Name: Pequenas e Wide Angle X-Ray Scattering Estudos de macromoléculas biológicas em solução (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 53 s
Description: Aprenda a técnica SWAXS para caracterização de macromoléculas biológicas em solução. Este método permite analisar estruturas em escala atômica e nanométrica com alta resolução.

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Gostaríamos de agradecer ao Dr. Manfred Kriechbaum de XRS Hecus e do Instituto de Biofísica e Pesquisa Nanosystems da Academia Austríaca de Ciências, em Graz, na Áustria. LL e XW foram apoiados em parte pelo Departamento de Energia dos EUA, sob NERI-C Prêmio N ° DE-FG07-07ID14889, e dos EUA Comissão Reguladora Nuclear, sob n º Prêmio NRC-38-08-950. O instrumento SWAXS também é suportado, em parte, pelo Departamento de Energia dos EUA, sob Prêmio N ° DE-NE0000325.

1. Preparação da Amostra <ol><li> Use uma agulha para retirar alguma da amostra a partir do recipiente da amostra. * </li><li> Usar a agulha para encher o capilar (diâmetro máximo de 2,2 mm) com a amostra. O capilar deve ser cheio entre 2 e 3 cm do fundo. </li><li> Feche o capilar por cera derretida em sua ponta. </li><li> Desaparafusar o suporte de amostra do sistema de vácuo. </li><li> Leve o capilar até o final fundido (fim de cera) e insira a ponta não-fundido no suporte da amostra. </li><li> Colocar o suporte de volta para o sistema e o parafuso no lugar. </li></ol> * As amostras sólidas (incluindo as amostras de pó) pode ser directamente colocada no suporte da amostra (sem necessidade de capilar), ao passo que as amostras de líquido deve ser colocado em um tubo capilar. Start-Up da Máquina SWAXS 2. Fonte procedimento de inicialização a frio <ol><li> Feche o obturador, pressionando o botão do obturador de segurança. </li><li> Mudar a alimentação principal&quot;ON&quot;, empurrando o verde no botão. </li><li> Verifique se o Emergency &quot;Shut-Off&quot; está na posição estendida. </li><li> Mudar a alimentação principal, pressionando o botão verde. </li><li> Verifique se o bloqueio de luz LED fica verde, indicando todos os bloqueios são ok. </li><li> Aguarde a tela de toque para carregar. Uma vez carregado, pressione &quot;R6&quot; no menu. </li><li> Gire a chave de espera para a posição &quot;ON&quot;. </li><li> Gire a chave de raios-X para a posição &quot;ON&quot;. A luz vermelha de raios-X deve acender. </li><li> Aguarde a tela de toque para ler os níveis de reserva (30 kV e 0,4 mA). </li><li> Gire a chave de segurança de espera para a posição &quot;OFF&quot;. Pressione o botão &quot;Iniciar Ciclo&quot; botão na parte inferior da tela sensível ao toque. </li><li> Aguarde a tela de toque para ler potência nominal (50 kV e 1 mA). Se um nível de potência diferente for desejada, entrar na tela de configuração pressionando &quot;R4&quot; na tela de toque e digitar as configurações desejadas. </li></ol> 3. Procedimento Chiller <ol><li> Vire o swi podertch para a posição &quot;ON&quot; no painel de controle de temperatura. A luz de controle eo indicador de temperatura LED acenderá. </li><li> Ligue o interruptor para a posição &quot;ON&quot; no chiller. </li><li> Aguarde até que o indicador de temperatura lê &quot;OFF&quot;. Este é o modo de espera. </li><li> Pressione e segure o botão enter (símbolo de retorno) por cerca de 4 segundos ou até que o indicador de temperatura indica uma temperatura real. </li><li> Para alterar a temperatura, pressione para cima ou seta para baixo. O valor ajustado será apresentado no visor de temperatura para cerca de 8 segundos antes de regressar ao valor real. </li><li> Pressione o botão Enter uma vez que o valor conjunto desejado seja exibido. Isto vai armazenar esse valor. </li><li> Aguarde até que a temperatura real atinge o valor ajustado desejado. </li></ol> NOTA: Se a qualquer momento o erro &quot;E 01&quot; aparece no visor da temperatura, siga as instruções Chiller desligamento, recarga da unidade banho de água purificada por vazamento no tanque de fill, e em seguida, executar o procedimento de inicialização chiller novamente. 