Name: 从查明的神经元和取食行为的钙信号的同时记录果蝇 /em (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: 学习利用钙成像技术同时记录果蝇神经元活动与取食行为的方法。该方法通过监测喙伸展反应，帮助研究人员在Drosophila melanogaster中研究神经机制与行为关联。

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感谢 L Watanabe、M Gorczyca 和 Yoshihara 实验室其他成员提供的有益评论和讨论。感谢 K. Scott 和 L. Looger 提供果蝇品系，感谢 S Yokoyama 演示实验操作，Shinya Iguchi 提供技术协助，以及 Nobuko Yoshihara 提供材料信息。本研究得到了美国国家心理健康研究所资助 MH85958 和 Worcester 基金会资助的支持，资助对象为 M.Y。

1. 构建FLIES
<ol>
	<li>通过熔化35 mm Falcon培养皿盖的侧壁，并将其塑造成适当的角度和厚度，制成一个平台（图1a；图2）。在平台上钻一个孔，用于固定果蝇头部（图1a,b），使口器部分可自由暴露于腔室外部（图1a）。剪裁Pipetman吸头末端，使其尺寸与待观察的果蝇相匹配。将吸头粘接到平台上，如图1a所示，完成FLIES装置的制作（图2）。</li>
</ol>
2. 准备观察果蝇
<ol>
	<li>若需饥饿处理，在实验前于 25 °C 下将成年果蝇置于仅含湿润滤纸的试剂管中饥饿 24 小时。</li>
	<li>将果蝇放入一个置于冰上的 15 ml 塑料离心管中，使其麻醉。</li>
	<li>使用镊子将果蝇插入 FLIES 装置的腔室中，并轻轻推入果蝇直至其无法移动，然后插入塞子以固定果蝇。（图 1a,b）。</li>
	<li>将吻部（喙）近端周围部分与孔的内边缘密封；从外部在喙的侧面及上方涂抹少量光固化胶（Tetric EvoFlow）（图 3 中箭头所示）。同时从 FLIES 装置内部在头部背侧与孔内边缘之间的空隙处涂抹胶水（图 1b）。为使喙能够自由活动，应使用睫毛（或类似物）小心涂抹胶水，避免胶水接触喙部。最后，使用足以固化的最弱蓝光照射固化胶水，以避免过热对果蝇造成损伤。随后移除塞子。</li>
	<li>可使用一根细线将喙部部分提起（图 3 中箭头所示），以稳定果蝇头部，防止咽部碰撞到亚食道神经节（SOG），并暴露 SOG 的腹侧区域，尤其是在对 Gr5a 神经元的突触前末梢进行成像时8，因为当喙完全回缩时，部分咽部会覆盖这些结构。</li>
	<li>用不含糖的生理盐水填充平台表面，其成分为（单位：mM）：NaCl, 140；KCl, 2；MgCl2, 4.5；CaCl2, 1.5；HEPES-NaOH, 5，pH 值为 7.110。该无蔗糖生理盐水的渗透压与常用的含蔗糖生理盐水（如 HL3.111）相似。</li>
	<li>使用钨制刀片和尖端磨成剪刀状的镊子打开头壳，该工具为日本 Dr. Kageyuki Yamaoka 定制设计，用于剪除表皮和气管，以暴露亚食道神经节（SOG）（图 4）。头壳的腹侧边缘应尽可能靠腹侧剪开，而背侧边缘的切割则相对不关键。首先使用钨制刀片切开后缘，然后用磨尖的镊子剪开侧缘和前缘。用镊子将剪下的头壳碎片提起并移除。使用磨尖的镊子切除触角及触角神经。</li>
	<li>为避免记录过程中出现运动伪影，需通过去除果蝇的某些组织来稳定脑部。首先选择性地去除 SOG 与表皮之间的气囊。在食道通向咽部的一端以及进入 SOG 的一端进行剪切，以切断咽部与脑之间的连接。然后拉出肌肉 1612，最后分离连接脑与表皮的所有气管。</li>
	<li>我们将 FLIES 装置置于连接旋转盘共聚焦显微镜系统（Improvision，PerkinElmer）的 Olympus BX51WI 显微镜载物台上（图 5）。将水浸物镜（例如 40X/0.8 N.A）浸入浴液中（图 6）。</li>
</ol>
3. 脑组织的 Ca2+ 成像
<ol>
	<li>使用GCaMP3.01, 9进行Ca2+成像，实验方法依据Marella et al.8建立的方案（图6）。采用转盘共聚焦显微镜（Improvision），利用Velocity软件（版本4.3，Improvision），在感兴趣区域（如运动神经元或中间神经元的胞体，或味觉感觉神经元的突触前末梢）进行成像，以491 nm激发激光，以4 Hz频率采集单层光学切片，曝光时间为122 ms。</li>
</ol>
4. 刺激喙
<ol>
	<li>用带有小灯芯（由日本和纸制成，参见特定试剂表）从针尖端伸出的皮下注射针吸取100 mM的水溶液蔗糖（图7）。</li>
	<li>将少量蔗糖溶液滴加到灯芯上，随即吸入，然后立即将浸润的和纸灯芯接触喙的尖端。为避免饱食效应，和纸灯芯仅需瞬时接触（图8）。在进行Ca2+成像的同时，使用连接在解剖显微镜上的CCD相机监测喙伸展反应（PER）行为（图5）。由于在此条件下PER反应无法维持超过一小时，因此所有数据必须在解剖开始后一小时内采集完毕。</li>
</ol>
5. 代表性结果
