המבדק Electroantennographic ככלי מיון עבור נדיפים צמחים מארח

1. הכנת זוהה נדיפים מצמח הפונדקאי לצורך הקרנת EAG

1. לאחר זיהוי ואימות הולם של כל נדיפים באמצעות GC-MS, בביצוע ניתוחים EAG שאיפה של כל נדיפים זמינים. הסינון הראשוני יכול להיות מספר לשכפל נמוכה של תגובות מחושים (N = 3-5) בכל מין בנפרד על מנת להשיג אינדיקציה chemoreceptivity יחסית כמות זמן קצר (טבלה 1).
2. הכן את הפתרון של כל אחד תנודתי בריכוז מ"ג / מ"ל ​​5 ב פנטן. סוגרים היטב ושומרים במקרר עד מדגם מוכן לשימוש מיידי (למשל, acetophenone, צפיפות = 1.03 גרם / מ"ל, נפח = (0.005 g/1.03 גרם / מ"ל) = 4.85 × 1000 μL של acetophenone לתוך הבקבוק מ"ל נפח 1.0 ו לדלל את 1.0 מ"ל עם פנטן).
3. זמן קצר לפני הניתוח EAG, הסר בקבוקונים המכילים 5 מ"ג / מ"ל ​​ריכוז נדיפים להיבדק ולאפשר כדי לחמם לטמפרטורת החדר. בינתיים, לתייג מספר נכון של בטפי להחדרת נוזלים אל פסטרלתאם עם כל תנודתי להיבדק, ולעטוף פיסה קטנה של parafilm (בערך 15 × 15 מ"מ) מעל קצה של טפטפת. במשך 10 הראשונים בטפי להחדרת נוזלים ההקרנה גירוי (N = 4 עבור כל אחד זכר ונקבה) נטענים במקרה של הכנה רע או מכשול בלתי צפוי אחר.
4. באמצעות פינצטה, לקפל בעדינות את הדיסק המבדק במחצית כדי להקל על מיקום בתוך פיפטה, אז באופן חלקי למקם את הדיסק מקופל לתוך סוף גדול של פיפטה כך CA. 2-3 מ"מ של דיסק חשופים. יישר את בטפי להחדרת נוזלים שכותרתו הכינו בעריסה המדף.
5. שימוש pipettor או מזרק, טען 10 μL (50 מיקרוגרם) של פתרון תנודתי על כל דיסק ולאפשר 2 דקות כדי לעבור באופן מלא לפני הכנסת הדיסקים אל פיפטה. נטען פעם אחת, מיד לאטום את קצה פיפטה עם parafilm (בערך 15 × 30 מ"מ). כמות גירוי תנודתי להיות טעון ושאף יהיה כנראה להשתנות עם מינים חרקים.
6. בעקבות פרוטוקול אותה כאמור להכין פקדיםלכלול כל ניתוח. עבור μL שלילית עומס 10 השליטה פנטן רק על דיסק אחד, לחכות 2 דקות, טען אל פיפטה המסומנת, ואת החותם. עבור חיובי, טען 10 μL (50 מיקרוגרם) על הדיסק, לחכות 2 דקות, עומס אל פיפטה המסומנת, ואת החותם עם parafilm.
7. הכדאיות של הכנה מחושים חרקים סביר להניח משתנים בהתאם למין, אבל מצאנו כי Amyelois transitella האנטנות בדרך כלל להישאר פעיל ועקבי> 30 דקות לאחר כריתה באמצעות פרוטוקול המתואר. זה משך הזמן בדרך כלל מאפשרים עד 4-10 דגימות נדיפים לעבור הערכה. טבלה 2 מספקת דוגמה פעמים רצפים.

