High-throughput synthese van koolhydraten en functionalisering van polyanhydride Nanodeeltjes

1. High-throughput Carbohydrate Synthesis

1. Voorafgaand aan de geautomatiseerde synthese van dimannoside, een adequaat beschermd suiker donor, meestal trichloroacetimidate en acceptor, vooral een alkenyl fluorous alcohol, worden gesynthetiseerd op de bank-top.
2. Een programma is geschreven voor de geautomatiseerde synthese van dimannoside. Een schematische weergave van de fundamentele geautomatiseerd proces is in figuur 2. In het programma wordt gewaarborgd dat bij de toevoeging van de promoter, het mengsel van donor en acceptor geroerd ten minste 30 minuten.
3. Oplossingen van de synthetische donor, acceptor trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate worden in dichloormethaan. Tolueen en dichloormethaan worden het meest gebruikt voor glycosylering reacties.
4. Ook worden de oplossingen van reagentia voor de deprotectie van tijdelijke beschermende groepen in 80% methanol en 100% methanol.
5. Voor de start van het programma, dat de bijbehorende typeive luchtvochtigheid in de kamer is 30% of lager in de automatisering kamer. Een hoge luchtvochtigheid is schadelijk voor de glycosylering reacties.
6. Zodra het programma is gestart, de robotarm draagt ​​de oplossingen van donor en acceptor in de reactieflacon opeenvolgend. Vervolgens wordt het mengsel 30 minuten geroerd.
7. Vervolgens robotarm overdraagt ​​0,2 tot 0,3 equivalenten van trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate in het mengsel gewoonlijk bij kamertemperatuur maar lagere temperaturen als -20 ° C worden bereikt. Het reactiemengsel wordt 30 minuten geroerd.
8. Na 30 minuten wordt de reactie gestopt en een kleine hoeveelheid verwijderd om de reactie voortgang. Indien niet volledig kan de reactie worden voortgezet en uiteindelijk vereiste tijd kan worden gewijzigd.
9. Zodra de reactie is voltooid, wordt het reactiemengsel naar de fluorous vaste fase extractie (FSPE) patronen met C ₈ F ₁₇ gemodificeerde silica gel voor zuivering.
10. De karruggen eerst gewassen met 80% methanol-water mengsel (8 ml) ontdoen van de niet-fluorous fractie.
11. Vervolgens patronen worden gewassen met 100% methanol in de gewenste fluorous-tag verkrijgen. Als extra zuiveringsstap gewenst kan de machine worden gestopt en het reactieproduct (en) verwijderd zuivering door extra middelen.
12. Na de zuivering cyclus, de robotarm verdeelt natriummethoxide in de reactieflacon. De reactie wordt gedurende 2 uur. Indien niet volledig kan de reactie weer voortgezet gedurende een langere periode en tenslotte de gewenste ingestelde tijd kan worden gewijzigd.
13. Na de voltooiing van de reactie wordt het produkt gezuiverd door FSPE en vervolgens onderworpen aan oplossing in watervrije tolueen, gevolgd door verdamping restwater te verwijderen.
14. Vervolgens wordt de cyclus (stap 6 tot 13) wordt herhaald tot de gewenste ketenlengte wordt verkregen voor de doelmolecule.
15. De beschermde product dat wordt verkregen van de automatisering is then verder gezuiverd en volledig gekenmerkt door technieken, zoals kernmagnetische resonantie (NMR) spectroscopie. Volledige verwijdering van de bescherming (het verwijderen van alle resterende beschermende groepen) van de uiteindelijke doelstelling molecuul wordt dan afgerond buiten de automatisering platform in de regel, omdat het meestal gaat het explosieve waterstofgas en palladium. De laatste ontscherming stap werd uitgevoerd op bench-top buiten de automatisering platform. De eerste stap is ozonolyse van de dubbele binding in fluorous tag gevolgd door oxydatie van de verkregen aldehyde een carbonzuur. Het product werd gezuiverd door kolomchromatografie. De laatste stap is ontscherming van benzyl ethergroepen met palladium-gekatalyseerde hydrogenering. Het product werd door celite pad om zich te ontdoen van palladium tot zuiver eindproduct te krijgen.

