Name: Application de la MassSQUIRM pour des mesures quantitatives de lactivité Déméthylase Lysine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Apprenez à quantifier l'activité déméthylase de la lysine par spectrométrie de masse MALDI et marquage isotopique. Cette méthode MassSQUIRM permet d'étudier la dynamique de la méthylation lysine dans les systèmes biologiques.

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Nous tenons à remercier le Fonds pour l&#39;UAMS protéomique pour le soutien par spectrométrie de masse. Le financement de ce projet a été fourni par des subventions du NIH P20RR015569, P20RR016460 et R01DA025755.

Ce protocole est modifié de Blair et al. 6. 1. LSD1 Assay déméthylation <ol><li> Dans un volume final de 20 ul, mélanger 125 ng LSD1 recombinant avec 0,25 pg di-méthyl histone H3 peptide (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotine) dans un tampon déméthylase (50 mM Tris-Cl pH 8,5, KCl 50 mM, 5 mM MgCl 2, 5% glycérol). En outre, d&#39;effectuer un contrôle peptide seul, sans enzyme. Le contrôle est de la section 3 et n&#39;a pas besoin de méthylation réductrice. </li><li> Incuber pendant 2 heures à 37 ° C. </li><li> Pour recueillir les peptides, ajouter 8 ul POROS perles R2 microns de 20 à chaque échantillon et agiter pendant 15 minutes à température ambiante. Préparer perles POROS en suspendant 1 volume de perles avec 1 volume de méthanol, puis ajouter 10 volumes d&#39;acide formique à 5% / TFA 0,2%. </li><li> Condition deux C 18 ZipTips par aspiration 20 pl de TFA 0,1% dans la pointe et le repoussant avec une pipette. Pour ce faire, deux fois avec T 0,1%FA, quatre fois avec de l&#39;acétonitrile 70% / TFA 0,1%, et quatre fois encore avec 0,1% de TFA. </li><li> Chargez les deux échantillons (contrôle et la réaction déméthylase) sur les C 18 climatisées ZipTips par pipetage la bouillie bourrelet derrière la résine C 18 dans les ZipTips et en poussant le volume à travers avec une pipette. </li><li> Laver deux fois avec 20 ZipTips ul de 0,1% de TFA. </li><li> Eluer dans 40 uL d&#39;acétonitrile 70% / 0,1% de TFA. </li><li> Lyophiliser chaque éluant complètement avec un concentrateur SpeedVac. </li></ol> 2. Méthylation réductrice Cette partie du protocole est modifié de Blair et al. Et Rayment et al. 6,7. <ol><li> Re-suspendre la réaction déméthylase dans 100 ul de tampon phosphate 50 mM, pH 7,4. </li><li> Pour la réaction déméthylase, ajouter 8 pi de 15 mg / ml de borane diméthylamine. Borane diméthylamine est dissous dans un tampon phosphate 50 mM, pH 7,4, pour donner 15 mg / ml solution stock.Cela devrait être fait frais. </li><li> Pour la réaction déméthylase, ajouter 16 ul de 250 mM de formaldéhyde deutéré. Les 250 mM de formaldéhyde deutéré est préparé en diluant le stock en H 2 0. Cela devrait être fait frais. </li><li> Incuber à 4 ° C pendant 2 heures. </li><li> Répétez les étapes 2.2, 2.3 et 2.4. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.2. </li><li> Incuber à 4 ° C pendant environ 15 heures. </li><li> Pour l&#39;échantillon déméthylase, ajouter 12,5 ul de Tris 1M, pH 7,4 pour étancher la réaction de méthylation réductrice. </li></ol> 3. Spectrométrie de masse MALDI <ol><li> Ajouter POROS perles R2 microns 20 à la réaction déméthylase, et de recueillir sur ZipTips tel que décrit dans les étapes 1.3-1.6. </li></ol> Remarque: Re-suspendre le contrôle dans 100 ul de tampon phosphate 50 mM, pH 7,4 et traiter comme l&#39;autre échantillon de départ à l&#39;étape 3.1. <ol start="2"><li> Éluer le contrôle et les échantillons de réaction déméthylase des ZipTips sur une plaque échantillon MALDI l&#39;aide de 2 ul de 33% de saturerd acide 2,5-dihydroxybenzoïque. Pour préparer les 33% d&#39;acide 2,5-dihydroxybenzoïque, préparer une solution saturée de 2,5-dihydroxybenzoïque dans l&#39;acétonitrile 70% / 0,1% de TFA, puis diluer à 33% de graisses saturées dans l&#39;acétonitrile 70% / 0,1% de TFA. Laisser les échantillons élués à sécher et à se cristalliser. </li><li> Recueillir des spectres de masse en utilisant un spectromètre de masse MALDI-PerkinElmerSciex prOTOF ou disponibles en haute résolution de masse MALDI spectromètre de 8,9,10. </li><li> Voir spectres et d&#39;extraire les zones de pointe utilisant PerkinElmerSciex TOFworks logiciel ou logiciel fourni par le fabricant