Name: 突触前多巴胺纹状体脑片的快速扫描循环伏安动态 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 学习使用快速扫描循环伏安法测量纹状体脑片中的突触前多巴胺动态变化。该方法通过电刺激诱发多巴胺释放并记录摄取速率，为神经药理学研究提供可靠的实时检测手段。

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由美国国家酒精滥用与酒精中毒研究所（NIAAA；AA-016967 和 AA016967-01S1；TAM）、韦恩州立大学启动资金以及韦恩州立大学研究资助计划提供资助。本内容仅由作者负责，不代表 NIAAA 或美国国立卫生研究院的官方观点。

1. 实验基本要素
电极制备
<ul type="circle">
 <li>由于大多数碳纤维微电极均为实验室自制，因此存在多种制备方法。通常决定电极制备细节的是施加于电极的电化学技术（例如安培法与快速扫描循环伏安法FSCV）。对于FSCV，可采用以下三步法在实验室中自制微电极。有关碳纤维电极制备的更完整描述，请参见近期发表的JOVE文章1。但需注意，下文所述电极为圆柱形碳纤维微电极，其制备步骤较上述方案中的安培法用碳纤维微电极更少。该简化方案无需将碳纤维在丙酮中煮沸、无需对玻璃毛细管进行火焰抛光，也无需使用环氧树脂密封玻璃-纤维连接处。</li>
 <li>利用真空负压将一根碳纤维（直径7 μm；Goodfellow，Oakdale，PA）吸入含内丝的硼硅酸盐玻璃毛细管中（长度10 cm，外径1.2 mm，内径0.68 mm；A-M systems，Carlsborg，WA）。</li>
 <li>将装有碳纤维的毛细管放入电极拉制仪（Narishige，Tokyo，Japan）中，将其拉断成两半。不同实验室所用的电极拉制仪参数设置各不相同。作为参考，我们使用的拉制参数为：主磁铁90.7，副磁铁23.2，加热器53.4。应通过实验优化参数，以获得长约4.4 mm的玻璃锥形结构，并在碳纤维周围形成紧密密封。</li>
 <li>在显微镜（Olympus，Tokyo，Japan）下，使用手术刀片修剪从玻璃尖端伸出的碳纤维，使约50–200 μm的碳纤维从密封良好的界面处露出。</li>
</ul>
溶液制备
需要提前配制三种人工脑脊液（aCSF）溶液，均使用超纯水（18 MΩ cm）配制。
<ul type="circle">
 <li>蔗糖-aCSF 可在切片前至少一天配制。蔗糖-aCSF 缓冲液的成分为（单位：mM）：180 蔗糖，30 NaCl，4.5 KCl，1.0 MgCl2，26 NaHCO₃3，1.2 NaH2PO4，以及 10 D-葡萄糖（pH 7.4），并应使用 95% O₂ 气体混合物进行氧合2/5% CO₂2 15 分钟 2若提前配制，该溶液可置于冰箱中冷藏保存 4 °C 最长可达1周。</li>
 <li>用于伏安法记录的 aCSF 溶液应在实验当天配制。aCSF 溶液成分如下（单位：mM）：126 NaCl，2.5 KCl，2.4 CaCl2，1.2 MgCl2，25 NaHCO₃3，1.2 NaH2PO4，11 D-葡萄糖，0.4 抗坏血酸（pH 7.4）。实验过程中，通过通入95% O2/5% CO₂混合气体进行氧合。2 在室温下。</li>
 <li>用于电极校准的改良 aCSF 溶液成分（单位：mM）为：2.5 KCl、126 NaCl、1.2 NaH2PO4，2.4 CaCl2，1.2 MgCl2，以及 25 NaHCO₃3 （pH 7.4），可在无需冷藏或充氧的条件下保存长达一周。</li>
</ul>
电极校准
<ul type="circle">
 <li>使用含有3个端口并带有密封参比电极（Ag/AgCl）的流动“T型细胞”进行电极的可行性与灵敏度测定，分别通过实验前和实验后校准完成。将制备的微电极插入流动“T型细胞”中。入口端连接至注射泵，使改良aCSF以2 mL/min的流速持续流过。T型细胞的第三个端口连接装有3 μM多巴胺（溶于改良aCSF中）的注射器。</li>
