Name: Reprogramação de células somáticas humanas em células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando vetor retroviral com GFP (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Aprenda a gerar células-tronco pluripotentes induzidas humanas usando vetores retrovirais com GFP. Este método permite identificar colônias iPSC pela perda de fluorescência e validar marcadores de pluripotência.

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Este trabalho foi financiado pela Yale School of Medicine e Prêmio Criança Pesquisa em Saúde da Fundação Charles capa.

1. Reprogramação por retrovírus Expressando Fatores Reprogramação <ol><li> Fibroblastos humanos são cultivados em meio de fibroblastos (10% de FBS em meio DMEM com Pen / Strep). </li><li> Um dia antes da infecção, placa de 1x10 5 fibroblastos humanos em um poço de uma placa de 6 poços. </li><li> Aspirar meio para remover células mortas e adicionar 2 ml de meio de fibroblastos fresco. Adicionar sulfato de protamina, na concentração final de 5 ug / ml. </li><li> Adicionar cuidadosamente a quantidade apropriada de cada vírus GFP-expressando o que corresponde a uma multiplicidade de infecção (MOI) 5 5. </li><li> Um dia após a infecção, remover o sobrenadante viral, lavar três vezes com 2 ml de PBS, em seguida, adicionar 2 ml médio de fibroblastos. </li><li> Três dias após a infecção, verifique a fluorescência da GFP e repor o bem com 2 ml meio de fibroblastos. </li><li> Quatro dias após a infecção, placa de 1x10 cm 4/2, de fibroblasto do rato irradiado embrionário (MEFs) células de alimentação, em meio de fibroblastos para um10-cm placa de Petri revestidas com 0,1% de gelatina. Incubar a 37 ° C durante a noite. </li><li> Cinco dias após a infecção, separar fibroblastos humanos infectados com 1 ml de 0,05% typsin / EDTA durante 5 minutos a 37 ° C, e centrifuga-se durante 5 minutos a 200 g. Aspirar o meio e ressuspender as células com 10 ml de meio de fibroblastos. Transferir as células em uma placa pré-revestida 10-cm. </li><li> Após 24 horas, substituir o meio com meio de cultura hESC (20% de substituição knock-out soro, DMEM/F12, 0,1 ml Non-aminoácidos essenciais, 4 ng / ml de bFGF, Pen / Strep / glutamato, beta merceptoethanol-). Alterar a média diária. ESC-colônias, como vão começar a aparecer durante o dia 20-27 após a infecção. </li></ol> 2. Isolamento e Expansão das iPSCs <ol><li> Sob um microscópio de fluorescência, para verificar a ausência de GFP fluorescência em uma colónia que mostra uma morfologia semelhante à hESCs. </li><li> Usando uma pipeta de 10 ul, escolha colônias individuais da IPSC e colocá-los em um poço de uma gelatina e MEF-coated placa 12 poços e suplementado com meio de hESC. Alterar média diária. </li><li> Para passaging, lavar a placa com 1 ml de DMEM/F12, em seguida, adicionar 0,5 ml de colagenase, e incubar durante 10 minutos a 37 ° C. </li><li> Lave as células duas vezes com DMEM/F12. </li><li> Adicionar 2 ml de meio fresco hESC. Usando um levantador célula, romper as colónias em pedaços pequenos e separar células restantes a partir da placa. </li><li> Transfira os pedaços de colónias ressuspensos em um poço de uma gelatina, e MEF-revestido placa de 6 poços. </li></ol> 3. Análise de marcadores de imunofluorescência pluripotentes <ol><li> Lave as células três vezes com PBS e fixar com paraformaldeído a 4% durante 20 min à temperatura ambiente. </li><li> Suavemente lavar as células três vezes com PBS e permeabilizar com 0,2% de Triton X-100 em PBS durante 30 min. </li><li> Bloquear a ligação não específica através da incubação de células com BSA a 3% em PBS durante duas horas. </li><li> Incubar as células com anticorpo primário durante a noite a 4 ° C. </li> &lt;li&gt; Lave as células três vezes com PBS e incubar as células com anticorpo secundário específico para uma hora à temperatura ambiente, protegendo da luz. </li><li> Lave as células três vezes com PBS e DAPI extra durante a última lavagem, seguido por incubação à temperatura ambiente durante 5 minutos. </li><li> Detectar a coloração com um microscópio de fluorescência. </li></ol> 4. Quantitativo em tempo real PCR para os marcadores pluripotentes <ol><li> Isolar o RNA total a partir dos derivados de humanos iPSCs fibroblastos humanos usando o kit Qiagen RNeasy do. </li><li> Sintetizar o cDNA fita-primeiro usando SuperScript Transcriptase Reversa II. </li><li> Execute qPCR para detectar genes de pluripotência usando primers previamente relatados. 