2. High-throughput Nanodeeltje Oppervlakte functionalisering

1. High-throughput polymeersynthese en nanodeeltjes fabricage wordt uitgevoerd volgens dezelfde protocol en robot ingesteld beschreven door Petersen et al. ^19. Het copolymeer systemen voor deeltjes fabricage gebaseerd op sebacinezuur (SA) en 1,6-bis (para-carboxyphenoxy) hexaan (CPH) en 1,8-bis ( para-carboxyphenoxy) -3,6-dioxaoctane (CPTEG) en CPH. Een schematische weergave van de robot gebruikte afzetting inrichting is weergegeven in Figuur 1b.
2. Na nanodeeltjes fabricage is de houder met buizen met de nanodeeltjes bibliotheek opnieuw aan de actuator fase.
3. Voor bevestiging van koolhydraten naar het oppervlak van polyanhydride deeltjes, wordt een amine-carbonzuur koppelingsreactie ²⁰ bestaande uit twee opeenvolgende reacties uitgevoerd.
4. Voor de eerste reactie heeft de injectiespuit in de eerste programmeerbare spuitpomp is gevuld met 10 equivalenten (eq.) (equivalenten molaire carbonzuur concentratie op deeltjesoppervlak) 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride (EDC) en 10 eq. ethyleendiamine in een waterige oplossing, terwijl de injectiespuit in de tweede programmeerbare spuit pomp geladen met 12 eq. N-hydroxysuccinimide (NHS) in waterige oplossing.
5. Met behulp van de LabVIEW programma worden reagens suspensies gestort in het nanodeeltje bibliotheek *.
6. Vervolgens wordt elk monster gesoniceerd (30 s bij 40 Hz) en de buishouder wordt losgekoppeld van de robotarm platform.
7. Nanodeeltjes suspensies worden gedurende 9 uur ** met constante rotatie bij 4 ° C.
8. Na reactietijd is voltooid worden de buizen gecentrifugeerd (12000 g gedurende 5 min) en terug naar de robot station twee wasstappen voeren.
9. Voor wassen, een spuit blijft leeg en geladen in de eerste programmeerbare spuitpomp, terwijl de spuit in de tweede spuit pomp is gevuld met koud water. De bovenstaande vloeistof in elke buis wordt teruggetrokken in de lege spuit en de tweede pomp deposito's koud water.
10. Homogenisering van nanodeeltjes suspensie werd uitgevoerd zoals beschreven in stap 2.6. Buizen worden vervolgens gecentrifugeerd (12000 g gedurende 5 min) en een tweede wasstap werd uitgevoerd zoals beschreven in stap 2.9.
11. Voor de tweede reactie zijn twee depositie stappen gebruikt. In de eerste depositiestap 12 eq. EDC worden geladen met een pomp en 12 eq. van NHS worden geladen met de tweede pomp.
12. De tweede depositie stap omvat 10 eq. een specifieke saccharide de eerste en tweede pompen (bijvoorbeeld, galactose, lactose of di-mannose) *** en een derde pomp met 10 eq. glycolzuur (gebruikt als controle ****).
13. Nanodeeltjes suspensies gehomogeniseerd zoals beschreven in stap 2.6 en geïncubeerd 9 uur bij constante rotatie bij 4 ° C.
14. Na het tijdstip van de reactie is voltooid, wordt een wasstap uitgevoerd zoals beschreven in stap 2.8, 2.9 en 2.10.
15. Het gefunctionaliseerde nanodeeltjes bibliotheek wordt vervolgens geplaatst in een vacuümkamer drogen ten minste 2 uur.
16. De gefunctionaliseerde nanodeeltjes zijn dan karakterseerd door röntgen foto-elektron spectroscopie en een hoge doorvoer fenol-zwavelzuur assay het oppervlak samenstelling en concentratie van de saccharide respectievelijk bepalen. Scanning elektron microscopie en dynamische lichtverstrooiing worden gebruikt om de deeltjesgrootte, deeltjesgrootteverdeling en oppervlaktelading bepalen.

Opmerkingen: * Deposition volumes variëren met de massa van nanodeeltjes in elke buis.
** Reactietijden voor de eerste en tweede reacties kunnen worden gewijzigd in de laatste saccharide concentratie aan te passen.
Elke *** saccharide wordt gestort in reageerbuizen afhankelijk van de gewenste fractie.
**** Voor de specifieke reactie in deze studie voor de bevestiging van koolhydraten is glycolzuur als linker controle omdat ontschermde sacchariden al deze molecule covalent, waardoor verdere bevestiging van nanodeeltjes oppervlak.

3. Representatieve resultaten

De fully beschermd dimannoside figuur 2 werd gesynthetiseerd volgens automatiseringsplatform. De gesynthetiseerde verbinding werd gekenmerkt ^met 1H NMR een VXR 400 MHz spectrometer met _CDCI3 als oplosmiddel. De NMR spectrum is weergegeven in figuur 3.