 <li>进行预校准时，先让改良aCSF溶液流动约3–7秒，然后手动注入1–2 mL的3 μM多巴胺标准溶液。对每根需预校准的电极，至少重复校准3次，并取每次获得的最大电流值求平均。</li>
 <li>在脑片伏安实验结束后（见第3节），立即以与上述相同的方式对电极进行事后校准。</li>
 <li>校准因子（后续用于数据分析）通过将平均多巴胺氧化电流（nA）除以多巴胺标准品浓度得到。例如，当使用3 μM多巴胺标准品时，将电流响应值除以3。</li>
</ul>
2. 切片制备
<ol>
 <li>将 10 mL 蔗糖 aCSF 倒入一个小烧杯中，并置于冰桶内。同时，将瞬干胶（Loctite 404）也放入冰桶中，以便取用。</li>
 <li>用酒精棉片擦拭清洁剃刀刀片以及解剖所需的工具，如镊子、刮匙和剪刀，做好准备。</li>
 <li>将小鼠置于小型气体室中，通过 CO2 窒息法处死，随后立即使用锋利剪刀进行断头。迅速取出整个脑组织，并将其放入盛有冰冻蔗糖 aCSF 的烧杯中，浸泡约 10 分钟。</li>
 <li>在此期间，准备振动切片机进行切片。首先，在样品槽中放入一些碎冰。安装样品室并拧紧固定，确保其牢固就位。在样品室周围添加更多碎冰以填满空隙，注意避免冰块进入样品室内。将已清洁的剃刀刀片装入振动切片机的刀片夹中，并向样品室加入冰冻蔗糖 aCSF。</li>
 <li>为准备脑组织的工作面，将少量冷的蔗糖 aCSF 滴加到放置在倒置培养皿上的纸巾上。用镊子将脑组织转移至准备好的培养皿上。对于冠状切片，使用剃刀刀片沿内侧-外侧轴切除小脑并弃去。此操作可形成一个平坦的基底，便于固定在振动切片机的载物台上。</li>
 <li>取一滴步骤 1 中预先置于冰桶内的 Loctite 胶水，滴在样品载物台上。立即将脑组织的平坦端固定在载物台上，尽量保持其竖直。将载物台放入样品室中并拧紧螺丝，确保脑组织完全浸没在样品室的蔗糖 aCSF 中。</li>
 <li>通过调节振动切片机前面的控制装置，调整载物台位置，使剃刀刀片与脑组织顶部对齐。振动切片机的最佳参数为将频率和速度设置为较低水平。较低的速度有助于减少刀片对脑组织的挤压作用，而高速下常出现组织压扁现象。切片厚度设定为 400 μm。</li>
 <li>最初的几片切片不包含纹状体。重复切片操作，直至获得含有纹状体的切片。一旦到达纹状体区域（通过解剖标志确认），使用毛笔小心提起切片，转移至盛有通氧、室温 aCSF 的烧杯中。通常可获得 3 至 4 片包含纹状体复合结构的切片，其中包含尾状壳核和伏隔核。</li>
 <li>将切片在室温下、通氧的 aCSF 中静置至少 1 小时，使其适应环境，之后方可用于实验。</li>
</ol>
3. 脑片伏安法记录
在切片孵育的同时，可准备切片记录室。
<ol>
 <li>取连接至浸没式记录室（Custom Scientific，丹佛，科罗拉多州）的管路，放入持续通氧的室温人工脑脊液（aCSF）中。将灌流泵（Watson Marlow Limited，法尔茅斯，英格兰）设置为1 mL/min的流速。将温度控制器设定为32 °C。当aCSF充满自制的脑片持留装置（经改装的网状圆盘支架）后，使用针头注射器（BD脊髓穿刺针）去除其中所有气泡，以准备放置脑片。</li>
 <li>通过注射器对流出管路（通向玻璃废液瓶）抽真空，启动灌流，从而预启动切片浴。在脑片持留装置边缘放置一片Kimwipe纸巾作为导流芯，以控制缓冲液溢出。</li>
 <li>孵育1小时后，将脑片转移至记录室内的脑片持留装置中，该装置持续灌流含95% O2/5% CO2的室温aCSF。</li>
 <li>将Ag/AgCl参比电极浸入脑片持留装置中（用胶带固定在切片室盖上），并通过鳄鱼夹将其连接至前置放大器。
 <ul type="circle">
 <li>Ag/AgCl参比电极可自行制备：将一根250 μm银丝（A-M Systems，Carlsborg，华盛顿州）在1 M HCl溶液中阳极氧化（+1 V，5分钟），使氯化银在银丝表面沉积一层薄层。</li>