6 </li></ol> 5. Os resultados representativos <ol><li> Mudança morfológica durante a reprogramação Nós fibroblastos humanos infectados BJ1 e Detroit 551 com um coquetel de retrovírus que transportam Oct4, Sox2, KLF4 e MYC,e foram capazes de detectar alterações morfológicas durante reprogramação (Figura 1). Vinte e um dias após a infecção, reconhecemos pequenas colónias IPSC pela sua morfologia hESC-like. Além disso, reconhecemos iPSCs pela fluorescência da GFP. As células estaminais pluripotentes, tais como CES e iPSCs, expressam a maquinaria molecular para reprimir a expressão do gene proviral 7-9. O nosso vector retroviral única expressa GFP em conjunto com genes de reprogramação por LTR retroviral. Assim, as células que expressam GFP continuamente são considerados expressar transgenes sem silenciamento do gene proviral. Fielmente reprogramadas colónias IPSC que adquirem a rede pluripotência molecular mostram a ausência de expressão da GFP (Figura 2) 10. </li><li> Caracterização da pluripotência das iPSCs humanos Analisou-se as colónias derivadas de Detroit-551 fibroblastos através imuno-histoquímica com Tra-1-81, Tra-1-60, SSEA-4, SSEA-3, Oct4 e anticorpos NANOG ( <strong&gt; Tabela 2). IPSCs com sucesso reprogramadas expressar todos estes marcadores (Figura 3A). Foram também analisadas a expressão do gene através de análise quantitativa de RT-PCR. Observou-se que a expressão de Oct4, SOX2, KLF4, myc e NANOG foi significativamente aumentada em comparação com as células de fibroblasto parental mas em proporção com a de H9 hESCs (Figura 3B). </li></ol><img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3804/3804fig1.jpg" /> Figura 1. As alterações morfológicas de retrovírus infectados fibroblastos humanos. (AD) mudança morfológica Progressive em colônias de Detroit-551 fibroblastos infectados com fatores de reprogramação. Dia 5 (A), Dia 10 (B), Dia 14 (C), dia 21 (D). As células mostram a morfologia hESC-like após 21 dias. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3804/3804fig2.jpg" /> Figura 2. Representante expressão da GFP fluorescente em células submetidas a reprogramação. </strong&gt; BJ e Detroit 551 fibroblastos foram infectadas com retrovírus expressando quatro factores de reprogramação 4, e incubadas em meio hESC durante quatro semanas. Fibroblastos BJ (A, B) e Detroit 551 (C, D) mostram semelhante morfológica. A partir do dia 21 de colônias GFP negativos começam a se formar, que representam as iPSCs de boa-fé 10. (E, F) mostram transformada Detroit 551 células que não tenham sido submetidos a reprogramação adequada. (A, C, E) colónias sob visão de contraste de fase. (B, D) adequadamente reprogramado células que mostram o silenciamento GFP. (F) expressão GFP brilhante de colônia transformada. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3804/3804fig3.jpg" /> Figura 3. Caracterização das células estaminais pluripotentes induzidas. (A) colónias Humanos 551-IPS-K1 de células expressam marcadores comuns para as células pluripotentes. Coloração DAPI indica o teor total de células por campo. (B) quantitativa em tempo real-PCR (RT-qPCR) para a expressão de Oct4, SOX2, KLF4, myc em f parentalibroblast e 551-iPS-K1 iPSCs e H9 células estaminais embrionárias humanas (hESCs). Os dados foram normalizados contra β-actina gene de limpeza e traçada em relação ao nível de expressão nas células de fibroblasto parental 4.