已有研究报道，喙部伸肌（负责抬起喙部以实现喙管伸出的一对主要肌肉）的运动神经元对甜味刺激表现出显著反应13。图9展示了通过Gal4驱动子E4913表达GCaMP3.01, 9，记录到的运动神经元胞体中的Ca2+信号。如视频所示，Ca2+信号升高时同步观察到了显著的喙管伸展反射（PER）。
<img alt="果蝇解剖装置示意图，侧视图和顶视图，腔室角度，角质层去除，实验方法。" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 果蝇脑活体成像与电生理记录平台（FLIES）示意图。a，FLIES 的设计使得腔壁角度允许果蝇头部笔直伸出。果蝇喙的三个部分用不同颜色标记；其中喙管为品红色。使用镊子将果蝇插入腔室，并用剪下的 Pipetman 吸头末端塞住腔室后部，防止果蝇逃出。b，钻孔需与果蝇头部形状匹配。如图所示，剩余缝隙用光固化胶密封，以确保无泄漏。待胶水固化后，移除作为塞子的 Pipetman 吸头。将生理盐水注入 FLIES，使脑组织表面完全浸没。应确保无盐水泄漏至果蝇头部前端。图中 b 面板中虚线包围的阴影区域表示需要解剖去除的部分。
<img alt="带有胶墙的果蝇实验装置，行为观察实验，昆虫学研究。" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. FLIES 装置的照片。 由胶枪形成的半月形胶墙用于在灌流过程中控制盐溶液的流动，并减少盐溶液的使用量。
<img alt="昆虫头部固定、胶水使用、显微图像、昆虫学研究、标本制备。" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 在FLIES装置中固定的果蝇的正面视图。 该图像展示了果蝇如何被安置在FLIES装置中，以及光固化胶水如何围绕果蝇头部（箭头所示）涂抹，以形成防止盐溶液渗漏的密封。如果盐溶液渗入果蝇的喙部，则实验将失败。连接在载物台上的细线（箭头头所示）用于固定喙部位置，防止其完全回缩，否则会遮挡腹侧的咽下神经节（SOG）并引起运动伪影。
<img alt="果蝇头部解剖图；标注了触角叶、食道和腹侧神经节；用于教育目的。" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 解剖后果蝇的俯视图（FLIES）。 本图像显示去除体壁后暴露的果蝇腹侧神经节（SOG）。同时已移除食道、第16号肌肉以及与脑连接的气管和部分气囊，以避免其对脑组织造成干扰，从而防止钙信号中出现伪影。
<img alt="用于PER和果蝇标本分析的共聚焦显微镜装置，配备体视显微镜和CCD相机。" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图5"> 
图5. 监测装置。 该装置由一台Olympus BX51WI显微镜连接转盘共聚焦显微镜系统（Improvision）以及一台侧向安装的Nikon SMZ800显微镜组装而成。此配置可在PER行为期间实现对脑部活动的活体成像。
<img alt="使用40倍水浸物镜在生理盐水中观察果蝇腔室的显微镜装置。" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"> 
图6. 显示FLIES侧面视图的照片。 一层薄薄的生理盐水夹在40倍水浸物镜与果蝇之间。
<img alt="自折叠聚合物条示意图及显微镜图像；干燥与湿润状态下的结构转变。" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 7"> 
图 7. 制作和纸灯芯的示意图。 甘皮和纸是一种传统的日本羊皮纸，极薄且表面光滑（日本日原）。它还具有很高的强度，并能保留大量液体。和纸必须被裁剪成具有特定尺寸的梯形：宽度分别为 0.3 mm 和 0.7 mm，长度为 4–5 mm（a）。然后将该梯形从 0.7 mm 的一侧插入 23 G 注射针针尖，并可通过插入一根弯成 V 形的昆虫针来固定其位置（b）。c，和纸在接触液体后会变得透明，因此非常适合本实验使用。
<img alt="用于光子学研究中光学激发和发射分析的显微镜装置。" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 8"> 
图 8. 使用 Washi-wick 刺激 FLIES 上的喙。 将皮下注射针尖端的 Washi 纸芯通过操纵杆装置，用一只手瞬时施加刺激。针头通过一根柔性管连接至注射器，注射器由另一只手操控，用于吸取和释放蔗糖溶液。
<img alt="细胞反应的荧光显微镜观察；图示刺激前/后的图像及结果图。" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig9.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 9"> 
图9. 代表性结果。a，通过体视显微镜上安装的CCD相机记录的PER行为。饥饿果蝇在刺激前、刺激时和刺激后（箭头所示为伸展的喙），使用含有100 mM蔗糖水溶液的棉芯进行刺激（箭头指示）。照明由用于GCaMP荧光的491 nm激光完成。b，饥饿状态下喙肌伸肌运动神经元中蔗糖诱导的GCaMP 3.0反应。上图：刺激前；下图：刺激后立即成像。比例尺：10 μm。c，蔗糖诱导的GCaMP 3.0反应的定量分析。该运动神经元对蔗糖刺激表现出荧光信号的急剧上升，随后在数秒内恢复至基线水平。