2. הכנת אנטנות חרקים על EAG המבדק

1. מוקד ניסוי זה הוא EAG ניתוח, ולכן ההנחה כי החוקר זה תהיה גישה חרקים שגדלו כראוי.
2. לצורך ניסוי זה נהיה לומד היום 3-4 olד, עש זכר ונקבה הזדווגו. עש אישיות מועברים לתוך מיכל קטן, עפעפיים פלסטיק ביום הניתוח. בסמוך לפני המבדק, עש להיבדק מועבר ראש 1 לתוך המכשיר מחזיק (כלומר, עשוי פלסטיק שונים טיפים pipettor) ומאובטח מאחור. מניפולציה של חרק ניתן לראות תחת מיקרוסקופ, סטריאו צריכת חשמל נמוכה כדי להקל על כריתה.
3. המחושים הם הקניטו את השימוש בכלי חוט שקצהו. בעל מזלג, עם סרט קטן של ג'ל האלקטרודה, ממוקם בסמוך להעברה מהירה של אנטנות. האנטנה הראשונה הוא נכרת באמצעות מספריים מיקרו דגש על מזלג, כדי להבטיח את בסיס האנטנה ממוקמת בחלק הלא אדום של המזלג (אלקטרודה הקרקע אדישה). סט טיימר 10 דקות מופעל, אנטנה 2 הוא נכרת והניח ליד האנטנה הראשונה עם שני בסיסים באותו צד של המזלג.
4. לחלופין, אנטנות ניתן להשאיר מאובטחת תוך מחזיקהצינור גרם, נכרת, ואז להסיר בעדינות בין הצינור לבין חרקים באמצעות כלי חוט שקצהו עם טיפה של ג'ל בצד.
5. האנטנות נבדקות על מנת להבטיח בסיס עצה שקועים ג'ל האלקטרודה בועות לא נמצאים ג'ל. הקצוות / עצות יכול להיות trimmed כדי להבטיח חשיפה מלאה ג'ל האלקטרודה. הטיפול יש להשתמש כדי להבטיח את יתרת כל אנטנה אינו מכוסה בג'ל, ובכך להבטיח פני מרבית שטח מחושים חשוף עלים.
6. מזלג הכינו מוכנס לתוך החללית מראש במגבר כל הזמן תחת זרם בלתי פוסק של אוויר humidified ב 200 מ"ל / דקה לתקופה שנותרה דקה 10 תקופת המתנה. השעה בלו ו EAG פעמים חניכה מצוינים (טבלה 2) ו - 30 שניות שקדמו עלים גירוי 1, פיפטה המכיל את השליטה חיובית חתומות והושמו בעל המותאם לכוון האוויר / עלים זרימת 2-3 מ"מ מ הכינו אנטנות.
7. אחרי כל experiment, עשים את הבדיקה מורדמים בסביבה קרח יבש להיפטר כראוי.
8. עש נקבה הם גזור כדי לבדוק את מצב ההזדווגות. גברים Cohabitating הם הניחו כי הזדווגו.

3. EAG פרוטוקול של רכיבים בודדים

1. תגובות מחושים נרשמות באמצעות תוכנת AutoSpike כלל עם מכשיר EAG Syntech. תצורת בלשונית AutoSpike מאפיינים עבור ערוץ עם החללית EAG מוגדר בקצב דגימה של 106.7, לא כדי לתקן, ומסנן של 0-42 הרץ. עבור הכרטיסייה מסנן, מסנן EAG פועל הפסקת נמוך מוגדר 0.1 הרץ.
2. שאיפות תמריצים הם 1-2 שניות משך. טיימר להגדיר דקה 1 מופעל לאחר שאיפה.
3. פיפטה המבחן הבא הוא תנודתי חתומות והושמו בעל. רצף של נדיפים הבדיקה, אקראי בין פועל כדי להבטיח שאין תרכובות הבדיקה באופן עקבי לעקוב אחר הבדיקה תנודתי, מלווה לאחר מכן (למשל, לוח 2) בזהירות allowing 1 דקה בין שאיפות.
4. כדי להקל להקל על הקריאה תגובות EAG, חלקים של השליטים ממוקמים על מסך המחשב ורמת המחקר עד לשיא של אות סטיה כלפי מטה נמדד מ"מ ומחובר גיליון נתונים (כלומר, עבור הגדרה 5 mV, 33 מ"מ = 2.5 mV). תוכנה יש את היכולת השמעה של ההקלטות שנשמרו עבור ניתוח בעתיד. המרת מ"מ או mV או μV משרעת מתבצע ניתוח הנתונים מאוחר יותר.
5. אחרי שאיפה סופית השליטה חיובית (למשל, רישום # 12) מנוהל, האנטנות יוסרו, מזלג הוא ניקה עם אתנול רווי לנגב להתייבש לפני השימוש הבאים.
6. כדי להגדיל את התפוקה של מבחני, כריתה של סט הבא של האנטנות ניתן נשלח על ידי כמה אנשי המעבדה השני כ -10 דקות לפני תום הניסוי הנוכחי - לאחר נשיפה 4: מבחן 2 תנודתי הניסוי הנוכחי, לפי לוח 2. זה יאפשר FOr את תחילת הניסוי הבא ישירות לאחר סיום הניסוי הנוכחי.
7. מספר גבוה יותר של משוכפלים (על אנטנות אחרת) יכול להתבצע על תרכובות של עניין כדי לספק אימות סטטיסטי נוסף.

