの社、Norhampton、MA） </li><li> Matlabのバージョン7.9.0.529（MathWorks社、ネーティック、マサチューセッツ州） </li><li> pBin（ <a href="http://www.vicc.org/biostatistics/software.php" target="_blank">http://www.vicc.org/biostatistics/software.php</a> ） </li></ol> 1.5ニューロ識別<ol><li>超音波超音波</li><li> 10kDaの分子量カットオフフィルター（ミリポア、ベッドフォード、MA） </li><li> SPセファデックスC 25ゲル（​​Sigma社、ドイツ） </li><li> Hypersilカラム（サーモフィッシャー） </li><li>ピリジン、プロの分析グレードのギ酸（FA）、アセトニトリル（ACN）、メタノール（MeOH）、エタノール（EtOH）（メルク、ドイツ）。 </li><li>トリフルオロ酢酸（TFA）、シグマアルドリッチ（セントルイス、MO、米国）。 </li><li> Agilent 1100シリーズナノフローLC、microWPS、C18カラム（0.075x150mm） </li><li> Agilent 1100シリーズマイクロfractioncollector、Prespotted anchorchipターゲットプレート（ブルカーダルト） </li><li> BioToolsソフトウェア（バージョン3.1 SR2、ダルトニクス） </li><li>バイオワークスソフトウェア（V.3.3、サーモフィッシャー。 <a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank">www.thermoscientific.com</a> ） </li><li>マスコットソフトウェア（V 2.2、MatrixScience。 <a href="http://www.matrixscience.com" target="_blank">www.matrixscience.com</a> ） </li><li> Swepepデータベース（ <a href="http://www.swepep.org" target="_blank">www.swepep.org</a> ） </li></ol>

パーキンソン病における神経ペプチドのmaldiイメージングマススペクトロメトリー

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease

MALDIイメージングマススペクトロメトリー（IMS）は、生体組織サンプル2（図1）の分子種の空間分析を容易にする強力なアプローチです。 12μmの薄い組織切片は、通常、MALDI TOF / TOF質量分析計を用いて、質量分析器で検出することができ無傷のペプチドおよびタンパク質の脱離とイオン化を容易にするMALDIマトリックスで覆われています。一般的にはピークの何百ものは、単一のラット脳組織切片で評価することができる。一般的に使用されるイメージング技術とは対照的に、このアプローチは、目的の分子の事前知識を必要とせず、高い分子特異性と感度2を維持しながら、複数の分子種の教師と包括的な分析が可能になります。ここでは、動物モデル、パーキンソン病（PD）のラット脳内の神経ペプチドの地域に固有のディストリビューションプロファイルを解明するためのMALDI IMSベースのアプローチを説明します。 PDは、年齢3,4の65歳以上の人々のための1％の有病率が一般的な神経変性疾患である。最も一般的な対症療法は、L-DOPA 5を使用してドーパミンの交換に基づいています。ただし、これは不随意異常な動き、と呼ばれるL-DOPA誘発ジスキネジア（LID）1,3,6を含む重篤な副作用が付属しています。 LIDの中で最も著名な分子変化の一つは、オピオイド前駆prodynorphin mRNAの7のレギュレーションです。ダイノルフィンペプチドは本質的に移動制御7,8に関与している脳領域で神経伝達を調節する。しかしながら、神経ペプチド前駆体の処理に由来する正確なオピオイドペプチドを最新の状態に特徴付けされていない。したがって、我々は実験的パーキンソン病とL-DOPA誘発ジスキネジアの動物モデルでMALDI IMSを利用した。 MALDIイメージング質量分析法は、神経ペプチド特性評価に関して特に有利であることが判明る、一般的に使用される抗体ベースのアプローチから知られたペプチド配列と以前に観察された翻訳後修飾を対象としています。これとは対照的にMALDI IMSは、新規ペプチドの加工製品を解明するため、神経伝達の神経変調の新たな分子メカニズムを明らかにすることができます。神経ペプチドの絶対量はMALDI IMSによって決定することはできませんが、ペプチドイオンの相対量は、健康と病気のレベルを変更する方法について洞察を与えて、質量スペクトルから、線引きすることができます。ここで示す例では、ダイノルフィンB、α-neoendorphinとサブスタンスPのピーク強度が大幅に背に増加することが認められたが、重度の運動障害を持つ動物の背内側、線条体（図顔面、体幹と口舌の筋肉を伴わない5）。また、MALDI IMSは、機能不活性化の以前に未知のメカニズムを表す、ジスキネジアの重症度とDES-チロシンα-neoendorphinのレベルとの相関関係を明らかにしたN末端 ​​のチロシンの除去などの線条体におけるダイノルフィンのリザベーションがダイノルフィンのオピオイド受容体結合能力9を減らすことができます 。これは、MALDI IMSを使用して、LIDの神経ペプチドの特性に関する最初の研究であるとの結果は、生物医学研究のあらゆる分野のアプリケーションのための技術の潜在能力を強調表示します。