4. Desligamento de Chiller <ol><li> Pressione &quot;Enter&quot; para cerca de 4 seg. </li><li> Ligue o interruptor para a posição &quot;OFF&quot;. </li></ol> 5. Ligar o vácuo <ol><li> Garantir a porta de vácuo é mantido em seu lugar. </li><li> Vire o vácuo 1 e 2 botões para o &quot;on&quot; posições. </li><li> Espere até que o manómetro de vácuo VAP5 lê um nível de vácuo inferior a 1,5 mbar. </li></ol> 6. Configuração do Sistema detector <ol><li> Para configurar a pressão do gás, verifique se o manômetro principal da válvula de redução de pelo menos 10 bar. </li><li> Abrir a válvula principal. </li><li> Abra lentamente a válvula de pressão de operação até que a pressão atinge 8 bar no manômetro operacional. </li><li> Abra a segunda válvula principal </li><li> Para ajustar o fluxo de gás, abra a válvula de pressão principal, girando o botão para a posição vertical no painel de controle de gás. </li><li> Ajustar o fluxotaxa com a válvula de agulha até que o medidor lê a cerca de 8 bar. </li><li> Ligue o interruptor principal para a posição &quot;ON&quot;. O LED deve acender. </li><li> Para ajustar a tensão alta, ativar a alta tensão, girando o botão para a posição &quot;ON&quot;. O LED deve acender. </li><li> Lentamente gire o botão de controle de tensão até aproximadamente 3.5kV é atingido no medidor. NÃO ULTRAPASSAR 4kV. </li></ol> 7. Calibragem <ol><li> Os passos experimentais acima são realizados com uma amostra de picos conhecidos. </li><li> ASA 3.3 é usado para obter o gráfico da intensidade vs canal com 5 picos. </li><li> Vá para Menu → Opções → Digite canais e intensidades correspondentes. </li><li> Ir para ASA3, &quot;TPF&quot; guia primeiro. </li><li> Mudar o filtro, parte superior esquerda um milímetro de níquel (feixe de filtro). </li><li> Definir a posição 32.000 (faixa de 28.000 a 32.000, região crítica em torno de 28.000) → ir para a posição, fazer vácuo certeza está abaixo de 5 mbar, certifique-se que o detector é reading entre 1k-10K. </li><li> Correr durante 10 segundos para cerca de 52 contagens por segundo. </li><li> Alterar as janelas de energia, (ou medir a janela de energia com a amostra apenas, não incluindo o caso do filtro). Definir a corrida final por 10 seg. </li><li> Encontrar a localização do feixe primário (233 de canal, por exemplo). </li><li> Para outras corridas, mudar filtrar novamente a 2 milímetros de tungstênio (W, feixe de rolha) e começar a partir de 30.000. </li><li> Encontrar a localização de todos os outros picos das amostras. </li><li> Use ImageJ macro-software para calibrar SAXS - fazer transições de intensidade versus canal de intensidade versus q (espaçamento d ou) (Figura 1). </li><li> Use ImageJ macro-software para calibrar WAXS - fazer transições de intensidade versus canal de intensidade versus q (espaçamento d ou) (Figura 2). </li></ol> 8. Procedimento software <ol><li> Use o software ASA 3.3, para coletar os dados ao vivo: Live Data → TPF guia → Salvar arquivo. </li><li> Para EasySWAXS, clique na guia Configurações do dispositivo. </li><li> Introduzir o &quot;a&quot;, lambda, e os valores de d, assim como o centro de gravidade. </li><li> Selecione Colimação Point. </li><li> Seleccione o tipo de partículas globulares (a menos que seja um conhecido por ser uma haste de partícula em forma plana). </li><li> Clique na aba Guinier-Plot. Um eu vs q 2 gráfico será exibido. </li><li> Arraste as linhas verticais para cercar uma seção de inclinação aproximadamente linear. </li><li> Na parte inferior da tela, um valor de R será exibida. Em seguida a isso, há uma exigência de validação. </li><li> Continue a arrastar as linhas verticais mais juntos até que o valor de validação está entre 1 e 2. Isso é subjetivo. O valor de R, ou raio de giro, obtido é uma estimativa. </li></ol> 9. Procedimento Shutdown fonte <ol><li> Verificar a segurança e persianas rápidas estão fechados. </li><li> Gire a chave de espera para a posição &quot;ON&quot;. </li><li> Aguarde até que o ecrã táctil para ler níveis de espera. </li><li> Imprensa R5 no touchscreen. </li><li> Reduzir a corrente a 0 A. </li><li> Reduzir a tensão a 0 A. </li><li> Gire a chave de raios-X para a posição &quot;OFF&quot;. </li><li> Mude o principal poder &quot;OFF&quot; pressionando o botão de desligar vermelho. </li></ol>