 </ul>
 </li>
 <li>将钨刺激电极（Plastics One，罗阿诺克，弗吉尼亚州）缓慢下降至纹状体脑片表面。刺激电极与脑片表面接触但不应刺穿脑片。在本实验装置中，刺激信号由Neurolog刺激器产生。</li>
 <li>使用BD脊髓穿刺针将150 mM KCl溶液反向填充至碳纤维工作微电极中。随后插入导线（Squires Electronics，Cornelius，俄勒冈州），并通过鳄鱼夹连接至低噪声ChemClamp恒电位仪（Dagan Corporations，明尼阿波利斯，明尼苏达州）的前置放大器。工作电极放置于距离双极刺激电极约100–200 μm处，并深入脑片约75 μm。</li>
 <li>通过刺激电极施加单次（单相，350 μA，60 Hz，脉宽4 ms）或多次（例如5个脉冲，350 μA，20 Hz，脉宽4 ms）电刺激，以诱发神经递质释放3。</li>
 <li>为利用FSCV测量电刺激诱发的多巴胺释放，需向电极施加三角波形电压。典型的多巴胺检测参数如下：碳纤维微电极电位相对于Ag/AgCl参比电极维持在-0.4 V，线性扫描至+1.2 V正向极限，再返回-0.4 V，扫描速率为400 V/s。</li>
 <li>每5分钟对脑片进行一次电刺激，并持续记录15秒的伏安法信号以检测多巴胺释放。</li>
 <li>在获得至少三次稳定的电刺激诱发多巴胺释放记录（峰值高度差异<10%）后，以1 mL/min流速向脑片灌流含有目标药理学试剂的aCSF，持续30分钟以达到最大效应。在药理学灌流期间，每5分钟进行一次电刺激并记录多巴胺释放信号。</li>
</ol>
4. 数据分析
从脑片记录得到的电流-时间曲线可通过非线性回归拟合为一组基于米氏方程的公式，如Wightman及其同事在使用LabVIEW软件（National Instruments, Austin, TX）编写的程序中所述。 4-6在该软件中，可通过调整两个参数 V 和时间来拟合电流随时间变化的曲线。最大 （nM/s；对应于多巴胺转运体的摄取速率，由曲线下降相显示）和每次脉冲的多巴胺浓度（nM；对应于峰高最大值）。Km 值，反映多巴胺与多巴胺转运体的亲和力，设定为 160 nM 且保持不变。拟合前需输入实验后确定的电极校准后系数。LabView 软件包含决定系数（R2) 参数以确定拟合优度（R2 数值 &gt; 0.8 被使用）。
5. 代表性结果
采用快速扫描循环伏安法（FSCV）检测小鼠尾状壳核（CPu）、伏隔核（NAc）核心区及NAc壳区中单脉冲电刺激诱导的多巴胺释放与再摄取。图1A所示代表性结果为电流（或浓度）随时间变化的曲线图。红色箭头指示对脑片施加电刺激的时刻，随后在碳纤维微电极处因多巴胺浓度变化而引起电流相应上升。电刺激期间主要发生多巴胺释放过程，但其他过程如再摄取和扩散也会影响观测到的峰值高度。峰值下降阶段主要归因于多巴胺转运体对神经递质的再摄取，因为此时神经元刺激已经停止7。然而，峰值衰减不仅限于再摄取过程，扩散和代谢也参与了电流的下降。已有研究推测，由于电化学测量的时间尺度为数秒量级，FSCV的时间分辨率过快，难以检测到代谢过程的贡献7。在这些电流-时间曲线中，纵轴通过实验后校准因子转换为浓度（μM）。图1A插图为对应电流-时间曲线经背景扣除后的循环伏安图。将测得的电流（纵轴）对施加于电极的电位（横轴）作图，可化学鉴定多巴胺：相对于Ag/AgCl参比电极，在+0.6 V处观察到氧化峰，而在-0.2 V处观察到多巴胺邻醌的相应还原峰。数据的第三种呈现方式为三维伪彩色图（图1B），整合了电流-时间曲线与循环伏安图的信息，形成单一图像。在代表性伪彩色图中，横轴表示时间（秒），纵轴表示施加于碳纤维工作微电极的电压，电流则以假彩色形式表示（z轴）。由于碳纤维微电极尺寸较小（直径约7 μm），可在纹状体的不同解剖区域（CPu、NAc核心区与NAc壳区）分别检测电刺激诱导的多巴胺动态变化（图2）。