L-DOPAを用いたドーパミン補充薬物療法は、パーキンソン病の最も一般的に使用される対症療法ですが、不随意の異常な動き、と呼ばれる運動障害などの副作用が付属しています<sup&gt; 1</sup&gt;。ここでは、MALDIイメージング質量分析のためのプロトコルは、運動障害に関連したラット脳の神経ペプチドレベルの変化を検出し、その提示されます。

パーキンソン病における神経ペプチドのMALDIイメージングマススペクトロメトリー

MALDIイメージング質量分析（IMS）は、生物学的組織試料における分子種の空間解析を可能にする強力な手法である2 ...

この手順の主な目的は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（MALDI-IMS）を用いて、薄い脳切片におけるニューロペプチド、特にオピオイドペプチドの空間分布を直接的に解明することです。まず、急速凍結させたラット脳から12 µmの薄い組織切片を採取し、導電性ガラススライドに固定します。次に、化学インクジェットプリンターを用いて切片上にマトリックスをアレイ状に塗布し、各マトリックススポットから質量スペクトルをそれぞれ取得します。実験全体の成功を確認するため、次にいくつかのペプチドピークを可視化します。続いて、書き出された質量スペクトルの確認と処理を行い、ペプチドデータの後処理および統計的な評価を実施します。最後のステップとして、モールドイメージング質量分析法によって得られたペプチドデータを解析し、検証します。最終的に、結果から、異なる治療群間で脳の異なる領域における相対的なオピオイドペプチドレベルに有意な差があることが示されました。ラジオ免疫SAOゲルベースのアプローチなどの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、マルチイメージングによって高い分子特異性を維持しながら、治療によって誘発された変化の局在化が可能になることです。これにより、これまで検出されていなかった翻訳後修飾の切断を検出できる可能性が得られます。この手法に不慣れな方は、高度な試料調製とデータ処理が必要となるため、最初は苦労するかもしれません。ここでは、組織の品質、マトリックス、適用プロトコル、データ評価、およびそれに続くバリデーション実験に焦点を当てます。タンパク質分解による劣化を防ぐため、組織の切り出しは迅速かつ慎重に行うことが不可欠です。承認されたプロトコルに従ってラットを安楽死させた後、直ちに脳を取り出して粉末ドライアイスに移し、比較的ゆっくりと凍結させてから、-80 °Cのフリーザーで保存します。全脳は、切片を作成するまで数年間保存しても、MS信号の質が低下することはありません。手順を開始する際は、Tissue-Tek組み込み剤を用いて脳をホルダーに固定します。この際、切断する脳の部位に組み込み剤が付着しないように注意してください。組み込み剤は、ペプチドのイオン化および脱離を妨げます。クライオスタットミクロトームを用いて凍結組織を12 micronの厚さに切断し、組織切片を導電性MALDIガラススライドに貼付します。この時点で組織切片の染色を行い、組織の品質を確認することができます。この図は、液体窒素で急速凍結させたことで組織にひび割れや裂け目が生じた脳組織のクリスタルバイオレット染色を示しています。この組織は、マトリックスが広がり均一に結晶化しないため、高解像度のMALDIイメージング質量分析には適していません。切片を真空状態で15分間乾燥させ、次回の使用までスライドを-80°Cで保存してください。組織切片は、-80°Cで保存した場合であっても、切片作成後できるだけ短い時間内に分析する必要があります。まず、切片をデシケーター内で1時間解凍し、次に切片が載ったスライドを室温の70% ethanolで10秒間洗浄し、続いて室温の95% Ethanolで10秒間の洗浄を2回行います。洗浄後、スライドをデシケーター内で10分間乾燥させます。組織切片を顕微鏡で観察し、組織の歪みや微小な裂け目、またはmold EMSの品質を損なう可能性のある小さな亀裂がなく、切片の品質が良好であることを確認します。次に、50 mg/mL DHB、50% メタノール、10% 150 mM 酢酸アンモニウム、および0.3% トリフルオロ酢酸を水に含んだ新鮮なマトリックス溶液を調製します。組織切片をセットしたガラススライドホルダーをスキャンし、チップソフトウェアの画像解析機能を用いて、ホルダーをそれぞれの参照点に合わせて調整します。次に、脳領域と標的分析物の両方に対して適切なマトリックス適用パラメータを選択します。続いて、空間分解能を指定します。そして、最適化されたプロトコルを用いて、Chemical Link Jettプリンターでマトリックスを適用します。マルチデータ取得を行う前に、マトリックスをスポットした最終セクションをスキャンし、画像を保存します。これは、後でマトリックスのデポジットをMALDIステージのモーター座標と照らし合わせるために使用されます。