Перенос генов в старых куриных эмбрионов на Бывший ово Электропорация

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы осуществить перенос генов в более старые куриные эмбрионы in vivo для изучения функции и регуляции генов на более высоких стадиях развития. Это достигается путем первого разбивания яйцеклетки примерно на 2,5-й день инкубации и переноса всего эмбриона в систему чашек Петри. Второй шаг заключается во введении плазмиды, кодирующей интересующий ген, в соответствующую часть эмбриона.

После введения плазмиды поместите электроды рядом с эмбрионом и выполните X-ovo-электропорацию, заключительным этапом является сбор электропорированных эмбрионов для анализа. В конечном счете, иммуногистохимия используется для обнаружения экспрессии перенесенных генов в эмбрионе. Сегодня мы покажем вам, как сделать X-овальную электропорацию с помощью куриных BUL.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что X-гипер-электропорация может преодолеть проблемы гиперэлектропорации, используемой для переноса генов у старых куриных эмбрионов. Успешная X-яйцеклетка куриных эмбрионов требует использования свежих оплодотворенных яиц. Не используйте яйца, хранящиеся при температуре 12 градусов Цельсия дольше одной недели.

Положите яйца на их длинные стороны в инкубатор с принудительной тягой при температуре 37,5 градусов Цельсия и влажности 60% после инкубации в течение 2,5 дней. Когда эмбрионы находятся примерно в гамбургере и Гамильтоне. Этап 17, вынимаем яйца из инкубатора.

Пометьте верхнюю часть каждого яйца карандашом, чтобы указать направление раскалывания для каждого яйца. Налейте около 20 миллилитров стерильной дистиллированной воды в чистую большую чашку Петри диаметром 145 миллиметров. Поместите маленькую стерильную чашку Петри диаметром 94 миллиметра в большую чашку Петри.

Далее разбейте каждое яйцо на дне об острый металлический край. Осторожно откройте яйцо и переложите все его содержимое в маленькую чашку Петри. Чтобы обеспечить хорошее качество эмбриона, все содержимое яйца должно быть сохранено в нормально круглой форме в системе чашек Петри без какого-либо повреждения мембраны вилина.

Переложив содержимое каждого яйца в маленькую посуду, накройте большую посуду крышкой. Поместите системы чашек Петри в другой инкубатор для дальнейшего культивирования при температуре 37,5 градусов Цельсия и влажности около 60% перед электропорацией X-ovo. Используйте полярный микроэлектрод для вытягивания стеклянных капилляров из стеклянных трубок диаметром 1,0 миллиметра.

Разбейте кончик стеклянных капилляров до соответствующего диаметра. Затем настройте соответствующие параметры для электропорации, такие как различные напряжения для различных тканей и размера эмбрионов. Подключите соответствующие электроды к электромобилю в соответствии с целевой тканью и размером эмбрионов.

Приготовьте раствор плазмиды, содержащий плазмиды, кодирующие ген-мишень и ген-маркер. В этой демонстрации кадгерин семь или ИБС семь является мишенью, а зеленый флуоресцентный белок или GFP является маркером. Добавьте быстрый зеленый до конечной концентрации 0,1%, чтобы пометить раствор плазмиды зеленым цветом.

Наконец, с помощью ротовой пипетки заполните стеклянный капилляр раствором плазмиды. Куриные эмбрионы из культуры X ovo, которые инкубировались в течение шести дней, используют для электропорации X ovo. Чтобы начать эту процедуру, с помощью тонких щипцов осторожно порвите тайленовую и амнионную мембраны над тектумом зрительного нерва и добавьте три капли стерильного 0,9%-ного раствора хлорида натрия на поверхность тектума.

С помощью ротовой пипетки введите плазмидный раствор из стеклянного капилляра в полость тектума. Поместите электроды с вольфрамовым игольчатым катодом и прямоугольным пластинчатым анодом рядом с тектумом. Немедленно используйте электро для подачи электрических импульсов на тектум.

Накройте большую чашку Петри крышкой и верните ее в инкубатор через два-три дня после электропорации плазмид, кодирующих GFP и CAD seven, в тектум курицы в точке Е шесть, тектумы собираются и фиксируются для иммуноокрашивания. Результаты показаны на этом рисунке в точке Е восемь. Белок GFP сильно экспрессируется в тумбе, как показано на этих изображениях здесь.

Панель А представляет собой изображение с ярким полем. Панель B — это изображение GFP, а на ней отображается панель C. Кроме того, на срезах тектума в точке Е девять белков GFP, визуализированных зеленым цветом на панели D и CAD, семь белков, визуализированных красным цветом на панели E, соэкспрессируются, как показано желтым цветом на панели F. При правильном выполнении эффективность электропорации X ovo составляет от 60 до 100%. Эти результаты свидетельствуют о том, что электропорация X ovo является успешным методом переноса генов в более старые куриные эмбрионы in vivo.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как выполнять перенос генов в более старые куриные эмбрионы, и удачи в вашем эксперименте.