使用纹状体冠状切片的一个优势在于，它消除了多巴胺能神经元胞体的贡献，从而能够研究突触前多巴胺的动力学变化。如其他研究已表明的，突触前对多巴胺释放和再摄取的调控并不仅限于多巴胺自身受体或转运体的功能16, 17。其他神经递质系统的异源受体也能调节多巴胺的动力学18, 19。图3A所示的典型电流-时间曲线显示，当切片用1 μM的喹吡罗（D2/D3受体激动剂）处理30分钟后，电刺激诱发的多巴胺释放量减少。相反，当以甲基苯丙胺等多巴胺转运体底物灌流切片30分钟时，多巴胺释放未见明显变化（图3B）。其峰值衰减速率向右偏移，这通常与多巴胺转运体动力学参数（Km）的改变相关3。最后，图3C为切片在100 ng/mL脑源性神经营养因子（BDNF）溶液中孵育后的典型电流-时间曲线，已有研究假说认为BDNF可影响多巴胺释放的动力学特征20, 21。从该代表性曲线可见，BDNF能够增强电刺激诱发的多巴胺释放。综上所述，这些药理学处理手段突显了快速扫描循环伏安法（FSCV）在探究纹状体内多巴胺动力学方面的应用价值。
使用脑片通过快速扫描循环伏安法（FSCV）研究突触前多巴胺动态的主要局限性在于，完整大脑中的神经环路已被破坏。在脑片FSCV中，无法研究来自其他脑区的神经递质的影响，因而难以理解这些系统对所研究脑区（例如纹状体）功能的作用，也无法评估非刺激状态下的多巴胺水平。然而，近年来FSCV技术的进步已实现在自由活动的大鼠中检测多巴胺瞬时变化（无论是否施加电刺激），以响应药理学干预、自我给药或新奇刺激22 - 24。总体而言，脑片FSCV为突触前多巴胺动态提供了重要信息，将脑片FSCV结果与微透析、电生理学和/或自由活动状态下的FSCV等互补性神经化学技术相结合，可更全面地揭示大脑中神经递质的功能机制。
<img alt="使用伏安法图谱分析尾状壳核：电流与电位关系图。" src="/files/ftp_upload/3464/3464fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1. 采用FSCV技术测量C57Bl/6J小鼠背侧CPu脑片中单脉冲刺激后电刺激诱发的多巴胺释放。（A）多巴胺释放的浓度-时间曲线，其中单次电脉冲（红色箭头）诱发多巴胺释放。单星号*表示导致浓度上升的因素，主要为多巴胺释放，但摄取和扩散也有贡献；双星号**表示信号峰值恢复至基线水平，主要归因于多巴胺摄取，扩散亦有作用。插图显示相应的循环伏安图谱。（B）来自背侧CPu的代表性彩色图谱，显示时间（x轴）、施加于碳纤维微电极相对于Ag/AgCl参比电极的电位（y轴）以及以伪彩色表示的电流强度。
<img alt="Electrochemical analysis; voltammetry graphs; NAc core/shell; potential vs. Ag/AgCl; current data." src="/files/ftp_upload/3464/3464fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 在C57Bl/6J小鼠的伏隔核（NAc）核心部与壳部中，由单次电刺激脉冲（红色箭头所示）诱发的多巴胺释放。（A和C）伏隔核核心部与壳部的浓度-时间曲线及其相应的循环伏安图（插图）。（B和D）如前所述，伏隔核核心部与壳部的代表性彩色图谱。
<img alt="神经递质释放图；喹吡罗、甲基苯丙胺、BDNF 的作用；基线比较" src="/files/ftp_upload/3464/3464fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3. 脑片经药物处理 30 分钟后的代表性记录；所有情况下均使用单脉冲刺激诱发尾壳核（CPu）中的多巴胺释放。（A）多巴胺 D2 受体激动剂喹吡罗（红色迹线）与处理前（黑色迹线）的比较。（B）甲基苯丙胺灌注（紫色迹线）与处理前（黑色迹线）的比较。（C）脑源性神经营养因子（BDNF）对多巴胺动态的影响（蓝色迹线）与处理前（黑色迹线）的比较。