spectromètre de masse. </li><li> Vérifiez les produits de réaction par la SP 2 avec un système de masse disponible par spectrométrie de masse en tandem offrant des capacités de spectrométrie. </li></ol> 4. Analyse des données <ol><li> Afin de compenser pour le chevauchement des isotopes créés à l&#39;aide de formaldéhyde lourde (figure 1B), de déterminer l&#39;aire du pic (A) ratio de 13 C 2 et C 13 relativ 4 isotopese au pic monoisotopique pour l&#39;échantillon de contrôle, qui n&#39;a pas subi de méthylation réductrice (fig. 2A). Eq 1: Un 13C2 / A 12C = r 1 Eq 2: Un 13C4 / A 12C = r 2 Cela vous donnera le rapport de peptide existant dans ces États isotopique (r 1 &amp; r 2) spécifique à votre expérience et spectromètre de masse. </li><li> Utilisez le r 1 &amp; r 2 valeurs dans les formules suivantes pour mesurer la quantité relative de peptide existant dans chaque état ​​de modification de l&#39;échantillon de réaction déméthylase (Fig. 2B): Eq 3: H3K4me2 = A 1 Eq 4: H3K4me = A 2 - r 1 (A 1) Eq 5: H3K4 = A 3 - r 2 (1 A) - [r 1 (A 2 - r 1 (A 1))] </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Utilisation LSD1, nous montrons l&#39;efficacité de MassSQUIRM pour quantifierdéméthylation lysine. Comme décrit dans la section Texte protocole, nous avons effectué un test avec 125 ng déméthylase de LSD1 et 0,25 pg di-méthyl histone H3 peptide (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotine). Le contrôle et des échantillons de réaction déméthylase ont été soumis à une méthylation réductrice et spectrométrie de masse MALDI. La réaction de contrôle qui n&#39;a pas subi de méthylation réductrice a montré l&#39;enveloppe typique isotopique pour ce peptide et à condition domaines de pointe pour les équations 1 et 2 (figure 2A). Le spectre de masse pour la réaction déméthylase fourni domaines de pointe pour les équations 3-5 (figure 2B). Utilisation des aires des pics de la commande et la réaction déméthylase, on a déterminé que le peptide LSD1 déméthylé pour donner les produits de réaction suivants: 33,7% de di-méthyl lysine 4, 42,3% de mono-méthyl lysine 4, et 24% non méthylé Lys 4. Reportez-vous à Blair et al. Pour l&#39;analyse complète de l&#39;activité déméthylase LSD1 ainsi que 6 études inhibiteurs. Notez que les variables telles que l&#39;évolution des temps de réaction, une enzymela concentration de concentration et le substrat sera de permettre une analyse en profondeur de l&#39;activité. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3604/3604fig1.jpg" /> Figure 1. Aperçu MassSQUIRM. (A) un peptide N-terminal de l&#39;histone H3 est représentée comme étant non-(vert), mono-(rouge), ou di-(bleu) méthylé en lysine 4. Variation de la composition chimique de chaque peptide conduit à l&#39;ionisation différentielle rendant complexe la quantification. (B) méthylation réductrice convertit tous les résidus lysine à l&#39;état di-méthyl qui provoque tous les peptides pour ioniser la même façon. L&#39;utilisation de formaldéhyde lourde dans la réaction de méthylation réductrice permet la rétention de l&#39;identité de la méthylation d&#39;origine. Les cercles ouverts indiquent la méthylation de lumière tandis que les cercles fermés indiquent méthylation lourde. Modification de Blair et al. 2011 6. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3604/3604fig2.jpg" /> Figure 2. MassSQUIRM peut être utilisée pour quantifier de façon différentielle peptides méthylés. (A) une di-méthylé synthétique histone H3 peptide (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotine) est analysé par spectrométrie de masse et le ratio de pointe par rapport à la crête monoisotopique ont été noté que r 1 et r 2 dans les équations 1 et 2. (B) Le peptide synthétique même a été incubé avec LSD1 ng 125 dans un tampon de déméthylase pour deux heures à 37 ° C. Les échantillons ont été ensuite soumis à l&#39;analyse MassSQUIRM. Une population mixte de chevauchement des pics représente trois états de méthylation différentes comme on le voit dans la figure 1B. Domaines relevant des pics mono isotopiques ont été notés comme A 1, A 2 et A 3. Domaines de pointe ont été utilisées dans les équations 3-5. Les cercles ouverts indiquent la méthylation de lumière tandis que les cercles fermés indiquent méthylation lourde. Modification de Blair et al. 2011 6.