<ol><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).</li>
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</ol>

本人无任何利益冲突可披露。

FLIES 技术可实现 Ca2+ 信号与 PER 行为的同步记录。即使脑组织暴露于生理盐水中，仍能观察到正常的 PER 行为。使用 Gampi-Washi 芯条替代原始毛细管方法中所用的 Kimwipe 芯条，有助于获得高度可重复且稳定的 PER 行为，同时避免了制备和挑选优质 Kimwipe 芯条所需的技术训练。上述实验要点使我们能够有效避免喙部运动带来的干扰，从而实现低噪声、高度稳定的 Ca2+ 信号记录。偶尔，组织清除不充分会导致细胞暴露不完全或运动抑制不足，进而影响实验结果。然而，一旦操作熟练，超过 80% 的样本制备均可获得良好结果。该方法不仅适用于 Ca2+ 成像，还可推广至在观察 PER 行为的同时进行的任何活体成像实验。例如，可通过电极接触任意细胞以直接记录其电活动。结合双光子激发显微镜，我们能够对突触结构进行时间序列成像，从而将其变化与行为改变相关联。因此，这种结合行为观察的脑成像方法不仅有助于神经网络功能的解析，还可作为研究突触可塑性14 与记忆机制之间关联的有力工具。

<table><tbody><tr><td>特里克 EvoFlow</td><td>义获嘉伟瓦登特</td><td>M04115</td><td>光固化胶</td></tr><tr><td>BX51WI 显微镜</td><td>奥林巴斯公司</td><td>BX51WI</td><td>配备 40X（数值孔径 0.8）水浸物镜</td></tr><tr><td>转盘共聚焦显微镜系统</td><td>珀金埃尔默公司</td><td></td><td>配备 491 nm 激光器</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>尼康仪器</td><td>SMZ-800</td><td>连接摆臂装置，可在视频录制时提供立体视觉</td></tr><tr><td>神子和纸</td><td>日本 Haibara</td><td></td><td>一种特殊的传统日本纸张</td></tr><tr><td>CCD 相机</td><td>成像源公司</td><td>DFK41AU02</td><td>1/2&quot; 1080 &amp;#215; 960 像素 SONY CCD</td></tr><tr><td>操纵杆操作器</td><td>成茂国际</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>显微注射仪</td><td>成茂国际</td><td>IM-5B</td><td></td></tr></tbody></table>