4. דוגמה של ניתוח EAG של תערובות או מטריצות אחרים (לוח 3)

1. לאחר מכן, את יחסי ואמצעי אחסון עבור שתי תערובות שלישוני (3-רכיב תערובות) מחושבים כדי לספק דוגמה של שילוב נדיפים לעורר תגובות EAG גבוהה (טבלה 4). החישובים הם עבור חלק יחסי הבסיסיים, יחס 01:01:01 טוחנת של α-humulene: 2-undecanone: 2-phenylethanol ולאחר מכן השוואת יחס תערובת של 2 01:02:04.
2. באמצעות פרוטוקולים דומים שתוארו קודם לכן, את התערובות מוכנים ומסומן בטפי להחדרת נוזלים פסטר נטענים יחד עם בקרות חיוביות ושליליות הדרושים.
3. הדגימות נדיפים ניפח פני אנטנות זכר ונקבה ואת התגובות נמדדים מחוברלגיליון הנתונים (טבלה 3).

5. נציג תוצאות

עבור orangeworm הטבור הנשי ההגדרות הבאות משמשות: 2 שאיפות שנייה, 10 פעמים, 10 שניות הקלטה של ​​חלונות 2, ו 5 בקנה מידה mV. סטיה שלילית היא תגובה אופיינית, אך הערך המוחלט נרשם (כגון -3400 סטיה μV נרשמת 3400 μV). תגובה חלשה יחסית של הכנה לשליטה חיובית נמחק. איור 1 מציג באופן גרפי של התגובה העניים שליטה חיובית על ידי orangeworm הטבור.

כך, למשל, גורמות בקרה לקויה, התגובה הממוצע מחושים הנשי acetophenone הוא בדרך כלל CA. 2600 μV (איור 2), אם מכין רק נתן מענה של CA. 1300 μV היה להיות מושלך ועוד זוג אנטנות הכינו. כמו כן, התגובה הגברית הממוצעת (Z, Z) היה -11,13-hexadecadienal typically 3000 μV, ולכן כל תגובה פחות מ 1500 μV הושלכה בדרך כלל.

שליטה חיובית על ההתחלה והסיום של כל ניסוי גם מספק מידע על המצב של האנטנות. כלל האצבע אנו עוקבים להקרנה מהירה היא אם התגובה מחושים כדי נשיפה של שליטה פוסט (רשומה מס '12, טבלה 2) הוא גם פחות מ 75% של עלים 1 ^st שליטה מראש (רשומה מספר 1 , טבלה 2) פחות או יותר עלים 2 ^nd שליטה מראש (רשומה מס '2, לוח 2) אז הניסוי לא נעשה שימוש בניתוח נתונים בשל ירידה אפשרית של הכנה (איור 3). דוגמה הכלל הראשון של האגודל יהיה שיא מספר 1 = 2,730 μV ולהקליט # 12 = 1680 μV, ואת הכלל השני של האגודל אם שיא # 2 = 2350 μV ולהקליט # 12 = 1680 μV, בכל אחד מהמקרים הללו , התוצאות מכינות ולהתנסות של לא להיות מושלך.

דוגמה מייצגת של תיקון ערכי תגובה EAG כפי שנמדד לשליטה חיובית יהיה כדלקמן.