すぐに使用しない場合は、マトリックスをスポットしたセクションを、必要になるまで真空デシケーター内で保存しても構いません。ほとんどの実験では、ここに示されているように、一度に複数のセクションが解析されます。各スライドホルダーには2枚のガラススライドが収まるため、すべてのホルダーについて2枚1組のセットを複数回解析する必要があります。モードTOFの収集方法とパラメータは同一であるべきですが、ペプチド質量のキャリブレーションはスライドごとに確認する必要があります。次に、レーザーの焦点およびレーザー強度を含む、組織サンプルの収集パラメータを最適化します。その後、ベースラインの上昇やピーク分解能の低下を招かず、かつ検出器の飽和や隣接するマトリックス堆積物からのマトリックスアブレーションを起こさせずに、最適なMS信号を得るために必要なショット数を入力し、レーザーの移動方法を選択します。ノイズのみが検出されるまで、マトリックススポットあたりに撮影可能な最大ショット数を推定します。ランダムな移動パターンを用いて、25ショットステップで計24ステップ、各マトリックス滴下部位から合計600ショットを蓄積します。Flexイメージングソフトウェアを使用して、すべてのスポット切片のスキャン結果をMALDIステージのモーター座標と照合します。次に、自動実行バッチランナーソフトウェアを使用して、バッチモードでデータ収集を行います。Flex imagingなどのデータ可視化ツールを用いてMaori IMS画像を視覚的に確認し、ピーク強度の分布を評価して、その分布が組織の特徴、スポットの品質、または標準化の影響に関連しているかどうかを判断します。この例では、9匹の異なる個体における10種類の異なるペプチドピークの分布を示しています。正規化に使用される全イオン強度（TIC）が白で表示されています。TICは、質量スペクトルにおけるすべての強度値の合計です。個体3ではTIC値が非常に低く、ペプチド画像は特異的な情報よりもノイズが多くなっています。動物番号6の脳では、切片の底部にTIC値が非常に高い領域が見られます。これは、ペプチド画像CおよびDの当該領域における異常に高い強度として反映されています。これはデータ解析に影響を及ぼす可能性のある過剰正規化の影響と考えられます。過剰正規化の影響が特定の治療群にのみ現れた場合、不正確な結果を招く可能性があります。この例では、グループCのTICが著しく高く、個々のピーク強度に異常な影響を及ぼす可能性があります。例えば、未処理のデータではシトクロムCの平均ピーク強度はグループBよりもグループCの方が高いですが、正規化後はピーク強度が低くなっています。グループCにおいて、このような状況は結果の深刻な誤解を招く恐れがあります。広範なデータの検証に進む前に、各処置群の平均TICを常に算出することが重要です。次に、関心領域を定義するために、pro dinorphine メッセンジャーRNAが 14 kilodalton の pro dinorphine プロペプチドに翻訳されることを理解しておくことが重要です。線条体ニューロンにおいて、pro dinorphine は小胞に充填され、樹状突起を介して他の線条体ニューロンを標的とするか、または軸索を介して細胞体から数ミリメートル離れた黒質へと輸送されます。これらの小胞には、プロペプチドをさらにα-ネオエンドルフィン、ジノルフィンAまたはジノルフィンBなどのジノルフィンペプチドへと処理する酵素が含まれています。それぞれが異なるオピオイド受容体を活性化させることができます。標的構造である黒質に放出された後、ジノルフィンはエンドペプチダーゼおよびエキソペプチダーゼによってさらに処理され、除去されます。既存の抗体はペプチドのC末端のみを標的とし、N末端を標的としないため、これらのペプチドの一部は質量分析法でしか検出できません。オピオイド受容体の活性化を担うのはY-G-G-F-L配列であり、ジノルフィン産生細胞は迷走AUMに存在し、黒質へ投射しています。したがって、以下の実験では、迷走AUMおよび黒質（subs nigra）の両方をIMSで解析し、各関心領域からスペクトルを取得しました。背内側および背外側のstri aumならびに内側および外側のnigraをflex解析ソフトウェアで定義し、データ解析用にエクスポートしました。データ削減のためには、さまざまなソフトウェアに含まれているピーク検出ツールを用いてピーク検出を行いました。例えば、Originのピーク解析やMATLABのMS Peaksを使用します。すべてのスペクトルからピークリストを単一のタブ区切りテキストファイルとして書き出し、FreeWay P binなどのソフトウェアを用いてピークの開始および終了境界を決定します。ピーク境界間の曲線下面積を算出し、これを統計解析に使用してください。治療群間のMS再現性は、各質量値に対する平均MSトレースと標準誤差を算出することで評価できます。この例では、正常対照黒質（intact control nigra）の平均スペクトルを用いて、分析した質量範囲全体のばらつきを評価します。