<ol><li>Goldberg, A. D., Allis, C. D., Bernstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%3A+a+landscape+takes+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epigenetics: a landscape takes shape.</a> Cell. 128, 635-638 (2007).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Blair, L. P., Cao, J., Zou, M. R., Sayegh, J., Yan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+Regulation+by+Lysine+Demethylase+5+%28KDM5%29+Enzymes+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Epigenetic Regulation by Lysine Demethylase 5 (KDM5) Enzymes in Cancer.</a> Cancers (Basel). 3, 1383-1404 (2011).</li>
<li>Cole, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+probes+for+histone-modifying+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical probes for histone-modifying enzymes.</a> Nat. Chem. Biol. 4, 590-597 (2008).</li>
<li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+demethylation+mediated+by+the+nuclear+amine+oxidase+homolog+LSD1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.</a> Cell. 119, 941-953 (2004).</li>
<li>Blair, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MassSQUIRM%3A+An+assay+for+quantitative+measurement+of+lysine+demethylase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">MassSQUIRM: An assay for quantitative measurement of lysine demethylase activity.</a> Epigenetics. 6, 490-499 (2011).</li>
<li>Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+myosin+subfragment-1%3A+a+molecular+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor.</a> Science. 261, 50-508 (1993).</li>
<li>Collom, S. L., Jamakhandi, A. P., Tackett, A. J., Radominska-Pandya, A., Miller, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CYP2E1+active+site+residues+in+substrate+recognition+sequence+5+identified+by+photoaffinity+labeling+and+homology+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">CYP2E1 active site residues in substrate recognition sequence 5 identified by photoaffinity labeling and homology modeling.</a> Arch. Biochem. Biophys. 459, 59-69 (2007).</li>
<li>Gradolatto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+Yta7+Regulates+Histone+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae Yta7 Regulates Histone Gene Expression.</a> Genetics. 179, 291-304 (2008).</li>
<li>Taverna, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yng1+PHD+finger+binding+to+histone+H3+trimethylated+at+lysine+4+promotes+NuA3+HAT+activity+at+Lysine+14+of+H3+and+transcripiton+at+a+subset+of+targeted+ORFs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Yng1 PHD finger binding to histone H3 trimethylated at lysine 4 promotes NuA3 HAT activity at Lysine 14 of H3 and transcripiton at a subset of targeted ORFs.</a> Mol. Cell. 24, 785-796 (2006).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

MassSQUIRM est une méthode peu coûteuse et quantitative pour l&#39;analyse détaillée de l&#39;activité de déméthylases lysine impliqués dans les mono-et di-méthylation. MassSQUIRM offre quantification non seulement du produit de la réaction, mais aussi pour les produits intermédiaires. Ce test peut être utilisé comme un outil puissant pour étudier le mécanisme de LSD1 et autres déméthylases histones. Il sera également utile pour classer les nombreuses enzymes nouvellement découverts déméthylase lysine comme PHF8 et pour...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> LSD1 </td><td> BPS Biosciences </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> H3K4me2-biotine peptide </td><td> préparés à l&#39;interne </td><td> aucun </td></tr><tr><td> POROS R2 20 perles micron </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-1129-06 </td></tr><tr><td> C 18 ZipTip </td><td> Millipore </td><td> ZTC18M </td></tr><tr><td> L&#39;acide trifluoroacétique (TFA) </td><td> Thermo </td><td> 28904 </td></tr><tr><td> acétonitrile </td><td> Pêcheur </td><td> A996 </td></tr><tr><td> Acide 2,5-dihydroxybenzoïque </td><td> Sigma </td><td> 85707 </td></tr><tr><td> Borane diméthylamine </td><td> Sigma </td><td> 180238 </td></tr><tr><td> isotopiquement lourd d 2-formaldéhyde </td><td> Cambridge Isotope Laboratories </td&gt; <td> DLM-805-20 </td></tr><tr><td> Tris </td><td> Pêcheur </td><td> BP154 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Pêcheur </td><td> BP366 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Pêcheur </td><td> BP214 </td></tr><tr><td> Glycérol </td><td> Pêcheur </td><td> G33 </td></tr><tr><td> L&#39;acide formique </td><td> Fluka </td><td> 06440 </td></tr><tr><td> Le méthanol </td><td> Pêcheur </td><td> A452 </td></tr><tr><td> Phosphate de Na </td><td> Pêcheur </td><td> BP329 </td></tr><tr><td> Concentrateur SpeedVac </td><td> Savant </td><td> DNA110 </td></tr><tr><td> MALDI-prOTOF spectromètre de masse et TOFworks logiciels </td><td> PerkinElmerSciex </td><td> aucun </td></tr></tbody></table>

application de la masssquirm pour des mesures quantitatives de l&#39;activité déméthylase lysine