同时记录黑腹果蝇（drosophila melanogaster）中已鉴定神经元的钙信号与摄食行为

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

为了从行为功能的角度研究神经元网络，我们必须分析每种行为模式产生时神经元的活动方式。因此，同步记录神经元活动与行为对于关联脑活动与行为至关重要。在进行此类行为分析时，果蝇（Drosophila melanogaster）是一种常用的模式生物。 黑腹果蝇，使我们能够使用GCaMP等基因编码的钙指示剂1，以监测神经元活动，并利用复杂的遗传操作技术进行光遗传学或热遗传学干预，从而特异性地激活已鉴定的神经元2-5. 利用热遗传学技术，我们发现了对摄食行为至关重要的神经元（Flood 等，正在修订中）。作为摄食行为的主要部分，一个 果蝇 成虫伸出喙以进食6 （喙伸展反应；PER），对位于其喙或跗节上的感觉细胞所感知的甜味刺激产生反应。结合PER实验方案7 采用钙成像技术8 使用 GCaMP3.01, 9，我建立了一个实验系统，可同时监测摄食中枢——咽下神经节（suboesophageal ganglion, SOG）中神经元的活动以及喙的行为表现。我设计了一种装置（“果蝇脑活体成像与电生理记录平台”：“FLIES”），以适应 果蝇 成虫，使其喙能够自由活动，同时将其脑部暴露于浴液中以进行 Ca2+ 通过水浸物镜成像。FLIES 方法也适用于多种类型的果蝇脑部活体实验，例如电生理记录或突触形态的延时成像。由于活体成像结果可与同步的 PER 行为直接关联，该方法可为研究神经网络的信息处理机制，以及细胞活动如何与可塑性过程和记忆形成相耦合，提供一个优良的实验体系。

果蝇 Drosophila melanogaster 在其喙或跗节受到糖刺激时会伸展喙管以进行取食。我将喙管伸展反应（PER）的观察与钙成像技术相结合，从而能够在观察行为的同时监测脑内神经元的活动。

