The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
This translation into Turkish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages
Baker IDI Heart and Diabetes Institute
This article is a part of JoVE Clinical and Translational Medicine. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.
Recommend JoVE to Your LibrarianCurrent Access Through Your IP Address
Current Access Through Your Registered Email Address
Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. Cholesterol Efflux Assay. J. Vis. Exp. (61), e3810, doi:10.3791/3810 (2012).
Hücrelerin kolesterol içeriği hücre zarının bozulması, apoptoz ve nekroz 1 bir hücreye sonuçları çok fazla veya çok az kolesterol, çok dar sınırlar içinde tutulmalıdır. Hücreler hücre içi sentezi ve plazma lipoprotein kaynak kolesterol, hem de kaynakları tamamen kolesterol için hücrelerin ihtiyaçlarını karşılamak için yeterli olabilir. Kolesterol sentezi ve alım süreçleri sıkı regüle ve kolesterol eksikliği azdır 2 olarak uygulanır. Aşırı kolesterol daha yaygın sorun 3'tür. Hepatositlerin dışında ve bir dereceye adrenokortikal hücrelere, hücreler kolesterol düşmesine edemiyoruz. Hücreler kendi kolesterol miktarını azaltmak için iki seçeneğiniz var: aynı zamanda toksik kolesterol esterleri ile hücrelerin aşırı olarak kolesterol esterleri, sınırlı kapasiteli bir seçenek haline dönüştürmek kolesterol ve kolesterol akışı, potansiyel olarak sınırsız kapasiteye sahip bir seçenek. Kolesterol akışı bir specBöyle ATP bağlayıcı kaset taşıyıcı proteinler A1 (ABCA1) ve G1 (ABCG1) ve çöpçü reseptör tip B1 gibi hücre içi nakliyeciler, bir dizi ile düzenlenmiştir IFIC süreci. Plazma kolesterol doğal alıcı yüksek dansiteli lipoprotein (HDL) ve apolipoprotein AI olduğunu.
Kolesterol akışı assay kültürü hücrelerinden kolesterol akışı oranı ölçmek için tasarlanmıştır. Bu kolesterol akışı ve / veya hücre serbest kolesterol kabul plazma alıcıları kapasitesini korumak için hücre kapasitesi ölçer. Deneyi aşağıdaki adımlardan oluşur. Adım 1: serum içeren orta etiketli kolesterol ekleme ve 24-48 saat hücreleri ile kuluçkaya hücresel kolesterol etiketleme. Bu adımda kolesterol hücrelerinin yüklenmesi ile kombine edilebilir. Adım 2: bütün hücre içi kolesterol havuzlarına etiketli kolesterol dengelenmeye serum içermeyen aracı madde içinde hücrelerinin inkübasyon. Bu aşamada hücresel kanal aktivasyonu ile kombine edilebilirolesterol taşımacıları. Adım 3: ekstraselüler alıcı ve hücreler arası alıcı için etiketli kolesterol hareketinin kantitatif sahip hücrelerin inkübasyon. Kolesterol öncüleri yeni sentezlenen kolesterol etiketlemek için kullanılması durumunda, bir dördüncü aşama, kolesterol saflaştırma, gerekli olabilir.
Deneyi aşağıdaki bilgi sağlar: (i) belirli bir işlem (a mutasyonu, bir itici, aşağı, bir aşırı ekspresyonu ya da tedavi) efflux kolesterol hücre kapasitesi etkiler ve (ii) nasıl plazma alıcısının kapasitesi kolesterol kabul nasıl Bir hastalık veya bir tedavi tarafından etkilenir. Bu yöntem, çoğu zaman kardiyovasküler araştırmalar, metabolik ve nörodejeneratif hastalıklar, bulaşıcı hastalıklar ve üreme bağlamında kullanılır.
1. [3H]-kolesterol hazırlanması
2. Kaplama Hücreler ve Etiketleme Hücresel kolesterol
Insan monosit 4,5, THP-1 insan monosit-makrofajlar 6,7,8, RAW 264.7 murin makrofajlar 5,9,10,11, HeLa hücrelerinde 12, endotel insan umbilikal ven: Bu protokol, aşağıdaki hücre tipleri kullanılarak test edilmiştir trombositler hücreleri (HUVEC), BHK-21 hücreleri 9, insan ve fare fibroblastlar 13,14, HepG2 hücrelerinde insan hepatokarsinoma 15 ve modifiye formunda, <> 16 sup.
3. Denge Kuluçka
5.. İşleme Samples
6. Sonuçları analiz


7. Timeline

8. Temsilcisi Sonuçlar
Bir kolesterol akışı deneyde bir sonucu bir örneği, Şek. 1. Bu deneyde THP-1 insan monosit oldu farklı kabul eden makrofaj ve kolesterol akışı içine ayırtlanmıştırtest edilmiştir. Hiçbir alıcıları ("boş") ile orta kolesterol akışı% 0.79 idi ve bu değer bir non-spesifik akış olarak kabul edilmiş ve diğer değerleri çıkarıldı. İnsan ApoA-I (nihai konsantrasyon 30 ug / ml) ile kolesterol akışı% 4.75 olmuştur. Bir başvuru plazma örneği arası deneysel değişkenlik izlemek için, bu deney dahil edildi. Bir referans örnek deney boyunca çok sayıda veri normalizasyon için kullanılır, ama değişkenliği yüksek olup olmadığını test tekrar bu ihtiyatlı bulunabilir. Hastanın ilacı ile muamele edilmiş, önce ve sonra bir hasta plazma (son konsantrasyon% 2) test edilmiştir. Bu hastada ilaç kolesterol akışı desteklemek için plazma kapasitesi üzerinde olumsuz etkilere sahip olduğu sonucuna varılmıştır.