באמצעות הערכים לעיל ניסוי N = 3, בתגובה הביקורת השלילית ונגרע כל ערך בתוך כל ניסוי בהנחה הביקורת השלילית היא התגובה הבסיסית מחושים כדי עלים מכני שיורית ממס.

הפקדים חיוביות עבור כל ניסוי היה אז להיות בממוצע ותיקן את μV 1000, וציין את היחס לתיקון כדי μV 1000. גיליון נתונים (למשל, Excel) יכול בקלות לטפל להמיר התגובות הנתונים שמיש.

כפל ביחס תיקון בתוך כל ניסוי, הערכים עבור מתחם A ו-B מתחם מותאמים אז.

הממוצעים (אמצעי) עבור כל המתחם נקבעים מכן יחד עם שאר הנתונים הסטטיסטיים הרלוונטיים התגובות EAG עבור תרכובות שנבדקו לאחר מכן ניתן להעריךעל מועמדותו לחקירה נוספת.

באיור 1. EAG נציג לתגובה מחושים זכר (1180 μV) לשליטה מראש (1 עלים ^רחוב בקרה חיובית) כי היה להיות מושלך בשל התגובה מחושים עניים לאחר הבטחת אנטנות יש קשר טוב עם ג'ל. כחולי צווארון בחלונות התחתונים מייצגים עלים 2 של 2 תנודתי. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .

טרונג> באיור 2. EAG נציג לתגובה מחושים נקבה (3400 μV) ל 1 ^st עלים מראש פקד ייחשב המתאים. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .

איור 3. EAG נציג לתגובה מחושים נקבה (1680 μV) לשליטה פוסט (שליטה חיובית האחרון עבור כל ניסוי) אשר נחשב עני, רמיזות של אנטנות השפלה (<75% 1 שליטה מראש ^רחוב או < 2 עלים ^ND ערך לפני הביקורת). בדוגמה זו 1 ^st השליטה מראש עלים היה 2,730 μV ו 2 ^nd השליטה מראש עלים היה 2,350 μV. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .

dflinebreak ">
איור 4. נציג EAG לתגובה מחושים הנשי (μV 3800) כדי שאיפה של תערובת מועמד תנודתי את המידות הבאות של סטיה ראשונית לכל היותר (μV 3800), מדרון הראשוני במהלך תקופת עלים (0.3 s/1.2 mV = 0.25 S / mV), ואת המדרון למשך עלים הנותרים (1.6 s/1.9 mV = 0.84 S / mV). לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .

איור 5. כלי שונה קטן המכיל מטריקס מדגם נדיפים הרלוונטי להיות שאף על א ' transitella אנטנות.

טבלה 1. בשנות הITU פליטת נדיפים של שקדים שאין דומה (2007) ותגובות EAG שקבע תצורה שונה ורגיש פחות בתוכנית Autospike.

טבלה 2. דוגמה של טופס להקלטת תגובות מחושים זכר ונקבה לרכיבים נדיפים בודדים.

לוח 3. דוגמה של טופס להקלטת תגובות מחושים זכר ונקבה כדי תערובות נדיפים ו / או פרחים.

לוח 4. דוגמאות של הכנת 10 מ"ל של 5 מ"ג / מ"ל פתרון עבור שני יחסי שונים של תערובות.

לוח 5. דוגמה של טופס רישום 2 והתוצאותשאיפות cutive של מרכיבים נדיפים בודדים ברחבי אנטנות זכר ונקבה.

השימוש בהקלטות electroantennogram כמו המבדק לקבוע התגובות chemoreception של חרק היעד נפוץ למדי, מחקרים רבים ניצול EAG כגלאי של שפכים מן הכרומתוגרמה גז (GC-EAD) ניתן למצוא בספרות. ^9,10 שיטת הדגימה תספק סינון מהיר של כמויות מקבילות של מרכיבים נדיפים עם משוכפלים גבוהות המשימה בטוחים היענות יחסית. תוכנית AutoSpike בתוכנה Syntech היא תוכנית טובה נדיפים ההקרנה שכן היא מסוגלת לספק הסטייה המרבית משרעת האות אנטנות (איורים 1-3), אשר אנו מציגים כאן את הערך "הקרנה". בנוסף, מידע בסיסי אחר לשימוש למחצה מתקדמים (ראה תרשים 4) ניתן לקבל עם AutoSpike בהתאם את הגדרות התצורה ומה חוקר רוצה לנבוע בתגובה מחושים. GcEAD או EagPro תוכניות Syntech הם Appropriate לניסויים מתקדמים יותר או מדענים מוכרים בתגובות אלקטרו מאז עקבות כתוצאה לספק פירוט רב יותר כמובן, זמן תגובה של שלילת קוטביות מחושים.