同时记录黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中已鉴定神经元的钙信号与摄食行为

要从行为功能的角度研究神经元网络，我们必须分析在每一种行为模式产生时神经元的运作方式。因此，……

本实验的总体目标是通过钙成像技术同步监测神经元活动与摄食行为。首先将一只果蝇置入果蝇实验装置中，随后解剖果蝇头部以暴露大脑。将带有解剖后果蝇的装置置于显微镜载物台上。该操作步骤的最后一步是用糖芯刺激 pro Bois。最终，可通过钙成像观察到特定神经元的激活，并通过行为录像记录 proboscis 的伸展，从而获得相关结果。我最初想到这种方法时，是受到了在水面上游动的水生啤酒虫复眼的启发。我们啤酒虫具有分裂的眼睛，能够同时看到水面之上和之下。我实验中的一个难点在于，大脑与SCUs彼此非常接近，但如果能像我们啤酒虫的眼睛那样巧妙地将它们分离开来，就可以在大脑暴露于卫星环境的同时，保持SCUs处于干燥状态。在SCU上方制作一个非常简单的隔板，以将干燥面与宽处隔开。通过熔化35毫米Falcon培养皿盖子的侧壁，并将其雕刻成适当的角度和厚度，从而形成一个平台。在平台上钻一个孔，用于固定果蝇头部，使口器部分能自由暴露在腔室外。将移液器吸头末端剪裁至刚好能容纳果蝇身体的宽度，然后将吸头粘接到平台上。在25摄氏度下将成年果蝇饥饿处理24小时后，用镊子将果蝇放入一个15毫升的塑料离心管中，并置于冰上使其麻醉。将一只果蝇插入果蝇实验腔室中，并轻轻推动果蝇直至其无法移动。使用睫毛或类似工具，将少量光固化胶水涂抹在喙或吻部的侧面及上方，将其近端周围的部位密封至孔的内边缘。同时，将胶水从果蝇内部涂抹至头部背侧与孔内边缘之间的空隙。最后，用足以固化的最弱蓝光照射胶水，以避免损伤果蝇。为了固定果蝇的头部并暴露腹侧的咽下神经节（SOG），用一根细线将吻部部分抬起并固定。将果蝇固定后，在平台表面加入不含蔗糖的生理盐水。使用钨丝刀和尖端锋利的镊子（我们称之为锋利镊子）切开头部外骨骼，以暴露咽下神经节（SOG）。Scis zips。这是对Scis zips的演示，通过切割Kimwipe中的一根纤维进行对比。首先在视野中使用虹膜剪刀进行操作，然后在1毫米刻度尺前进行。首先，使用钨丝刀片从后缘切开。然后用锋利的镊子剪开侧缘和前缘。用镊子夹起已切开的表皮碎片并将其移除。使用镊子剪断触角和触角神经。然后选择性地移除位于咽上神经节（SOG）与表皮之间的气囊，以稳定脑组织并防止运动伪影。接着，在食管通向咽部的一端以及通向咽上神经节（SOG）的一端分别进行剪切，以切断咽部与脑之间的连接。随后，在识别并分离出第16号肌肉后，去除连接脑部与体壁的任何气管。将果蝇置于旋转盘共聚焦显微镜的载物台上，切换至水浸物镜进行成像。然后使用491纳米激发激光，以122毫秒的曝光时间，以每秒四帧的速率对目标区域进行单层光学切片采集。使用带有少量日本纸作为灯芯的注射器针头，将灯芯从针头末端伸出，用于向果蝇提供蔗糖。将一小滴蔗糖溶液滴加到灯芯上，然后通过连接针头与注射器的柔性管路，使用操纵杆控制的注射器将溶液吸入。将浸湿的滤纸灯芯短暂接触探针尖端，仅需一瞬间，以避免饱和。在进行钙成像的同时，使用连接在解剖显微镜上的CCD相机监测PROBUS伸展反应或PER行为，并确保在解剖后一小时内完成数据采集。图中显示的是使用含 100 毫摩尔蔗糖的 WIC 刺激后，喙部缩肌运动神经元中典型的 prob Bois 突起反应。采用 491 纳米激光对 G CAMP 荧光进行水溶液成像。此处所示的行为反应前后同步钙成像，可直观呈现蔗糖诱导的运动神经元中 GAMP 3.0 对喙部缩肌的反应。在蔗糖诱导的GAMP 3.0反应的状态定量分析中，运动神经元对蔗糖刺激表现出荧光强度的急剧上升，随后在数秒内恢复至基线水平。该平台还可兼容其他方法，如电生理学、光遗传学或化学遗传学操作，或对神经元进行化学激活，以及对GFP标记的结构进行延时成像，从而回答更多科学问题，例如突触可塑性与记忆之间的关联。

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本方案描述了使用基因编码的Ca2+探针记录自由活动的Caenorhabditis...

行为动物中单个神经元的比率钙成像 秀丽隐杆线虫

本文介绍了一种可在果蝇（Drosophila）学习与记忆过程中可视化突触前和/或突触后钙信号的实验方案。该方法结合了定位于突触的钙离子传感器进行活体钙成像，并采用经典的嗅觉条件化范式，从而能够揭示此类联想学习背后的突触可塑性机制。...

在体光学钙成像观察学习诱导的突触可塑性在 Drosophila melanogaster 中的研究

在此，我们介绍一种实验方案 离体 在表达GCaMP6的成年个体中进行钙成像 果蝇 以监测癫痫样活动。该方案为研究成人中的发作事件提供了一种有价值的工具 果蝇 通过 离体...

Ex Vivo 钙成像用于癫痫的Drosophila模型

学习利用钙成像技术同时记录果蝇神经元活动与取食行为的方法。该方法通过监测喙伸展反应，帮助研究人员在Drosophila melanogaster中研究神经机制与行为关联。

同时记录黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中已鉴定神经元的钙信号与摄食行为

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