Met behulp van de hoge verwerkingscapaciteit nanodeeltjes fabricage en funktionalisering van polyanhydride nanodeeltjes hierin beschreven, is de bevestiging van dimannose, lactose en galactose uitgevoerd met succes ^{10, 11.} Met behulp van deze set-up, werden optimale reactie-omstandigheden (dat wil zeggen, reactietemperatuur en tijd) die de gewenste nanodeeltjes functionalisering en morfologie te bereiken. Wanneer de reactie werd uitgevoerd bij 4 ° C in plaats van kamertemperatuur, een vermindering van nanodeeltjes aggregatie waargenomen door SEM (data niet getoond). Tabel 1 toont representatieve resultaten van de karakterisering van gefunctionaliseerde 50:50 CPTEG: CPH nanodeeltjes met een di-mannose oflactose, gesynthetiseerd bij 4 ° C. De gegevens tonen een toename van de gemiddelde diameter nanodeeltjes door functionalisering. Terwijl de niet-gefunctionaliseerde nanodeeltjes een negatieve zeta potentieel van ongeveer. -20 MV, de gefunctionaliseerde deeltjes lieten een positief zeta potentiële waarde, waaruit blijkt succesvol functionalisering van de nanodeeltjes oppervlak. Lactose en di-mannose beide neutrale suikers, maar vrije aminegroepen de ethyleendiamine linker gebruikt om de sacchariden hechten kan verantwoordelijk van de positieve zetapotentiaal.

Reactietijd is een andere variabele die zowel de uiteindelijke morfologie van de nanodeeltjes en de mate van de bereikte suiker beslag zou kunnen beïnvloeden. Door de reactietijd kan de uiteindelijke suikergehalte aan de nanodeeltjes oppervlak bestuurd als figuur 4A. Zoals verwacht, de concentratie van dimannose op het oppervlak van 50:50 CPTEG: CPH nanodeeltjes verhoogdde totale reactietijd en bereikte een maximum na 18 uur. Nanodeeltjes gefunctionaliseerd met de 24 uur totale reactietijd werden gebruikt om hun vermogen om CLRs richten op de muis beenmerg afgeleide dendritische cellen (DC's) te evalueren. Flow cytometrie werd gebruikt om de expressie van twee CL receptoren (zoals CIRE (CD209, DC-SIGN) en mannose receptor (CD206)) na stimulatie met niet-gefunctionaliseerde en lactose en di-mannose gefunctionaliseerde nanodeeltjes (Figuur 4B) te evalueren. Een hogere expressie van beide receptoren, hetgeen een indicatie effectieve targeting werd verkregen wanneer cellen werden gestimuleerd met zowel lactose en di-mannose gefunctionaliseerde nanodeeltjes. Echter, di-mannose-gefunctionaliseerde deeltjes een hogere expressie waarin een specificiteit van deze ligand voor de receptoren die werden bestudeerd.

Tabel 1. Nanodeeltje karakterisering. Niet-gefunctionaliseerd en gefunctionaliseerde werden gekarakteriseerd door quasi-elastische lichtverstrooiing en zetapotentiaal metingen. Deeltjesgrootte gegevens stellen het gemiddelde ± standaardafwijking (SD) van dynamische lichtverstrooiing gegevens in drie onafhankelijke experimenten. Zeta potentieel gegevens stellen het gemiddelde waarde ± SD van drie onafhankelijke metingen. Verandering in het teken van het zeta potentieel laat zien dat suiker was efficiënt geconjugeerd aan de CPTEG 50:50: CPH nanodeeltjes oppervlak.

= "/ Files/ftp_upload/3967/3967fig1.jpg" />
Figuur 1. (A) Grafische voorstelling van de aanpak met koolhydraat functionalisering van polyanhydride nanodeeltjes en een voorbeeld van de gefunctionaliseerde nanodeeltjes bibliotheken kunnen worden ontworpen met de beschreven high-throughput benadering. (B) Schematische weergave van de geautomatiseerde depositie inrichting gebruikt voor deeltjes functionalisering die bestaat uit (i) drie NO 1000 pompen, (ii) een robot fase geïntegreerd door twee aandrijvingen (Zaber) een beweging in de x-richting en de andere voor beweging in de y-richting, (iii) een tweede fase robot met twee naburige rekken (geschikt voor buizen en cuvetten) bestaande uit drie actuatoren, een voor elke richting (x, y en z). De pompen en in totaal vijf aandrijvingen in serie geschakeld. Aandrijvingen en pompen worden bediend door een computer met behulp van LabVIEW software. Dit schema is niet op schaal.arge.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor een grotere afbeelding weer te geven.

