突触前多巴胺纹状体脑片的快速扫描循环伏安动态

1。实验要领

电极的制作

• 有无数的碳纤维微电极的制备方法，因为大多数是在内部。通常是什么决定了电极制造细节的电化学技术应用于电极（如安培与FSCV）。对于FSCV，微电极可以在内部使用以下三个步骤的过程。对于碳纤维电极的制作更完整的描述，可以看到最近的朱庇特的第¹条。但是请注意，下面描述的电极是圆柱形的碳纤维微电极，它需要较少的步骤与上述协议安培碳纤维微电极制造。这种简化的协议不需要沸点在丙酮中的碳纤维，火抛光的玻璃毛细管，或用环氧密封玻璃纤维的交界处。
• 使用真空吸aspir吃了碳纤维（直径7微米;古德费洛Oakdale，PA）成硼硅玻璃毛细管与微丝（长10厘米，直径1.2毫米，内径0.68毫米;上午系统，Carlsborg，西澳）。
• 将螺纹毛细管毛细管拉到一半到电极拉马（Narishige，日本东京）。电极拉马的输出设置不同从实验室到实验室。作为参考，我们的车夫输出设置主磁铁90.7，23.2分磁铁，加热器53.4。输出设置应该是经验的提炼，生成约4.4毫米长，与周围的碳纤维密封，玻璃锥。
• 在显微镜下（奥林巴斯，日本东京），内饰，碳纤维（使用手术刀刀片）从玻璃允许约50-200微米的碳纤维伸出密封界面提示延伸。

溶液的制备

三种类型的人造蜡需要提前做好准备，在超纯水（18MΩ厘米）水，brospinal液（ACSF）解决方案。

• 蔗糖，学联可以准备至少一天前的切片。蔗糖学联缓冲区由（毫米）：180蔗糖，30氯化钠，4.5氯化钾，1.0 MgCl _2的3碳酸氢钠，1.2的NaH ₂ PO _4，和10个D -葡萄糖（pH值7.4），26，应使用95含氧％O ₂ / 5％CO ₂ 15分钟^2。如果提前准备的时间，该解决方案可冷藏保存于4 ° C为1周。
• 学联为伏安录音解决方案应做好实验的一天。学联的解决方案，包括（毫米）：126氯化钠，2.5氯化钾_，2.4，1.2氯化钙₂ MgCl 2 _的 25碳酸氢钠_3，1.2的_{NaH 2 PO 4，11}个D -葡萄糖，0.4抗坏血酸（pH值7.4）。在实验中，含氧95％O2 / 5％，在室温下的_CO 2冒泡过程中。
• 改性学联电极校准包含解决方案（毫米）：2.5氯化钾，126氯化钠，1.2的NaH ₂ PO _{4，2.4，1.2氯化钙}氯化镁_2，和25 ₃碳酸氢钠（pH值7.4），并且可以保持长达一个星期，没有制冷或充氧。

电极校准

• 前和校准后，分别是由电极的可行性和敏感性，使用甲流“T细胞”，其中包含一个密封的参比电极（Ag / AgCl电极）的3个端口。所制作的微电极是降低成“T细胞”的流动。注射泵进气口连接，允许在2毫升/分钟的流速不断流动的改性学联。的“T细胞”的第三个端口连接到3微米多巴胺在修改，学联，填补了注射器。
• 预校准，允许修改学联溶液流量约3 - 7秒，然后手动注入1-2毫升的多巴胺3微米标准。对于每一个电极预校准，重新校准至少3次，平均每个获得的最大电流。
• （见第3节），切片后立即伏安实验的电极以同样的方式后校准如上所述。
• 校正因子（后来在数据分析），是由多巴胺标准浓度除以平均多巴胺的氧化电流（NA）。例如，目前的反应是除以3，当使用3微米多巴胺标准。