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Récemment, les régulateurs épigénétiques ont été découverts comme des acteurs clés dans de nombreuses maladies différentes 1-3. En conséquence, ces enzymes sont des cibles de choix pour les études de petites molécules et 4 développement des médicaments. De nombreux régulateurs épigénétiques n&#39;ont été que récemment découvert et sont encore en train d&#39;être classés. Parmi ces enzymes sont déméthylases lysine qui éliminent des groupes méthyle de lysines sur les histones et autres protéines. En raison de la nature de cette nouvelle classe d&#39;enzymes, des dosages peu ont été développés pour étudier leur activité. Cela a été un barrage routier à la fois la classification et l&#39;étude à haut débit de déméthylases histones. Actuellement, des essais déméthylase il existe très peu. Celles qui existent ont tendance à être de nature qualitative et ne peut pas simultanément discerner entre les différents états de méthylation de lysine (non, mono-, di-et tri-). La spectrométrie de masse est couramment utilisé pour déterminer l&#39;activité déméthylase, mais de masse actuels dosages par spectrométrie de fairepas non plus si les peptides différentiellement méthylés ioniser différemment. Ionisation différentielle de peptides méthylés permet de comparer les états de méthylation difficile et certainement pas quantitative (figure 1A). Ainsi des essais disponibles ne sont pas optimisés pour l&#39;analyse complète de l&#39;activité déméthylase. Nous décrivons ici une méthode appelée MassSQUIRM (masse quantification par spectrométrie isotopique utilisant méthylation réductrice) qui est basé sur la méthylation réductrice de groupes amine avec le formaldéhyde deutéré pour forcer tous les lysines être di-méthylé, ce qui les rend essentiellement les mêmes espèces chimiques et donc ioniser l&#39; même (figure 1B). La différence chimique seulement après la méthylation réductrice est de l&#39;hydrogène et de deutérium, qui n&#39;affecte pas l&#39;efficacité d&#39;ionisation MALDI. Le dosage MassSQUIRM est spécifique pour les produits de réaction avec déméthylase lysines non, mono-ou di-méthylés. Le dosage est également applicable aux méthyltransférases lysine donnant la SAmoi produits de réaction. Ici, nous utilisons une combinaison de la chimie méthylation réductrice et spectrométrie de masse MALDI pour mesurer l&#39;activité de LSD1, une déméthylase lysine capable d&#39;éliminer di-et mono-méthyle, sur un substrat peptide synthétique 5. Ce test est simple et facile de les faire n&#39;importe quel laboratoire d&#39;avoir accès à un spectromètre de masse MALDI dans le laboratoire ou par l&#39;intermédiaire d&#39;une installation protéomique. L&#39;essai a ~ 8 fois la plage dynamique et est facilement extensible à 5 format de plaque.

Nous présentons une méthode pour l&#39;utilisation de la spectrométrie de masse MALDI et de la chimie méthylation réductrice pour quantifier les changements dans la méthylation de la lysine.

Application de la MassSQUIRM pour des mesures quantitatives de l&#39;activité Déméthylase Lysine

Récemment, des régulateurs épigénétiques ont été identifiés comme des acteurs clés dans de nombreuses maladies différentes 1-3. Par conséquent, ces enzymes constituent des cibles privilégiées pour de petites ...

Le protocole mass squirm vise à quantifier l'activité de la lysine déméthylase en utilisant la méthylation isotopique et la spectrométrie de masse MALDI. Commencez par réaliser des réactions de déméthylation catalysées par des enzymes sur des peptides contenant de la lysine méthylée. Ensuite, méthylez chimiquement les produits peptidiques de la réaction de déméthylase avec du formaldéhyde deutéré afin d'obtenir des peptides uniformément méthylés qui s'ionisent de la même manière par MALDI. Puis, quantifiez chaque espèce peptidique par spectrométrie de masse en mode multiple et tenez compte du recouvrement isotopique. Afin d'identifier les quantités relatives de peptides non, mono, di et triméthylés, les résultats du mass squirm déterminent les quantités relatives de chaque produit de la réaction de déméthylase en fonction des variations de masse.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la spectrométrie de masse classique sur moisissures, réside dans le fait que le score de masse tient compte des différences d'ionisation entre les peptides différemment méthylés. Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette approche lorsque nous avons

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Méthodes d’identification des résonances RMN de l’amine 13C-diméthyl N-terminale sur des protéines méthylées de manière réductrice

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Application de la MassSQUIRM pour des mesures quantitatives de l'activité Déméthylase Lysine

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