Efflux deneyde bir sonucu başka bir örneği şekil gösterilmektedir. 2. Bu deneyde RAW 264.7 makrofaj LXR agonisti TO-901.317 ile birlikte bir gece inkübasyon (son konsantrasyon ile aktive veya devreye alınmadı1 mmol / L) ve insan plazma aynı örnek (% 2) kolesterol akışı test edildi. Bu LXR agonisti ile ABC taşıyıcıları hücresel ifade aktivasyon ekstrasellüler alıcı için kolesterol serbest hücrelerinin kapasitesini artırır sonucuna varılmıştır.

Şekil 1.. Çeşitli alıcıları için THP-1 hücrelerinden kolesterol akışı. Kolesterol akışı yüzdesi (yani etiketli kolesterol oranı hücrelerinden belirtilen alıcı taşındı) boş değerler çıkarma sonra gösterilmiştir. Ortalama ± dörderli tayin SD, * p <0.05.

Şekil 2. Kolesterol akışı RAW 264.7 insan plazma LXR agonisti ile aktif ya da aktif değil. Yüzde (yani etiketli kolesterol oranı ile kolesterol akışı hücrelerden taşındıbelirtilen alıcı) boş değerler çıkarma sonra gösterilmiştir. Ortalama ± dörderli tayin SD, * p <0.001.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Kolesterol akışı ölçmek için açıklanan yönteme hücreleri bir hücre dışı kolesterol alıcı için kolesterol hareketinin ölçülmesi için tasarlanmıştır. Bu metodoloji anlamada çok önemli hususlar vardır.
Etiketleme ve alışım
Tarif metodolojide etiketli kolesterol serumu içeren serum ilave edilir. Ayrıntılı olarak incelenmiştir asla rağmen, kolesterol serum lipoprotein içine dahil edilmiştir ve hücreleri tarafından alınmasını kabul edilir. Bu lipoproteinler için yeterli zaman kadar alınacak izin ve kolesterol için hücre zarlarına lipoproteinler taşımak için önemlidir. Genellikle 24 saat etiketleme yeterli olan, fakat 48 saat süre ile etiketlenmesi intraselüler kolesterolü yüksek özgül aktivite sağlar. Bu dikkate alınması gerektiğini [14 C] kolesterol, (çift etiketleme deneyler örneğin) [3 H] kolesterol yerine kullanılan özel hareket halindeeski ivity çok düşük ve amaçlanan spesifik aktivite ulaşmak için yeterli etiketli kolesterol ekleyerek olan hücre kolesterol içeriği değiştirebilir ve böylece sonuçları etkileyebilir. Bu, herhangi bir etiketli kolesterol veya bu kolesterol hızla spesifik olmayan transfer yoluyla bir alıcı tarafından dahil edilecektir gibi non-spesifik hücre yüzeyi üzerinde sıkışmış bulunmaktadır lipoproteinlerin (i) da önemlidir; ve (ii) etiketli kolesterol, çeşitli hücre içi arasındaki dengelenmiş olan havuzları. Bizim deneyim serumsuz ortamda 24 saat alışım inkübasyon bu hedeflere ulaşmak için yeterli olsa da, genellikle 48 saat inkübasyon kullanılır. Birçok hücre tipleri bile 48 saat veya serumsuz ortamda 24 saat boyunca hayatta kalmak istemiyorum. Bu durumda% 0.1 BSA (esas olarak yağ-asitsiz) yedek olarak hareket edebilir. Serum veya çeşitli serum yerine takviyeleri son çare olarak kullanılabilir lipoprotein-tüketilmiş, ama o lipoprotein eksikliği serum yapar ve serum-yedek takviyeleri tanımak önemlidir c olabilirapolipoprotein ontain ve sonucu etkileyebilir. Ne yazık ki üreticileri genellikle takviyeleri kompozisyonu ifşa etmiyoruz.
Efflux kuluçka süresi
Kolesterol akışı hücrelere bir hücre dışı alıcı ve kolesterolün azalması için kolesterol yükleme yol açar. Hücreleri ve alıcı hem kolesterol içeriği değişiklikler kolesterol akışı oranı ve diğer özelliklerini etkiler. Dahası alıcı kolesterol içeriyorsa, (örneğin, HDL) bu hücreler için alıcı doğru hareket edebilir ve alıcı kolesterol spesifik aktivite belirgin hale gelmesi durumunda, bu sonuçlar yorumlanması karmaşık hale getirecektir. Böylece, güvenilir bir algılama etkinleştirmek için hücrelerden alıcı geçmek için etiketli kolesterol yeterli miktarda ancak zaman kalması mümkün olduğunca kısa efflux inkübasyon tutmak en iyisidir. Genelde 2-6 saat önerilen zamandır. 24 saat daha uzun inkubasyon equili bir devlet yansıtacakbrium ve bu nedenle çok kolesterol akışı oranı daha kolesterol birikmesine alıcı kapasitesini işaret olacaktır.