2。切片制备

1. 倒入小烧杯中，并在一个冰桶，10毫升蔗糖学联。此外，瞬间粘合剂（乐泰404）冰桶内达到。
2. 准备刀片和解剖所需的必要工具，如钳，铲，剪刀，擦拭干净用酒精垫。
3. 在一个小的气茶_牺牲二氧化碳窒息鼠标mber，立即斩首使用锋利的剪刀。迅速取出整个大脑。约10分钟，放置在冰冷的蔗糖学联烧杯的大脑。
4. 在此期间，准备切片Vibratome。首先，将一些碎冰标本浴。标本室的位置，并拧紧到位坚决持有。添加更多的样品室周围的冰，以填补空白，确保没有冰室得到。广场清洁的刀片在刀片上Vibratome的持有人，并填写标本室，与冰冷的蔗糖学联。
5. 成立了一个工作准备的大脑表面，倒有些冷蔗糖学联已上翘的培养皿上放置了一块纸巾。使用镊子准备培养皿转移到大脑。对于冠状切片，切小脑内侧横向轴沿用刀片和丢弃。这将创建一个平底，可贴Vibratome阶段。
6. 地点（放置在冰桶在第1步）标本舞台上的乐泰胶粘剂下降。随即，贴上准备在舞台上脑的平头，保持尽可能直立。在标本室的阶段，并拧紧螺丝，确保大脑是完全沉浸在会议厅内的蔗糖学联。
7. Vibratome前使用的控制，调整阶段，使刀片与大脑的顶部。 Vibratome的最佳参数，通过设置的频率和速度低。较低的速度是首选的挤压大脑，这是在更高的速度观察，以尽量减少刀片的力量。层厚设置为400微米。
8. 最初的几片不会包含纹状体。重复，直到获得片含纹状体切片。一旦纹状体区域是达到解剖标志肯定，使用油漆刷解除切片，并在烧杯含氧，室温学联。通常情况下，可以得到3至4片含有使尾壳和伏隔核包括纹状体复杂。
9. 允许切片至少1小时，以适应环境，在室温含氧学联在实验中使用。

3。从片伏安录音

虽然是孵化切片，切片录音室准备。

1. 以油管连接淹没录音室（自定义科学，丹佛，CO）和充氧，房间温度学联地点。灌注泵（沃森马洛有限公司，法尔茅斯，英国）设置到1毫升/分钟的流量。温度控制器设定到32 ° C。学联填充定制的片持有人（修改丝网光盘阶段）后，准备切片删除任何气泡，用针注射器（BD脊髓针）。
2. 总理片按图纸上的真空浴流出管（玻璃液废液瓶）用注射器开始流动。放置一个kimwipe作为一个切片持有人控制的缓冲区溢出边缘的灯芯。
3. 培养1小时后，转让切片片在录音室的持有人，这是不断与95％的_{O 2} / 5％CO ₂的室温学联灌注。
4. 淹没在片人的银/氯化银参比电极（录音片室盖）和连接电极使用弹簧夹头阶段。
   • 的Ag / AgCl参比电极可以在阳极氧化（+1 V）为5分钟，250微米的银线（AM系统，Carlsborg，WA），1 M盐酸沉积在表面的一层薄薄的AgCl的房子银线。
5. 钨刺激​​电极（塑料，罗阿诺克，弗吉尼亚州）下纹状体脑片表面。刺激电极接触片，因为它在顶部在于的，但不应穿刺切片。在我们的实验装置是由一个Neurolog刺激，刺激。
6. 碳纤维工作电极回填用150毫米氯化钾使用BD脊髓针的解决方案。一个引线，然后插入（大地主电子，科尼利厄斯，或），这是连接到低噪声ChemClamp电位（矸团，明尼苏达州明尼阿波利斯）使用弹簧夹头阶段。工作电极置于约100 - 200微米远离双极刺激电极，成片的深约75微米。
7. 交付使用或者单（单相，350μA，60赫兹，4毫秒脉冲宽度）或多个（如5个脉冲，350μA，20赫兹，宽4毫秒）脉冲，电刺激，引起神经递质刺激电极第³版。
8. 要衡量使用FSCV电诱发的多巴胺，一个三角波形应用于电极。 DOP的典型参数胺检测：碳纤维微电极的潜力是举行-0.4 V与一个银/氯化银参比电极，然后带回扫描速度在400 -0.4 V至+1.2 V的正极限斜坡，V / S 。
9. 切片电刺激，每5分钟产生多巴胺流出伏安测量15秒。
10. 至少有三个稳定的电刺激多巴胺的释放录音（峰高之间的差异是<10％）后，学联含有药理代理人的利益是灌注在流速为1 mL /分钟超过30分钟，以获得最大的效果切片。电刺激多巴胺录音的药理灌注期间每隔5分钟。

