从查明的神经元和取食行为的钙信号的同时记录果蝇

Motojiro Yoshihara

Department of Neurobiology, University of Massachusetts Medical School

1。构建苍蝇

1. 塑造一个平台，从35毫米猎鹰盘的盖子融化侧壁和雕刻，形成一个适当的角度和厚度（ 图1a，图2）。钻一个洞，在这个平台上接受苍蝇头（ 图1A，B），这样的口器自由地接触到外面室（ 图1a）。削减的Pipetman尖底，与大小匹配飞待观察。胶尖在图1a所示的平台完成的苍蝇（ 图2）。

2。准备观察粉煤灰，

1. 挨饿24小时的成年果蝇在25°C间事先放置在一个小瓶只用湿纸巾，如果饥饿是必要的实验。
2. 麻醉由放置在15毫升塑料管站在冰上飞。
3. 使用镊子，插入室的苍蝇苍蝇，轻轻一推在飞，直到它无法动弹。然后，插入一个插件保留的苍蝇。 （ 图1A，B）。
4. 近端长鼻（主席台）孔的内边缘密封周边配件;应用少量的光固化胶（EvoFlow Tetric）双方从主席台上方的外（ 图3中的箭头）。也适用于胶从里面的苍蝇头背侧部分和孔的内边缘（ 图1b）之间的空间。允许讲台上自由移动，应小心，以防止任何触摸主席台上，通过使用睫毛（或相媲美的东西）传播胶水胶水。最后，治愈与蓝色光固化过多的热量，以避免损坏飞足够的光照最弱的胶水。删除插件。
5. 一个线程持有的部分解除了讲台上（ 图3中的箭头），可以采用稳定苍蝇“避免磕碰的咽的一部分，特别一次过拨款及特别一次过拨款的腹侧部分，揭露，尤其是成像突触前末梢神经元Gr5a ^8，长鼻完全缩回时咽的一部分，这是由覆盖头部。
6. 填补了无糖盐水含（毫米）：氯化钠，140平台的表面;氯化钾，2 4.5 _氯化镁 ， _氯化钙 ，1.5和肝素钠的氢氧化钠，pH值7.1 ¹⁰ 5。这种无蔗糖的生理盐水，也有类似的强壮那些常用的蔗糖含salines如HL3.1 ^11。
7. 打开头壳使用削尖的秘诀，如剪刀，这是一个定制的设备和设计最初是由博士，日本，景行山冈夹角质层及气管暴露SOG（ 图4）钨刀片和镊子。头部的角质层腹侧边缘尽可能削减腹，背边割而不是作为关键。首先，通过一个切口使用钨刀片后缘。然后，穿过侧面和使用削尖钳前边缘。切角质层件应解除与镊子和删除。应触角和触角神经切断由削尖钳。
8. 为了避免在录音移动文物，大脑必须稳定通过清除苍蝇的某些部分。首先，有选择性地删除假手术和表皮之间的空气袋。在年底向咽部及特别一次过拨款，以清除咽部和大脑之间的连接在年底削减食道。然后拉出肌肉16 ^12，最后，分离气管连接大脑和角质层。
9. 奥林巴斯显微镜BX51WI连接到一个旋转盘共聚焦显微镜系统（Improvision在珀金埃尔默）（ 图5）上的阶段，我们建立我们的苍蝇。一个水浸泡镜片，如40X/0.8 NA，浸入浴（ 图6

3。的Ca ^{2 +}的脑成像

1. ^钙离子成像使用GCaMP3.0 ^1，9，玛蕊乐等建立的方法。（ 图6）。使用旋转盘共聚焦显微镜（Improvision），在4Hz的一个单一的光学部分使用491nm激发激光122ms曝光时间，重点在该地区的利益（运动神经元的细胞体或中间神经突触前末梢味觉的感觉神经元）与速度的软件，VER。 4.3（Improvision）。

4。刺激的长鼻

1. 小灯芯从尖（ 图7）凸出（从日本和纸，见特定试剂表 ）到一个注射器针头吸100MM水蔗糖溶液。
2. 放电到灯芯的小水滴的蔗糖溶液，然后，吸它，立即江前ê申请浸泡和纸纸灯芯喙尖。和纸灯芯只应适用于瞬间，以避免饱食（ 图8）。监测的长鼻扩展响应（PER）的行为，使用CCD相机连接到一个解剖显微镜（ 图5），同时与Ca ^{2 +}成像。数据必须在一小时内开始后剥离，因为每个反应不能维持一个多小时，在这些条件下。