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<li>Paredes, D., Grnaholm, A. C., Bickford, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+NGF+and+BDNF+on+baseline+glutamate+and+dopamine+release+in+the+hippocampal+formation+of+the+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of NGF and BDNF on baseline glutamate and dopamine release in the hippocampal formation of the adult rat.</a> Brain. Res. 11141, 56-64 (2007).</li>
<li>Goggi, J., Puller, I. A., Carney, S. L., Bradford, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+pathways+involved+in+the+short-term+potentiation+of+dopamine+release+by+BDNF%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res%22%5BJournal%5D)">Signalling pathways involved in the short-term potentiation of dopamine release by BDNF.</a> Brain. Res. 968, 156-161 (2003).</li>
<li>Cheer, J. F., Wassum, K. M., Heien, M. L., Phillips, P. E., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoids+enhance+subsecond+doapmine+relese+in+the+nucleus+accumbens+of+awake+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cannabinoids enhance subsecond doapmine relese in the nucleus accumbens of awake rats.</a> J. Neurosci. 24, 4393-4400 (2004).</li>
<li>Phillips, P. E., Stuber, G. D., Heien, M. L., Wightman, R. M., Carelli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsecond+dopamine+release+promotes+cocaine+seeking%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Subsecond dopamine release promotes cocaine seeking.</a> Nature. 422, 614-618 (2003).</li>
<li>Robinson, D. L., Heien, M. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+of+dopamine+concentration+transients+increases+in+dorsal+and+ventral+striatum+of+male+rats+duing+introduction+of+conspecifics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Frequency of dopamine concentration transients increases in dorsal and ventral striatum of male rats duing introduction of conspecifics.</a> J. Neurosci. 22, 10477-10486 (2002).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文所述方案演示了如何制备和使用小鼠冠状脑切片进行FSCV实验。尽管该方法主要用于获取和测量多巴胺动态变化，但其他神经递质如腺苷、过氧化氢、去甲肾上腺素和5-羟色胺也已通过FSCV在体（in vivo）或离体（in vitro）条件下实现监测3, 8 - 11。通过简单调整施加于工作电极的电压波形，FSCV即可用于监测其中部分其他神经化学物质3, 11。由于这些神经化学物质中的许多具有相似的氧化电位，所生成的循环伏安图可为每种可氧化物质提供独特的化学指纹图谱，从而实现化学物质的鉴定。此外，FSCV已在多种物种中得到应用，从果蝇到非人灵长类动物，以更深入地理解这些模式生物中的神经传递过程12 - 15。FSCV之所以能在如此多样的物种中被广泛应用，主要原因之一在于碳纤维微电极的直径极小，通常小于7 μm。因此，这些微电极能够从非常微小的环境中取样，例如果蝇脑组织（纳升级体积），或在较大物种中区分精细的亚解剖区域，如伏隔核（NAc）的核心区与壳区12-14。
综上...