<ol><li>Bernadó, P., Blackledge, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology%3A+Proteins+in+dynamic+equilibrium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural biology: Proteins in dynamic equilibrium.</a> Nature. 468, 1046-1048 (2010).</li>
<li>Zhang, F., Skoda, M. W. A., Jacobs, R. M. J., Martin, R. A., Martin, C. M., Schreiber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Interactions+Studied+by+SAXS%3A+Effect+of+Ionic+Strength+and+Protein+Concentration+for+BSA+in+Aqueous+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Protein Interactions Studied by SAXS: Effect of Ionic Strength and Protein Concentration for BSA in Aqueous Solutions.</a> J. Phys. Chem. B. 111, 251-259 (2007).</li>
<li>Maranas, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+environment+on+local+dynamics+of+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Colloid+%26+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">The effect of environment on local dynamics of macromolecules.</a> Current Opinion in Colloid & Interface Science. 12, 29-42 (2007).</li>
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<li>Mertens, H. D., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+proteins+and+complexes+using+small-angle+X-ray+solution+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of proteins and complexes using small-angle X-ray solution scattering.</a> J. Struct. Biol. 172 (1), 128(2010).</li>
<li>Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-angle+X-ray+and+neutron+scattering+as+a+tool+for+structural+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Small-angle X-ray and neutron scattering as a tool for structural systems biology.</a> Biol. Chem. 391 (7), 737(2010).</li>
<li>Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+solution+scattering+%28SAXS%29+combined+with+crystallography+and+computation%3A+defining+accurate+macromolecular+structures%2C+conformations+and+assemblies+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Quat.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution.</a> Quat. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).</li>
<li>Bonini, M., Fratini, E., Baglioni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAXS+study+of+chain-like+structures+formed+by+magnetic+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+%26+Engineering+C-Biomimetic+and+Supramolecular+Systems%22%5BJournal%5D)">SAXS study of chain-like structures formed by magnetic nanoparticles.</a> Materials Science & Engineering C-Biomimetic and Supramolecular Systems. 27 (5-8), 1377-1381 (2007).</li>
<li>Falletta, E., Ridi, F., Fratini, E., Vannucci, C., Canton, P., Bianchi, S., Castelvetro, V., Baglioni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tri-block+copolymer+templated+synthesis+of+gold+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">A tri-block copolymer templated synthesis of gold nanostructures.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 357 (1), 88-94 (2011).</li>
<li>Glatter, O., Scherf, G., Schillen, K., Brown, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Poly%28ethylene+oxide%29+Poly%28propylene+oxide%29+Triblock+Copolymer+%28EO%2827%29-PO39-EO%2827%29%29+in+Aqueous-Solution%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Poly(ethylene oxide) Poly(propylene oxide) Triblock Copolymer (EO(27)-PO39-EO(27)) in Aqueous-Solution.</a> Macromolecules. 27 (21), 6046-6054 (1994).</li>
<li>Mittelbach, R., Glatter, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+structure+analysis+of+small-angle+scattering+data+from+polydisperse+colloidal+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Direct structure analysis of small-angle scattering data from polydisperse colloidal particles.</a> Journal of Applied Crystallography. 31, 600-608 (1998).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O procedimento comparativo do sistema SWAXS permite numerosas variáveis ​​a serem determinadas a partir da análise experimental. Os parâmetros que são obtidos a partir da análise podem ser usados ​​para diferentes finalidades de acordo com a amostra e montagem experimental. SAXS fornece informações sobre o nano-escala de tamanho e forma do objecto, enquanto que se concentra em WAXS estrutura atómica e micro-escala (eg molecular reticulado, unidade de simetria dimensão da célula). Mais especificamente, para as p...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome dos produtos </td><td> Companhia </td></tr><tr><td> O System3 pequena e grande-angular de espalhamento de raios X (SWAXS) Camera </td><td> Hecus XRS e IBN, Graz, Áustria </td></tr><tr><td> GNOM </td><td> ATSAS pacote de 2,3 por D. Svergun EMBL-Hamburgo </td></tr></tbody></table>