4。数据分析

由此产生的电流随时间片获得的痕迹，可以适合非线性回归了一套基于米氏方程，由怀特曼和他的同事编写的软件在LabVIEW（美国国家仪器公司，美国德克萨斯州^奥斯汀 ） 4-6。在这个软件中，电流随时间的痕迹，可以安装不同_的两个参数，V最大（nm / s时，相应递减阶段的跟踪表明，摄取的多巴胺转运率）和多巴胺浓度每脉冲（NM对应的最大峰高）。设置为160纳米的K _m值，反映了多巴胺的多巴胺转运蛋白的亲和力，并没有改变。电极的校准后的实验后确定的因素是需要装修。 LabVIEW软件中包含的决定系数^（R）参数来确定的拟合优度（R ²的值> 0.8） 。

5。代表性的成果

FSCV用于检查单脉冲电刺激多巴胺的释放和摄取尾把阿门（CPU），伏隔核（NAC）的核心，NAC在小鼠壳。图1A所示的代表结果表明电流（或浓度）随时间变化的地块。红色箭头表示电刺激时，在相应的电流量在碳纤维微电极，在多巴胺浓度的变化应占上升切片。在电刺激的主要过程是多巴胺的释放，但整体观察峰的高度，以及其他如吸收和扩散的进程作出贡献。降的高峰阶段，主要是由于其转运的神经递质再摄取由因为神经刺激已经停止^7。然而，峰值衰减不仅限于再摄取，扩散和新陈代谢，也有助于减少电流。它一直推测，由于电化学测量的时间尺度是几秒钟的事，FSCV太快措施contributio从代谢的^NS 7 。在这些电流随时间的痕迹，Y轴转换为使用后的实验校正因子的浓度（微米）。图1A中的插图是各自的背景，减去循环伏安电流随时间的痕迹。测量电流（Y轴）绘制的电极（X轴）的应用潜力，多巴胺的化学发现与观察到+0.6 V的氧化峰，相应减少了多巴胺的邻醌的高峰期是观察 - 的Ag / AgCl参比电极为0.2 V与。第三代表性的数据，使用一个三维伪彩色图（图1B）相结合的电流随时间的痕迹和循环伏安的信息，形成一个单一的情节。代表的伪彩色图，绘制沿x轴秒的时间，碳纤维工作电极施加电压是沿Y轴图表，和目前的FAL代表沿Z轴本身的颜色。由于碳纤维微电极（直径〜7微米）体积小，电刺激多巴胺的动态可检测纹状体（CPU和NAC的核心与NAC壳图2）分立的解剖区域。

使用纹状体冠状切片的一个好处是，它消除了多巴胺的细胞体的贡献，并允许调查突触前多巴胺动态。突触前多巴胺的释放和吸收控制没有严格限制多巴胺autoreceptor或转运功能，正如其他^人16，17所示。 Heteroreceptors其他神经递质系统也调节多巴胺动态^18，19。代表电流随时间的变化如图3a所示的痕迹表明，当片1微米quinpirole（D2/D3受体激动剂）30分钟，电诱发多巴胺的释放减少治疗观察。另一方面，当基板多巴胺转运蛋白，如甲基安非他明，是通过30分钟的片灌注，多巴胺的释放无差异（图3B）。峰值衰减转移到右侧，通常是与多巴胺转运动力学的改变_（的K ^m）3 。最后，图3C是一个代表电流随时间的跟踪跟踪，一旦切片已在沐浴着一个100毫微克/毫升的脑源性神经营养因子（BDNF）的解决方案，其中已假设影响^多巴胺的释放^，21动态20。从这个代表性的跟踪，可以看出，BDNF的能力，增强电诱发多巴胺的释放。两者合计，这些药物治疗强调FSCV公用事业探测纹状体内多巴胺的动态。