Figuur 2. Grafische weergave van de geautomatiseerde iteratieve synthese van koolhydraten met behulp van mannose als voorbeeld.

Figuur 3. ^1H NMR van het beschermde dimannoside.

Figuur 4. (A) Effect van reactietijd op nanodeeltjes oppervlakteconcentratie van saccharide. In de getoonde gegevens 50:50 CPTEG: werden CPH nanodeeltjes gefunctionaliseerd met dimannose op verschillende reactiesnelheden en de reactie werd uitgevoerd bij 4 ° C. Het gemiddelde en de standaardafwijking van twee onafhankelijke functionalisering experimenten wordt getoond. (B) lactose en di-mannose gefunctionaliseerde nanodeeltjeseffectief doelwit DC-SIGN (CIRE, CD209) en mannose receptor (CD206) op beenmerg-afgeleide dendritische cellen zoals aangetoond door de verhoogde expressie van deze twee markers na stimulatie met gefunctionaliseerde 50:50 CPTEG: CPH nanodeeltjes in vergelijking met de verkregen uitdrukking niet-gefunctionaliseerde deeltjes.

De werkzaamheid van koolhydraten aangrijpende middelen rechtstreeks nanodeeltjes interacties immuuncellen is eerder aangetoond ^{10, 11.} Eerder onderzoek in laboratoria hebben aangetoond dat specifieke suikers aan polyanhydride nanodeeltjes kunnen verschillende CLRs richten op antigeen presenterende cellen (APC's), waardoor de activatie van immuuncellen wat belangrijk kan zijn voor verdere T cel activatie ^{10, 11.} Echter, om een ​​optimaal richten op een aantal parameters, zoals de polyanhydride chemie, de grootte, het type suiker of oppervlakte-suiker-dichtheid moeten worden geoptimaliseerd en daarmee het verhogen van de overslag in de fabricage methode om opgraven van de complexiteit van een dergelijke multi-parametrische systeem zal zijn van grote waarde. Bovendien is het gebruik van gefunctionaliseerde nanodeeltjes of van grote waarde andere vlak van onderzoek, zoals biosensing, enzym immobilisatie en detectie van foodborne ziekteverwekkers.

Door gebruik te maken van de beschreven high-throughput synthese van koolhydraten, kan de uitdagingen op het reproduceerbare synthese van koolhydraten moleculen worden verzacht. Geautomatiseerde parallel reacties van dezelfde suiker kan produceren grotere hoeveelheden van het materiaal als dat nodig is. De bekende rollen van suikers en glycoconjugaten breiden zich snel uit. Toch een goed begrip van de moleculaire mechanismen van koolhydraten in vele processen, bijvoorbeeld signaaltransductiewegen of mobiele erkenning processen ^21, is gebaseerd op de eenvoudige en goedkope beschikbaarheid van structureel goed gedefinieerde sacchariden. Bescherming / ontscherming strategieën om de reactiviteit van verscheidene hydroxylgroepen voor nauwkeurige ketenverlenging besturen een eerste vereiste voor suiker synthese maar vervelend en tijdrovend. Oligonucleotiden en Oligopeptiden regelmatig en efficiënt gesynthetiseerd door automatische synthesizers ^{22, 23.} Een vaste fase synthesizer is ava ilable voor de synthese van oligosaccharide ^24, maar kampt met een aantal ernstige nadelen: bijvoorbeeld grote excessen van bouwstenen (5 tot 20 equivalenten per koppeling stap), het ontbreken van een gemakkelijke controle van de reactie van de vooruitgang, en de inherente variabiliteit van de gebruikte vaste-fase harsen . Een nieuwe oplossing fase automatiseringsplatform vereist echter slechts 2 tot 3 equivalenten van deze waardevolle bouwstenen. In dit platform verschillende fluorous labels, zoals alkenyl fluorous groep kan fluorous vaste fase extractie (FSPE) gemakkelijk te zuiveren de tussenproducten van niet-fluorous verbindingen ^{18, 25, 26.} Maar, zoals hier getoond, hoeft deze tags niet in de weg oplossing-fase glycosylering en ontscherming reacties in standaard organische oplosmiddelen. Ook, in tegenstelling tot een vaste-fase geautomatiseerde synthesizer, dit nieuwe platform biedt standaard reactie van de controle strategieën, zoals massaspectrometrie (MS) en dunne laag chromatografie (TLC) in elke fase.