pequenas e wide angle x-ray scattering estudos de macromoléculas biológicas em solução

Small and Wide Angle X-Ray Scattering Studies of Biological Macromolecules in Solution

Neste artigo, Pequenas e Wide Angle X-ray Scattering análise (SWAXS) de macromoléculas é demonstrado através da experimentação. SWAXS é uma técnica na qual os raios X são elasticamente espalhados por uma amostra não homogéneo na gama nm-em ângulos pequenos (tipicamente 0,1 - 5 °) e ângulos de largura (normalmente&gt; 5 °). Esta técnica fornece informações sobre a forma, tamanho e distribuição de macromoléculas, distâncias característicos de materiais parcialmente ordenados, tamanhos de poro, e de superfície-para-volume. Pequeno ângulo de raios X Scattering (SAXS) é capaz de fornecer informação estrutural de macromoléculas entre 1 e 200 nm, enquanto Wide Angle X-ray Scattering (WAXS) podem resolver ainda menor espaçamento Bragg de amostras entre 0,33 nm e 0,49 nm com base na configuração do sistema específico e detector. O espaçamento é determinada a partir da lei de Bragg e é dependente do comprimento de onda e do ângulo de incidência. Em uma experiência SWAXS, os materiais podem ser sólidasou um líquido e pode conter sólidos, líquidos ou gasosos domínios (os chamados partículas) do mesmo material ou de outro, em qualquer combinação. Aplicações SWAXS são muito amplos e incluem colóides de todos os tipos: metais, compósitos, cimento, petróleo, polímeros, plásticos, proteínas, alimentos e produtos farmacêuticos. Para amostras sólidas, a espessura é limitado a cerca de 5 mm. O uso de um instrumento SWAXS baseado em laboratório é detalhado neste documento. Com o software disponível (por exemplo, GNOM-ATSAS pacote 2,3 por D. Svergun EMBL-Hamburg e software EasySWAXS) para o sistema SWAXS, uma experiência pode ser conduzida para determinar certos parâmetros de interesse para a amostra dada. Um exemplo de uma experiência de macromolécula biológica é a análise de 2% em peso de lisozima num tampão à base de água aquosa que pode ser escolhido e preparado através de vários métodos. A preparação da amostra segue as orientações abaixo na preparação da seção da amostra. Através da experimentação SWAXS,importantes parâmetros estruturais da lisozima, por exemplo, o raio de rotação, podem ser analisadas.

SAXS e WAXS completo pode fornecer informações sobre a estrutura da amostra através dos seguintes parâmetros: o raio de giração de tamanho de partícula e forma, o factor de estrutura de solução, superfície interna específica e dimensão de poro, tipo treliça e dimensão e densidade electrónica 1. SAXS e WAXS pode também ser aplicado ao estudo da dinâmica das proteínas 2. A informação estrutural de experiências SWAXS é obtida através da comparação dos espectros detectado e...

A demonstração do ângulo pequeno e amplo dispersão de raios X procedimento (SWAXS) tornou-se essencial para o estudo de macromoléculas biológicas. Através da utilização da instrumentação e procedimentos de métodos específicos de ângulo e de preparação, os dados experimentais dos SWAXS mostra a caracterização atómica e nano-escala de macromoléculas.

Pequenas e Wide Angle X-Ray Scattering Estudos de macromoléculas biológicas em solução

Neste artigo, a análise de macromoléculas por Espalhamento de Raios X a Pequenos e Grandes Ângulos (SWAXS) é demonstrada por meio de experimentação. O SWAXS é uma técnica...

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Research

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Bioengineering

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