<ol><li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations%3A+lessons+from+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132, 661-680 (2008).</li>
<li>Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J. L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G. A., Ruotti, V., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
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<li>Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 3, 1180-1186 (2008).</li>
<li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
<li>Hotta, A., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+vector+silencing+during+iPS+cell+induction%3A+an+epigenetic+beacon+that+signals+distinct+pluripotent+states%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Retroviral vector silencing during iPS cell induction: an epigenetic beacon that signals distinct pluripotent states.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 105, 940-948 (2008).</li>
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<li>Kim, D., Kim, C. H., Moon, J. I., Chung, Y. G., Chang, M. Y., Han, B. S., Ko, S., Yang, E., Cha, K. Y., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li>
<li>Warren, L., Manos, P. D., Ahfeldt, T., Loh, Y. H., Li, H., Lau, F., Ebina, W., Mandal, P. K., Smith, Z. D., Meissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+with+synthetic+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).</li>
<li>Ban, H., Nishishita, N., Fusaki, N., Tabata, T., Saeki, K., Shikamura, M., Takada, N., Inoue, M., Hasegawa, M., Kawamata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28iPSCs%29+by+temperature-sensitive+Sendai+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14234-14239 (2011).</li>
<li>Wolf, D., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM28+mediates+primer+binding+site-targeted+silencing+of+murine+leukemia+virus+in+embryonic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TRIM28 mediates primer binding site-targeted silencing of murine leukemia virus in embryonic cells.</a> Cell. 131, 46-57 (2007).</li>
<li>Park, I. H., Arora, N., Huo, H., Maherali, N., Ahfeldt, T., Shimamura, A., Lensch, M. W., Cowan, C., Hochedlinger, K., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134, 877-886 (2008).</li>
<li>Kim, K. Y., Hysolli, E., Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+maturation+defect+in+induced+pluripotent+stem+cells+from+patients+with+Rett+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neuronal maturation defect in induced pluripotent stem cells from patients with Rett syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14169-14174 (2011).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; Não temos nada a divulgar.</p

Expressão de quatro fatores de transcrição reprograma fibroblastos humanos para iPSCs. Muitas tentativas foram feitas para gerar iPSCs humanos utilizando abordagens não integradoras ou não-genética para gerar iPSCs clinicamente seguros. Até agora, esses métodos mostram eficiência extremamente baixa e exigem otimização para melhorar a reprodutibilidade 11-14. Métodos de retro-ou lentiviral são prontamente utilizados para obter e aplicar iPSCs para o homem em modelos de doenças in vitro,</...

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>11330057</td><td>80%</td></tr><tr><td>Substituto de Soro Knockout</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>20%</td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Aminoácidos Não Essenciais (10 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td>0,1 mM</td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapt&amp;#8211;etanol (14,3 M) ou MTG</td><td>Invitrogen</td><td>M-6250</td><td>0,1 mM</td></tr><tr><td>bFGF-2 10 &amp;mu;g/ml</td><td>GIBCO, da Life Technologies</td><td>GF003AF</td><td>4 ng/ml</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>EMD Millipore</td><td>15140-122</td><td>1%</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965118</td><td>90%</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10407028</td><td>10%</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>EMD Millipore</td><td>15140-122</td><td>1%</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 1. Meio de Cultura&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>OCT4</td><td>Abcam</td><td>Ab19857</td><td>1:500</td></tr><tr><td>SSEA3</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4303</td><td>1:100</td></tr><tr><td>SSEA4</td><td>BD Biosciences</td><td>BD560218</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Tra-1-81</td><td>BD Biosciences</td><td>BD560173</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Tra-1-60</td><td>BD Biosciences</td><td>BD560174</td><td>1:100</td></tr><tr><td>NANOG</td><td>Abcam</td><td>Ab21624</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Alexa-Flur 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Alexa-Flur 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>1:5000</td></tr><tr><td>pMIG-OCT4</td><td>Addgene</td><td>17225</td><td></td></tr><tr><td>pMIG-SOX2</td><td>Addgene</td><td>17226</td><td></td></tr><tr><td>pMIG-KLF4</td><td>Addgene</td><td>17227</td><td></td></tr><tr><td>pMIG-MYC</td><td>Addgene</td><td>18119</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase tipo IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104019</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>Gelatina, Suína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G 1890</td><td>0,1%</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td>0,2%</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47608</td><td>4%</td></tr><tr><td>BSA</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01800</td><td>3%</td></tr><tr><td>Células alimentadoras MEF</td><td>EMD Millipore</td><td>PMEF-N</td><td></td></tr><tr><td>Elevador de Células</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia de fluorescência: microscópio invertido com filtro GFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 2. Reagentes e equipamentos&lt;/strong&gt;</td></tr></tbody></table>

reprogramação de células somáticas humanas em células tronco pluripotentes induzidas (ipscs) usando vetor retroviral com gfp