<table><tbody><tr><td>氯化钾</td><td>Fisher Scientific</td><td>7447407</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>EMD Millipore</td><td>7647145</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Fisher Scientific</td><td>7791186</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Fisher Scientific</td><td>10035048</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>EMD Millipore</td><td>144558</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>EMD Millipore</td><td>7558794</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>50997</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>50817</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>57501</td><td></td></tr><tr><td>碳纤维</td><td>Goodfellow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>A-M Systems</td><td>602000</td><td></td></tr><tr><td>银丝</td><td>A-M Systems</td><td>787000</td><td></td></tr><tr><td>钨刺激电极</td><td>Plastics One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>铂丝</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>导线</td><td>Squires Electronics, Cornelius, OR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Loctite 404 瞬干胶</td><td>Hankal Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>剃刀刀片</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD 脊髓穿刺针</td><td>BD Biosciences</td><td>REF 405234</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>Feather Safety Razor Co, Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TH 软件</td><td>ESA Inc.,Chelmsford, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>浸入式记录室</td><td>Custom Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://digitimer.com/products/neurolog-system/" target="_blank"&gt;Neorolog 刺激隔离器&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.digitimer.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Digitimer Ltd.</a></td><td>&lt;a href="http://digitimer.com/products/neurolog-system/stimulator-modules/digitimer-nl800a-part-neurolog-system/" target="_blank"&gt;NL800A&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>自动温度控制器</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜 (SZX7)&lt;strong&gt;&lt;/strong&gt;</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome 3000 切片系统</td><td>St. Louis , MO.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>灌流泵</td><td>Watson-Marlow Pumps Group</td><td>H110708</td><td></td></tr><tr><td>微电极拉制仪</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChemClamp 恒电位仪</td><td>Dagan Corporations</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