לפני תהליך המיון של תרכובות שזוהו מצמח הפונדקאי, זיהוי נכון של נדיפים חשובה, ועליה לפעול על פרוטוקולים נוקשים. אם אפשר, שתי עמודות-GC של קוטביות שונות (כלומר, DB-שעווה ו DB-1) יש להשתמש לצורך זיהוי מרכיב ראשוני באמצעות התאמת המדדים שמירה (RIS, ראה טבלה 1). השיטה הטובה ביותר היא לוודא את זהותו של כל תנודתי עם אימות רגיל על שתי עמודות. ¹¹ אם את זהותו של כמה תרכובות אי אפשר, הבהרה של bioactivity שלהם יכולים עדיין להיות מושגת על ידי שימוש של GC-EAD. ¹² עם זאת , שכפול של המבדק עשויה להיות מוגבלת בהתאם לשיטת איסוף תנודתי, כמות אנליטי לא יהיה רעזמין dily ללא תקן פנימי, זהותו של המתחם לא יהיה ידוע מיד, לאחר בדיקות של תערובות לא יהיה אפשרי.

אם אטום כראוי בקירור, פתרונות של נדיפים ב פנטן יכולים בדרך כלל להיות מאוחסן במשך שבוע על 1. אם pipets אטומים המכילים את הדיסק טעון מונחות בשקית בעלת רוכסן ו במקרר ניתן לאחסן כ -24 שעות. עם זאת, מצאנו את זה הכי טוב כדי לטעון את הדיסקים בוקר של ניתוחים EAG ו כראוי להשליך שאריות pipets בסוף היום. המינונים עבור שאיפות סטנדרטיים יש לקבוע באופן ניסיוני עבור כל מיני חרקים אם הספרות בנושא היא לא זמינה.

גיבוש תערובות הוא בדרך כלל תהליך מפרך. המוצג להלן מספר גישות פשוטות יחסית, אם כי לא מקיפה. החוקרים מעודדים לעשות קריאה נוספת על טכניקות שונות. לאחר הערכת respons רכיב בודדes מן נדיפים צמחים מארחים שבוצעה, מחקרים של תערובות יכול להתבצע. דוגמה אחת היא באמצעות נדיפים לעורר את התגובות יחסית גבוהים יותר מן הסינון. דוגמאות נוספות הם:. שילובים של כמויות יחסית הנפלטים, היחס בין התגובות יחסית לעומת כמויות יחסית, מיון לפי סוג חומרים נדיפים, או ההבדלים בשלבים phenological או מצבים שונים של מטריצות על נזק (לעומת ניזוק) ¹³

את תערובות הפגינו שילובים פשוטים של גישות שונות. 01:01:01 הוא תערובת שלישוני על פי התגובות גבוהות יחסית ההקרנה הראשונית, אלא גם מייצג שיעורים שונים של תרכובות. Humulene הוא sesquiterpene, 2-undecanone הוא מוצר שומני פירוק חומצה, ו 2-phenylethanol הוא benzenoid. תרכובות אלה מייצגים את המעמדות הגדולים של נדיפים לראות בדרך כלל פליטות המפעל. יחס 01:02:04 בתערובת 2 משלבת את יחסי היחסיים של נדיפים שזוהו duלצלצל ניתוח GC-MS. ⁴ עם זאת, השימוש SPME ו GC-MS לספק רק יחס יחסית ושימוש ניתוח GC-FID בשיתוף עם עקומות כיול של סוגי תרכובות מומלץ כנקודת מוצא מדויק יותר עבור יחסי מבוסס על נדיפים שזוהו.