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Células estaminais embrionárias humanas (hESCs) são pluripotentes e uma fonte de valor inestimável para celulares in vitro de modelagem de doenças e medicina regenerativa 1. Já foi demonstrado que as células somáticas humanas pode ser reprogramado para pluripotência pela expressão ectópica dos quatro fatores de transcrição (Oct4, Sox2, KLF4 e Myc) e tornar-se células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) 2-4. Como hESCs, iPSCs humanas são pluripotentes e uma fonte potencial de células autólogas. Aqui nós descrevemos o protocolo de reprogramar células de fibroblastos humanos, com os quatro fatores de reprogramação clonados em GFP contendo backbone retroviral 4. Usando o protocolo seguinte, geramos iPSCs humanos em 3-4 semanas sob condições de cultura humana ESC. Colónias humanos IPSC se assemelham hESCs na morfologia e exibir a perda de fluorescência da GFP como um resultado de silenciamento do transgene retroviral. IPSC colônias isoladas mecanicamente sob microscopia de fluorescênciaep comportar-se de uma maneira semelhante à hESCs. Nestas células, nós detectar a expressão de vários genes pluripotência e marcadores de superfície.

Um método para gerar células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) através de expressão retrovírus mediada ectópica de Oct4, SOX2, KLF4 e MYC é descrito. Uma maneira prática de identificar humanos colônias de IPSC com base na expressão de GFP também é discutida.

Reprogramação de células somáticas humanas em células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando vetor retroviral com GFP

As células-tronco embrionárias humanas (hESCs) são pluripotentes e representam fontes celulares inestimáveis para a modelagem de doenças in vitro e a medicina regenerativa1. Tem-se...

O objetivo geral deste procedimento é gerar células IPS humanas por meio da superexpressão mediada por retrovírus de OCT4, SOX2, KLF4 e c-Myc, utilizando um sistema repórter GFP. Isso é realizado primeiramente adicionando a quantidade apropriada de retrovírus individuais que expressam GFP. Em seguida, as células infectadas com o vírus que expressa GFP são transferidas para placas revestidas com gelatina 0,1% contendo fibroblastos embrionários de camundongo.O terceiro passo do procedimento é substituir o meio por meio de cultura de células-tronco embrionárias humanas. Por fim, colônias de IPS com silenciamento de GFP que apresentam morfologia semelhante à das células-tronco embrionárias humanas são isoladas. Em última análise, os resultados demonstram a expressão de marcadores pluripotentes endógenos por meio de coloração por imunofluorescência e R-T-Q-P-C-R.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a coloração vital com marcadores de superfície pluripotentes e a observação de alterações morfológicas, é o iPad desejável. As colônias celulares podem ser facilmente isoladas utilizando a perda da expressão de GFP como marcador para as células pluripotente

reprogramming-human-somatic-cells-into-induced-pluripotent-stem-cells

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Biology

Biologia

Este vídeo mostra o procedimento para gerar células-tronco pluripotentes induzidas usando lentivírus induzível que expressam Oct4, Sox2, c-Myc e KLF4.

Geração de iPS a partir de células MEFS através da expressão forçada de Sox-2, Oct-4, c-Myc e KLF4

O Stemgent induzível Dox Mouse Set Lentivirus TF pode reprogramar fibroblastos embrionárias de camundongos (MEFs) para pluripotentes induzidas da haste (iPS) células. Aqui demonstramos o protocolo para DOX induzível-expressão de fatores de reprogramação em ratos transcrição Oct4, Sox2, KLF4 e c-Myc para gerar colônias iPS que expressam marcadores comuns MES pluripotência.