Alıcı
Farklı alıcıları kolesterol akışı farklı yollar için özeldir. Belirli kolesterol akışı ölçmek için, apoA-I ABCA1 bağımlı akış esnasında HDL veya ABCG1 ve SR-B1-bağımlı yolların sulandırılmış HDL yansıtmak için kullanılır. Siklodekstrin genellikle spesifik olmayan akış değerlendirmek için kullanılmıştır. Ölü hücreleri parçalanıyor salınan kolesterol ve kolesterol non-spesifik ayrışma katkısını ölçmek için hiç alıcı içeren deney "boş" bir örnek, dahil etmek önemlidir.
Alıcı konsantrasyonu
Kolesterol akışı (i) hücreleri tarafından kolesterol serbest bırakılması ve bir alıcı ile (ii) uptake içermektedir, her iki adım oran-sınırlayıcı olabilir. Deneysel amaç değişiklikleri araştırmak için ise(örn. transfeksiyon ya zincirleme aşağı sonra) serbest kolesterol hücrelerinin kapasitesi, daha sonra alıcı konsantrasyonunun kuru sınırlama olmamalıdır. ApoA-I ve HDL 30-50 mcg / ml konsantrasyonları genellikle non için hız sınırlama. Kolesterol akışı desteklemek için alıcı ile kapasitesi soruşturma hedefi (kolesterol akışı desteklemek için hastalara veya hayvanlara gelen izole HDL veya plazma numuneleri, örneğin kapasitesi) ise, o zaman alıcı konsantrasyonu oran-sınırlayıcı olması gerekir. Için apoA-I ve HDL bu genellikle 10 mg / ml, plazma numuneleri için bu genellikle% 1-2, ancak doğru bir konsantrasyon bulmak için bir ön doza bağımlı deney dozu seçmek önemlidir edilir.
Hücrelerinin aktivasyonu
Belirli kolesterol akışı sorumlu kilit unsurları iki ABC taşıyıcıları, ABCA1 ve ABCG1 vardır. Hem LXR ve LXR agonisti ile hücrelerin ön inkübasyon tarafından düzenlenir (en popüler bileşik Sig gelen TO-901.317 mevcutturkonsantrasyonları 1-4 kullanılan ma) mol / L önemli ölçüde spesifik kolesterol akışı oranı arttırır. , RAW 264.7 veya J774 gibi fare kökenli hücreler, aynı zamanda cAMP (0.3 mmol / L) aktif hale getirilebilir.
Kolesterol olan hücrelerin yüklenmesi
Onları asetillenmiş veya okside LDL-kolesterol veya siklodekstrin kompleksi ile önceden kuluçkaya kolesterol hücre yükleme de kolesterol akışı uyarır. Bu kolesterol değişiklikler metabolizması birçok yönleri ile özellikle hücreler, makrofajlar yükleme akılda tutulması gerekir. Model seçimi (kolesterol karşı kolesterol değil yüklenen yüklü) çalışmanın bilimsel hedefe bağlıdır.
Sonuçlar Sunumu
Genellikle kolesterol akışı deney sonuçları hücrelerinden salınan kolesterol yüzdesi olarak sunulmaktadır: Bu bireysel kuyularda ve etiketleme verim hücre sayısı kadar değişkenlik ortadan kaldırır. Bununla birlikte, thTedavi alıcı (boş) yokluğunda kolesterol alımı ve efflux etkilemedi yalnızca geçerlidir. Bu iki koşul deneysel olarak kanıtlanmış olması gerekir.
Teorik olarak, bu yöntem, bir hücre dışı alıcı için herhangi bir hücresel seçmenlerinin efflux incelemek için kullanılabilir. Kolesterol farklı olarak, bu bileşik, metabolize olur, eğer, daha sonra bir analitik saflaştırma adım dahil edilmesi gerekmektedir. Bileşik hücrede ise, daha fazla sentez edilir, sentetik öncüleri etiketlenmesi için kullanılabilir. Örneğin, [14 C] asetat ve [3 H] su yeni sentezlenen kolesterol efflux incelemek için kullanılabilir ve [14 C] fosfolipidlerin efflux çalışmak için kolat. Bu durumda, yeni sentezlenen kolesterol genelde ince tabaka kromatografi ile, öncüleri ve ara ürün olarak ayrılması gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Yazarlar bu çalışma ile ilgili hiçbir çatışan çıkarları beyan ederim.
Bu çalışma Victoria Hükümeti'nin OIS Programı tarafından Ulusal Sağlık ve Avustralya Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC) (526.615 ve 545.906) gelen ve kısmen hibe ile desteklenmiştir. DS NHMRC bir üyesidir.