5。代表结果

在主席台量角器，一双的负责解除长鼻延伸主席台的主要肌肉，运动神经元已显示强大的¹³甜刺激的反应。，通过GCaMP3.0 ^{1 9} 图9所示的Ca ^{2 +}信号表示加仑4驱动，E49 ^13，从运动神经元的细胞体。如图所示，在视频，robuST每增加的Ca ^{2 +}信号的同步观测。

图1。苍蝇的大脑实时成像和电生理阶段（苍蝇）的示意图。 ，苍蝇建墙的角度，允许苍蝇头走出来直。飞长鼻三段彩色编码;主席台是洋红色。孔飞用钳子插入室，从一个Pipetman尖底切下一块是插入室，以阻止苍蝇逃跑的背面，B，无聊符合苍蝇的头。余下的差距与光固化胶密封的指示，以确保没有泄漏。胶水固化后，作为一个插件Pipetman尖被删除。生理盐水倒入苍蝇等，完全覆盖大脑表面。有没有盐水泄漏，应确保ING，到年底前的苍蝇头。在B组的虚线包围的阴影区域显示部分被解剖。

图2。苍蝇的照片。胶水状的月牙墙（从胶枪）是由控制盐水灌注过程中的流动，减少使用量的生理盐水。

图3。安装在苍蝇苍蝇的正面视图。此图像显示了一只苍蝇，苍蝇如何，以及如何应用光固化胶头的苍蝇（箭头）创建生理盐水证明印章周围。如果通过飞长鼻任何盐水泄漏，则实验会失败。拴在舞台上的线程（箭头）举行的长鼻位置，所以它不是完全retrac特德。否则，它会阻碍更多的腹侧部分的特别一次过拨款，并导致移动文物。

图4。与解剖苍蝇苍蝇的顶视图。此图像显示了苍蝇以下角质层去除暴露的特别一次过拨款。 16食道，肌肉和气管连接到大脑，以及选定的空气，麻袋也被删除，以防止他们扰乱大脑，从而导致钙信号文物。

图5。该仪器的监测仪器。BX51WI连接到一个旋转盘共聚焦显微镜系统（Improvision）奥林巴斯显微镜组装，边安装尼康SMZ800显微镜。此设置允许在每实时成像大脑活动的行为。

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图6。照片显示的苍蝇侧视。盐水之间夹着一层薄薄的40X水浸泡的镜头和苍蝇。

图7。示意图和纸灯芯雁皮和纸是日本传统的羊皮纸，是非常薄而光滑（灰原，日本）。它也是非常强，可以保留大量的液体。必须和纸剪成一个梯形，非常具体的尺寸，0.3毫米和0.7毫米，宽度和长度4-5毫米（ 一 ）。这梯形然后插入到了23政注射器针头尖端从0.7毫米方，也可以通过插入昆虫的脚，弯曲V形（二）稳定，C，和纸变成透明以下曝光液体，使这个实验的理想选择。

图8。天鹰，灯芯苍蝇长鼻刺激。在一个注射器针头尖端和纸灯芯一方面用操纵杆操纵即时申请。针是通过软管连接用另一只手操纵的注射器，抽吸和排放的蔗糖溶液。

图9。有代表性的成果。 ，每行为记录通过安装在立体显微镜的CCD相机。一个饥饿的苍蝇正面意见与扩展长鼻（箭头）在刺激之前的刺激，刺激后，用含有100毫米蔗糖水溶液（箭头）灯芯。照明是通过491纳米激光用于荧光，B为GCaMP蔗糖诱导GCaMP的运动神经元在主席台肌肉处于饥饿状态的量角器3.0响应。刺激前面板，底部面板后，立即刺激。比例尺，10微米，C，量化的蔗糖诱导GCaMP的3.0响应的。运动神经元响应蔗糖刺激，随后的几秒钟的恢复阶段的底线在荧光急剧增加。