采用快速扫描循环伏安法检测纹状体脑切片中的突触前多巴胺动态变化

Presynaptic Dopamine Dynamics in Striatal Brain Slices with Fast-scan Cyclic Voltammetry

大量研究集中于神经递质多巴胺，因其在滥用药物（如可卡因和苯丙胺）作用机制中的重要性，其在精神疾病（如精神分裂症和注意缺陷多动障碍）中的作用，以及其在帕金森病和亨廷顿病等退行性疾病中的参与。在正常的生理条件下，多巴胺已知可调节运动活动、认知、学习、情绪影响以及神经内分泌激素的分泌。多巴胺神经元密度最高的区域之一是纹状体，该区域可分为两个不同的神经解剖学区域，即伏隔核和尾状壳核。本实验的目的是展示在小鼠纹状体中进行脑片快速扫描循环伏安法（FSCV）的一般实验方案。FSCV 是一种明确的电化学技术，能够在特定脑区实时测量多巴胺的释放与摄取。在 FSCV 中使用碳纤维微电极（直径约 7 μm）来检测多巴胺的氧化。利用 FSCV 检测多巴胺的分析优势在于其高达 100 毫秒的时间分辨率和小于十微米的空间分辨率，可为 in vivo 微透析提供互补信息。

利用快速扫描循环伏安法测量纹状体脑片中电刺激诱发的突触前多巴胺动态变化。

大量研究聚焦于神经递质多巴胺，因其在滥用药物（如可卡因和...）作用机制中的重要性

本实验的总体目标是展示一种用于脑片快速扫描循环伏安遥测的通用方案。该方案首先对脑组织进行冠状切片前处理，然后将电极放置于特定的目标脑区。下一步是通过电极以三角波形式施加电压，以检测多巴胺。最后，将感兴趣的药理学试剂施加于脑切片，并观察其对突触前多巴胺动态的影响。最终，该方案可揭示突触前多巴胺动态的变化，例如通过快速扫描循环伏安法检测到的刺激诱导多巴胺释放及多巴胺摄取速率的变化。尽管该方法可用于研究突触前多巴胺动态，但也同样适用于其他系统，包括动物和神经递质，例如大鼠和果蝇，以及血清素和去甲肾上腺素。演示该实验操作的人员为 Francis Mena、MEA Khalid 和 Erin oo，他们是我实验室的研究生。根据随附的手稿开始此操作：配制三种类型的人工脑脊液溶液，即用于伏安法记录的蔗糖型 A-CSF 溶液，以及用于电极校准的改良型 A-CSF 溶液。接下来，将 10 毫升蔗糖 A-CSF 溶液转移至一个小烧杯中，并将其放入冰桶内。然后将瞬干胶（Loctite）也置于冰桶中。随后，用酒精棉片擦拭剃刀刀片以及解剖所需工具（如镊子、刮匙和剪刀），进行准备。然后通过断头法处死一只小鼠，并迅速取出其大脑。将大脑置于含有冰冻蔗糖人工脑脊液（A CSF）的烧杯中，放置约10分钟。在此期间，准备将VIBRAM进行切片。在标本槽中放入一些碎冰，然后将标本盒放入Vibram中并牢固固定。在样本室周围添加更多冰块以填满空隙，并确保冰块不会进入室内。随后，将清洁的刀片放入刀架中。然后用冰冷的蔗糖人工脑脊液填充样本室。随后，将一些冰冷的蔗糖A型脑脊液倒在倒置培养皿中的一张纸巾上。用镊子将 freshly dissected 小鼠脑组织转移至其上。然后用刀片沿中侧轴切开，去除小脑。这将形成一个平整的基底，可将其固定在Vibram平台上。接下来，在样本台上滴加一滴Loctite胶水。立即将已制备脑组织的平整端固定在台面上，并尽可能保持其直立状态。然后将载物台放入样本室，并拧紧螺丝。确保脑组织完全浸没在样本室内的蔗糖人工脑脊液中。接着，使用控制器调节载物台，使剃刀刀片与脑组织顶部对齐。通过将振动频率和速度设置为低档，可获得振动切片机的最佳参数。接着，将切片厚度设为400微米。最初的几片切片通常不包含纹状体。重复切片，直至获得包含纹状体的切片。一旦到达纹状体AAL区域，使用画笔将切片提起并置于含有充氧室温人工脑脊液（CSF）的烧杯中。通常，可获得包含尾状壳核复合体（caudate putamen）和伏隔核（nucleus accumbens）的三到四个脑片。将脑片置于持续通入95% O₂和5% CO₂混合气体的人工脑脊液（A CSF）中，在室温下孵育至少一小时，使其充分适应环境，然后再进行实验。开始该操作时，将管路连接至浸没式记录室。然后以每分钟1毫升的流速泵入含氧的室温人工脑脊液（A CSF）。当人工脑脊液充满自制的脑片孵育槽后，将温度控制器设定为32摄氏度。使用针头注射器去除金属网下方的任何气泡。使用注射器在流出管路中产生负压，以启动液体流动并控制缓冲液溢出。将一片Kim擦拭纸放在切片固定器的边缘，作为吸水灯芯。然后将一片脑片转移至记录室中的切片固定器内，记录室持续灌流室温的含氧人工脑脊液（ACSF）。将银/氯化银参比电极浸入切片孵育槽中，并用鳄鱼夹将其连接到前置放大器。将碳纤维微电极固定在显微操作器上，并用鳄鱼夹将其连接到前置放大器。接着，将钨刺激电极和碳纤维微电极 lowered 至脑片表面。刺激电极将用于向脑片传递单次脉冲或多次电刺激脉冲，以诱发神经递质释放，从而通过快速扫描循环伏安法（FSCV）测量电刺激诱发的多巴胺信号。对电极施加三角波形电压，将碳纤维微电极的电位维持在负0.4伏，然后将其 ramp 至正向极限1.2伏。然后以每秒400伏的扫描速率将其电位重新降至负0.4伏。每5分钟刺激一次脑片，并在至少三次稳定的电刺激多巴胺释放记录（定义为峰高差异小于10%）之后，每次持续15秒，对所引起的多巴胺FLX进行体积测量。以每分钟1毫升的流速灌注含有目标药理学试剂的脑脊液30分钟，以获得与基线记录相似的最大效应。在药理学灌注期间，每5分钟进行一次电刺激，以诱导多巴胺释放。图A为使用FSCV技术在尾状壳核中单脉冲刺激后，电刺激诱导的多巴胺释放测量示例。图B显示了一个三维伪彩色图，该图整合了电流-时间曲线和循环伏安图（cyclic voltammogram）的双重信息。类似地，图A和图C分别展示了在伏隔核核心部和壳部通过单次电刺激脉冲诱发的多巴胺释放，而伏隔核核心部和壳部的三维伪彩色图则分别显示在图B和图D中。此处展示的是脑片经药物处理30分钟后，再施加单脉冲刺激以诱发尾状壳核中多巴胺释放的代表性记录轨迹。实验中使用的试剂包括喹啉、甲基苯丙胺和脑源性神经营养因子。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备小鼠冠状脑切片，以利用快速扫描循环伏安法获取并测量突触前多巴胺动态变化。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

突触前多巴胺纹状体脑片的快速扫描循环伏安动态

一种利用荧光多巴胺类似物光学测量神经传递的新方法。...