האלקטרודה מזלג טכניקה EAG היא אחת השיטות הפשוטות יותר המועסקים ניסויים אלקטרו. ¹⁴ הקורא מוזמן לבצע מחקר הספרות עוד יותר עבור יישומים מתקדמים מעבר לשיטה זו. בנוסף, הקרנה של מטריצות באתרו לשעבר יכול להתבצע באמצעות השיטה הוכיחה, אבל ניצול קטנים (60 מ"ל) כלי שונה (איור 5) המכילים חלקי הצמח (למשל, שקדים טחונים). בעת שימוש במיכלים גדולים יותר (למשל, 120 מ"ל כלי עפעפיים עם מתאמים מיוחדים לשימוש עם המשאף EAG) מומלץ להגדיל את קצב הזרימה על מנת להבטיח פינוי נאות של המיכל. Shoul הניסויד לבצע בו ביקורת חיובית ממוקם המיכל כדי להבטיח את הגירוי הנכון יושג בקצב זרימת הצורך. השימוש בענן 2 2 עבור רכיבים בודדים אין צורך בהחלט שאיפות בסדר גודל של 0.5 עד 1.0 שניות אופייניים יותר. עם זאת, היא לאפשר השוואה נוחה בעתיד עם ענני זרי נדיפים במכולות שכן אלה בדרך כלל דורשים זמן רב יותר עלים על ספיקות גבוהות יותר. במעבדות שלנו לנצל עלים 2 2 כדי להשוות את רכיב בודד ו / או תגובות תערובת ישירות שאיפות באמצעות מטריצות בתוך כלי קטן (ראה איור 5). עלים 2 2 על אלה כלי קטן מבטיח פינוי מוחלט של מיכל, כאשר קצב הזרימה המתאים מוגדר.

יתר על כן, רכישת משב 2 ניתן לבצע זאת עלים 2 אינו הכרחי לסינון מאז סכום של הרכיב volatilized נשמר כבר לא ברמה קפדנית (<strong> לוח 5). עם זאת, מידע זה עשוי להיות בעל ערך עבור כל מנה תגובה הניסויים הבאים. ¹⁵ תגובה הרבה יותר נמוך עשוי להצביע על תגובה מצומצמת לריכוזים נמוכים יותר זמן התגובה עולה בקנה אחד עשוי להצביע על המינון קרוב סף תגובה גבוה. יש לציין שיש הסברים פיזיולוגיים אחרים לשינוי בתגובות ¹⁴ עד 2 עלים, אך המידע אינו לסייע הנחיות לניסויים עתידיים. אם קצב העברת נתונים גבוה, לא קריטי, השימוש בענן 2 של כל רכיב יכול להיות אינפורמטיבי.

אם עש בתולה נשים הן את הדגימה ממוקד, עכשיו זחלים ב instar האחרון או גלמים ניתן חרמנית ¹⁶ ו הפרדה כדי לאפשר הופעת נקבה להתרחש במיכלים נפרדים.

התאמת מידה ייתכן שיהיה צורך להתאים את התגובה מחושים אם זה עולה בקנה מידה הנוכחי. את הכף על מסך התוכנה CA EAGn לסייע בקביעת מ"מ רבים איך לכל תגובה μV. חרקים אחרים יכולים להשתנות הרגישות שלהם.

השיטה הוכיחה מספק קל ללמוד, מהיר, אמין, תפוקה גבוהה פרוטוקול ההקרנה כדי לצמצם את מספר נדיפים בתמורה bioactivity מהרכב המורכב של נדיפים הצמח הפונדקאי. סיפק את האנטנות של הדגימה מתאימים, שיטת EAG המזלג מאפשר הערכה מהירה של מרכיבים נדיפים רבים או תערובות של רכיבים, והשוואה של התגובות לזה של תקן. בסופו של דבר, המבדק כי מעריך את פעילותו של רכיב או שילוב של רכיבים במסגרת תחום היא השיטה תקפה ביותר. עם זאת, מחקרי שדה הם לעתים קרובות מאוד זמן ועבודה רב, יקר, ודורשים חודשים רבים כדי להשיג תוצאות המתאימות.