使用大脑切片调查FSCV突触前多巴胺动态的主要限制因素是，从一个完整的大脑neurocircuitry丢失。随着片FSCV是不可能的研究来自其他脑区神经递质的影响，很难理解这些系统的贡献，对被调查地区的功能（如纹状体）或评估无刺激多巴胺的水平。然而，在FSCV最近的技术进步使多巴胺的瞬态测量（与无电刺激），在自由活动大鼠药理操纵，自我管理^，或新奇 22 - 24。总体而言，片FSCV突触前多巴胺动态提供有价值的信息，并提供互补的神经化学物质的技术，如微透析，电，和/或自由活动FSCV耦合片FSCV结果在大脑中的神经递质的运作有更全面的观点。

电诱发多巴胺图1。Ë发布使用FSCV以下单脉冲刺激C57BL/6J小鼠背CPU片。 （一）浓度随时间变化的轨迹，在单脉冲（红色箭头）诱发多巴胺的释放。一个星号代表的因素，有助于浓度的上升，这主要是多巴胺的释放，但也有利于吸收和扩散。两个星号代表的峰值信号返回基线，主要是由于摄取，也有助于扩散。插图显示了相应的循环伏安。 （二）从背CPU的显示时间（X轴）的代表色图，碳纤维微电极的Ag / AgCl参比电极（Y轴）与应用潜力，并在当前伪彩色。

图2：由单一的电刺激脉冲（红色箭头表示）在NAC核心诱发多巴胺的释放。C57BL/6J小鼠和外壳。 （A和C）浓度随时间变化的轨迹和其相应的循环伏安曲线（插图）从NAC的核心和壳。 （B和D）如前所述，从NAC的核心和壳的代表色图。

图3切片后的代表跟踪治疗了30分钟的药理剂;在所有情况下，单脉冲被用来唤起CPU中的多巴胺的释放。 （一）多巴胺D2受体激动剂的应用，quinpirole（红色曲线）相比，治疗前（​​黑色曲线）。 （二）甲基安非他明灌注（紫色曲线）相比，治疗前（​​黑色曲线）。 （三）脑源性神经营养因子的能力，影响多巴胺的动态（蓝线）相比，治疗前（​​黑色曲线）。

这里介绍的协议，演示了如何准备和使用FSCV实验小鼠冠状脑切片。虽然这种方法是具体 ​​的获取和测量多巴胺的动态，其他神经递质如腺苷，过氧化氢 ​​，去甲肾上腺素和血清素已在体内或体外监测与^{FSCV 3，8 -} 11 。 FSCV可以用来监视其他神经化学物质的一些简单的修改适用于^{工作电极3，11}的波形。由于这些神经化学物种中，有很多类似的氧化电位，产生的循环伏安每个可氧化物种提供一个独特的化学指纹，这使得化学鉴定。此外，FSCV已在不同品种的使用，从果蝇非人类灵长类动物，从而获得更好地理解了神经递质在这些模式生物^{12 - 15。}其中最主要的原因，FSCV有B在这样一个品种多样的EEN是由于碳纤维微电极，通常直径小于7微米的小直径。因此，这些微电极可以从非常小的环境样品的组织，在果蝇大脑（NL）的情况下，或歧视离散子解剖像NAC与壳的核心区域， ^在较大的品种12 ^-14。

总之，结果证明片伏安法是一种宝贵的的电化学探针在小鼠纹状体突触前多巴胺动力学的工具。代表性的数据，侧重于灌流从一个'正常或健康的“控制大脑切片和多巴胺的释放和吸收特征参数的能力药理代理。此外，FSCV可用于评估在电刺激释放的差异和转基因治疗的动物的吸收参数，对自己或后pharmacological治疗^{15 - 16。}切片FSCV调查离散的毫秒时间尺度上发生的解剖区域内的多巴胺神经递质动态提供了一个独特的机会。总体而言，FSCV电化学技术提供了增强的空间和时间分辨率，相比其他的神经化学技术。