在单个突触前末梢通过FFN可视化多巴胺释放

安培法通过检测多巴胺自发氧化产生的氧化电流，来测量单个细胞释放的多巴胺。同时采用电压钳制与安培法技术，可揭示多巴胺转运体的整体“活性”与其对多巴胺逆向转运调控作用之间的机制关系。...

同时进行电压钳制与安培法的单细胞多巴胺释放测量

本视频展示了在麻醉大鼠中植入电极和套管，以使用恒电位仪测量伏隔核中的多巴胺释放，并通过向腹侧被盖区输注药物来调节多巴胺能活性。...

通过VTA多巴胺能神经元受体操控的大鼠模型监测多巴胺释放

细胞外多巴胺（DA）的快速波动介导了哺乳动物的奖赏处理和动机行为。本文描述了快速扫描循环伏安法（FSCV）与口腔内呈味物质给予相结合的方法，用于研究呈味物质如何改变清醒自由活动大鼠中多巴胺的快速释放。...

清醒大鼠经口给予味觉刺激物期间利用快速扫描循环伏安法检测多巴胺快速动态变化

快速扫描循环伏安法可用于在药物、疾病及其他实验干预条件下监测体内多巴胺神经传递。本研究介绍了QNsim1.0软件的使用方法，该软件基于定量神经生物学模型，用于模拟电刺激诱导的多巴胺反应，以量化估算多巴胺的释放与再摄取动力学参数。...

使用 QNsim1.0 对电刺激多巴胺神经传递的快速扫描循环伏安法数据进行建模

本实验方案的目的是直接操控腹侧被盖区受体，以研究其对次秒级多巴胺释放的贡献。...

联合灌注与刺激结合快速扫描循环伏安法（CIS-FSCV）评估腹侧被盖区受体对时相性多巴胺的调控

本报告展示了一种机械分离单个有活性神经元的技术，该神经元保留了附着的突触前末梢。经振动解离获得的神经元具有制备快速、药理学控制优良以及在无邻近细胞干扰的情况下改善空间钳制的优点。该方法可用于突触结构的成像及膜片钳记录。...

从啮齿类动物脑片中振动解离神经元以研究突触传递和成像突触前终末

研究神经元雪崩（即具有时空尺度不变性的活动爆发）的一种可靠方法，可反映大脑皮层中临界状态动力学特征。在培养的皮层浅层发育过程中，雪崩会自发出现，从而可在精确控制的条件下，利用平面集成多电极阵列（MEA）对神经活动进行长期测量。...

器官型培养中神经元雪崩的多电极阵列记录

可通过电化学阻抗谱（EIS）和循环伏安法（CV）表征神经记录电极的电极-组织界面。施加电压偏置可改变电极-组织界面的电化学特性，并可能提升记录能力。电压偏置、EIS、CV...

神经接口的电压偏置、循环伏安法与电化学阻抗谱

配对记录是指对两个突触连接的神经元同时进行全细胞膜片钳记录，从而能够精确地表征单个神经元之间突触的电生理学和药理学特性。本文详细描述了在具备电生理学实验条件的任何实验室中，于海马脑片组织培养上建立该技术的具体方法和所需条件。...

器官型海马切片中的成对全细胞记录

学习使用快速扫描循环伏安法测量纹状体脑片中的突触前多巴胺动态变化。该方法通过电刺激诱发多巴胺释放并记录摄取速率，为神经药理学研究提供可靠的实时检测手段。

采用快速扫描循环伏安法检测纹状体脑切片中的突触前多巴胺动态变化

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