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela reprogramação fibroblastos de rato embrionárias com um fator de transcrição Quatro, Doxiciclina induzível Sistema de Transdução Lentivirus

Nós demonstramos o protocolo para a geração de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de células somáticas humanas usando lentivírus mediada entrega dos fatores humanos Oct4, Sox2, Nanog e Lin28. Pluripotência foi confirmado pela morfologia e pela presença de tronco embrionárias (ES) de células específicas marcadores.

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela reprogramação fibroblastos humanos com o Lentivirus TF Stemgent Humanos Set

Apesar dos avanços recentes na modificação genética, transfecção de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) continua a ser um processo caprichoso. Para nosso conhecimento, métodos sistemáticos e eficiente para transfectar células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) não foram relatados. Aqui, descrevemos protocolos robustos de forma eficiente e transfectar nucleofect iPSCs humanos.

Transfectando e Nucleofecting células-tronco pluripotentes induzidas

Nós apresentamos um protocolo para a reprogramação eficiente de células somáticas humanas em células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSC) usando vetores retrovirais codificando OCT3 / 4, Sox2, KLF4 e c-myc (OSKM) e identificação de hiPSC corretamente reprogramado pela coloração ao vivo com tradi- 1-81 anticorpo.

Seleção e isolamento de colônias de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de fibroblastos adultos reprogramado

Aqui, apresentamos o nosso método estabelecido para reprogramar células somáticas humanas em iPSCs humanos sem transgene com o vírus Sendai, que mostra resultado consistente e maior eficiência.

Eficiente Geração induzida pelo homem células-tronco pluripotentes a partir de células somáticas humanas com Sendai-vírus

Descrevemos um protocolo para derivar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos livres de fatores reprogramadas e caracterizadas baseadas em lentivirais e conversão em condições putativas de grau clínico.

Derivação e Caracterização de um free-Transgene Human Induced Pluripotent Stem Cell Line e Conversão em Definidas condições clínicas de grau

A edição de genes mediada por TALEN no locus AAVS1 de porto seguro permite a adição de transgenes de alta eficiência em iPSCs humanas. Este protocolo descreve os procedimentos para preparar iPSCs para TALEN e entrega de vetor de doador, transfectar iPSCs e selecionar e isolar clones de iPSC para obter a integração direcionada de um gene GFP para gerar linhagens repórter.

Transfection, seleção e Colony-picking de induzidas pelo homem pluripotentes Células-Tronco TALEN-alvo com um gene GFP no AAVS1 Safe Harbor

Geração de células estaminais pluripotentes induzidas proporciona perspectivas fascinantes para a derivação de transplantes autólogos. No entanto, a progressão através de um estado pluripotente e trabalhoso re-diferenciação ainda dificulta a tradução clínica. Aqui nós descrevemos a derivação de fibroblastos humanos adultos ea sua conversão direta em células progenitoras neurais induzidos ea subsequente diferenciação em linhagens neuronais.

Derivação de adultos fibroblastos humanos e sua conversão direta em Expansível Neural células progenitoras

Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) representam uma fonte de tecidos específicos do paciente para aplicações clínicas e de pesquisa básica. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para reprogramar células humanas mononucleares do sangue periférico (PBMNCs) obtidos a partir de crostas inflamatórias congelados em iPSCs virais-livre usando não-integração plasmídeos epissomais.

Geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco Congelado Buffy Coats usando não-integração epissomais Plasmids

A reprogramação celular requer a introdução de genes-chave, que regulam e mantêm o estado celular pluripotente. O protocolo descrito permite a formação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) colônias de fibroblastos dérmicos humanos sem métodos virais/integradores, mas usando RNAs não modificados (NM-RNAs) combinados com fatores de evasão imunológica reduzindo os mecanismos de defesa celular.

Isolamento de fibroblastos dérmicos humanos adultos da pele abdominal e geração de células-tronco pluripotentes induzidas usando um método não integrador

Aprenda a gerar células-tronco pluripotentes induzidas humanas usando vetores retrovirais com GFP. Este método permite identificar colônias iPSC pela perda de fluorescência e validar marcadores de pluripotência.

Reprogramação de células somáticas humanas em células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando vetor retroviral com GFP

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