両方の対照群でピーク強度が等しく、標準偏差が低いため、良好な再現性が認められます。これにより、妥当な統計解析が可能になります。データセットに大きなばらつきが見られる場合は、ほぼ常にMaori IMS実験を繰り返す必要があり、実験的な変動要因を可能な限り排除しなければなりません。通常、1回のセッションでできるだけ多くの切片と動物を処理し、場合によっては複数人が交代で作業を行います。しかし、それでも不十分な場合があり、その際は他の戦略を採用することがあります。例えば、いくつかのスペクトルにノイズが含まれている場合、TICの周波数分布をプロットすることでこれらを特定でき、カットオフしきい値を設定して不適切なデータを除去することができます。データを評価する別の方法として、同一群内の2匹の動物のすべてのピークを互いにプロットする方法があります。両方の動物でピーク強度が等しければ、強度プロットは直線的な細い線として表示されます。ある動物のスペクトルデータの品質が低い場合、図の右側に示されているように、通常は直線から非対称なズレが生じます。ペプチド配列の同定には、多次元液体クロマトグラフィーと高分解能質量分析計を連結させ、ラット脳組織抽出物のペプチドドメイン解析を行います。簡潔に述べると、ラット脳切片からネウロペプチドを抽出し、強陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて前分画します。その後、ナノフロー逆相HPLCを用いて各画分をさらに分離します。次に、ハイブリッド線形イオントラップ・フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計を用いたエレクトロスプレー・タンデム質量分析により、ニューロペプチドを特性解析します。最終的に、データベース照合によってペプチド配列の同定を行います。一部のニューロペプチドについては特異的抗体が利用可能であり、免疫組織化学実験によってペプチドの同定および実験結果を検証することができます。これにより、MALDIイメージング質量分析よりも高い分解能が得られ、さらなる情報を取得することが可能です。この例では、左上のパネルの海馬および左下のパネルの黒質において、Dior bee免疫反応性神経線維が確認できます。一方、右下のMaori IMS画像は、異なる脳領域のレベルでの局在を示しています。あるピーク質量が特定のペプチドに一義的に割り当てられることの最終的な証明は、proninノックアウトマウスなどのペプチドノックアウト動物を用いてmoldy IMSを行うことです。矢印で示されているように、いくつかのピークは野生型対照群では存在しますが、ノックアウト群では消失しています。サブスタンスPやP inkなどの関連のないペプチドピークは、ノックアウト動物と対照動物の間で差を示しません。ジノルフィンBおよびα-ネオエンドルフィンピークの強度は、6-ヒドロキシドパミン病変において有意に増加しています。矢印で示されるように、高度なジスキネジアを呈するパーキンソン病様線条体のAUMは、低ジスキネジア群および病変対照群と比較して増加しています。統計解析により、末端のチロシンが除去された切断型α-ネオエンドルフィンに相当するペプチド質量の有意な増加も明らかになりました。実際に、視覚的確認によるイメージング結果では、緑色で示された親化合物であるジノルフィンペプチドと、赤色で示されたその関連DESチロシン代謝物との高い共局在が示されており、右側のオーバーレイパネルの黄色は領域的な重複を意味しています。異なる脳構造における選択的なペプチド処理に関する知見は、他の手法では検出不可能なものであり、本手法の大きな可能性を強調しています。ここでは、赤色で示された特定のDESチロシン代謝物が、緑色で示された親ペプチドと共局在しており、ジスキネジアラットの線条体においてのみ観察され、黒質では観察されませんでした。黒質の画像解析では、赤色で示された分解産物luおよびkelin archが、緑色で示されたdi norphine Bと逆方向に局在していることが判明しました。これは、ジスキネジアの間にdi norphine Bが黒質外側部に局所的に放出され、その後luおよびcareful in AR Oneへと代謝されたことを示しています。マルチモーダルイメージングを用いた単一の実験は、試料調製とデータ収集を含めて1日または2日で実施可能です。その後、データ評価にさらに1〜2日を要します。サンプル数に応じて、バリデーション実験を適切に実施する場合、ラボでの実作業にさらに1〜2日必要になります。以下のステップでは、特に注意を払うことが重要です。ペプチドの分解を避けるため、組織の切断と凍結は迅速に行う必要があります。また、洗浄およびマトリックス塗布のプロトコルは、実験ごとに最適化する必要があります。過剰な正規化の影響や不適切なピーク検出による偽陽性を避けるため、データ評価と統計解析は慎重に行わなければなりません。

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