Name: Hazırlanması Drosophila Orta Nöronlar In situ Patch Sıkma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Öğrenin, Drosophila uçuş motor nöronlarını in situ patch clamp kayıtları için nasıl hazırlayacağınızı. GFP etiketleme ve proteaz uygulamasıyla nöron erişimini kolaylaştırarak elektrofizyolojik çalışmalarda kullanın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol><li>Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Tempel, B. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+genomic+and+complementary+DNA+from+Shaker%2C+a+putative+potassium+channel+gene+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cloning of genomic and complementary DNA from Shaker, a putative potassium channel gene from Drosophila.</a> Science. 237, 749-753 (1987).</li>
<li>Tempel, B. L., Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+a+probable+potassium+channel+component+encoded+at+Shaker+locus+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sequence of a probable potassium channel component encoded at Shaker locus of Drosophila.</a> Science. 237, 770-775 (1987).</li>
<li>Gu, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Cell+Recordings+from+Brain+of+Adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila.</a> J. Vis. Exp. (6), e248(2007).</li>
<li>Gu, H., Jiang, S. A., Campusano, J. M., Iniguez, J., Su, H., Hoang, A. A., Lavian, M., Sun, X., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cav2-type+calcium+channels+encoded+by+cac+regulate+AP-independent+neurotransmitter+release+at+cholinergic+synapses+in+adult+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Cav2-type calcium channels encoded by cac regulate AP-independent neurotransmitter release at cholinergic synapses in adult Drosophila brain.</a> J. Neurophysiol. 101, 42-53 (2009).</li>
<li>Baines, R. A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+development+of+central+neurons+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo.</a> J. Neurosci. 18, 4673-4683 (1998).</li>
<li>Lin, W. H., Wright, D. E., Muraro, N. I., Baines, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+in+the+voltage-gated+sodium+channel+DmNav+regulates+activation%2C+inactivation%2C+and+persistent+current%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing in the voltage-gated sodium channel DmNav regulates activation, inactivation, and persistent current.</a> J. Neurophysiol. 102, 1994-2006 (2009).</li>
<li>Worrell, J. W., Levine, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+voltage-dependent+Ca2%2B+currents+in+identified+Drosophila+motoneurons+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of voltage-dependent Ca2+ currents in identified Drosophila motoneurons in situ.</a> J. Neurophysiol. 100, 868-878 (2008).</li>
<li>Srinivasan, S., Lance, K., Levine, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+differences+in+firing+properties+and+potassium+currents+in+Drosophila+larval+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Segmental differences in firing properties and potassium currents in Drosophila larval motoneurons.</a> J. Neurophysiol. , (2011).</li>
<li>Choi, J. C., Park, D., Griffith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+and+morphological+characterization+of+identified+motor+neurons+in+the+Drosophila+third+instar+larva+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological and morphological characterization of identified motor neurons in the Drosophila third instar larva central nervous system.</a> J. Neurophysiol. 91, 2353-2365 (2004).</li>
<li>Pulver, S. R., Griffith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spike+integration+and+cellular+memory+in+a+rhythmic+network+from+Na%2B%2FK%2B+pump+current+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spike integration and cellular memory in a rhythmic network from Na+/K+ pump current dynamics.</a> Nat. Neurosci. 13, 53-59 (2010).</li>
<li>Fayyazuddin, A., Zaheer, M. A., Hiesinger, P. R., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nicotinic+acetylcholine+receptor+Dalpha7+is+required+for+an+escape+behavior+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The nicotinic acetylcholine receptor Dalpha7 is required for an escape behavior in Drosophila.</a> PLoS Biol. 4, e63(2006).</li>
<li>Duch, C., Vonhoff, F., Ryglewski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrite+elongation+and+dendritic+branching+are+affected+separately+by+different+forms+of+intrinsic+motoneuron+excitability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Dendrite elongation and dendritic branching are affected separately by different forms of intrinsic motoneuron excitability.</a> J. Neurophysiol. 100, 2525-2536 (2008).</li>
<li>Ryglewski, S., Duch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaker+and+Shal+mediate+transient+calcium-independent+potassium+current+in+a+Drosophila+flight+motoneuron%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Shaker and Shal mediate transient calcium-independent potassium current in a Drosophila flight motoneuron.</a> J. Neurophysiol. 102, 3673-3688 (2009).</li>
<li>Ryglewski, S., Lance, K., Levine, R. B., Duch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cav2+Channels+Mediate+LVA+and+HVA+Calcium+Currents+in+Drosophila+Motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cav2 Channels Mediate LVA and HVA Calcium Currents in Drosophila Motoneurons.</a> J. Physiol. , (2011).</li>
<li>Ikeda, K., Koenig, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+identification+of+the+motor+neurons+innervating+the+dorsal+longitudinal+flight+muscle+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Morphological identification of the motor neurons innervating the dorsal longitudinal flight muscle of Drosophila melanogaster.</a> J. Comp. Neurol. 1273, 436-444 (1988).</li>
<li>Boerner, J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Mount+Preparation+of+the+Adult+Drosophila+Ventral+Nerve+Cord+for+Giant+Fiber+Dye+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection.</a> J. Vis. Exp. (52), e3080(2011).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

GFP gibi floresan proteinleri ile hücrelerin görselleştirmek zaman, çok fazla ışığı hazırlık aşırı maruz bırakmayın önemlidir. Bu fotoğraf hasara neden olabilir. Biz aydınlatma için 100W HBO kısa ark cıva ampul kullanmak, ve biz de 0.8 (Chroma ND filtreler 0.3 ve 0.5) nötr yoğunluğu (ND) kullanın. Temizlik iyi bir görünürlük kalitesini yargılamak için edebilmek için önemlidir. Bu nedenle, ND filtre birden çok kez için yaklaşık 20 saniyelik kısa bir süre için kaldırılmış olabilir. Bazı poziti...

<table border="1"><tbody><tr><td> Ajan / öğe </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Proteaz türü XIV </td><td> Sigma Aldrich USA </td><td> P5147 </td></tr><tr><td> Mikrofil esnek enjeksiyon iğnesi </td><td> Dünya Precision Instruments ABD </td><td> MF28G-5 </td></tr><tr><td> Borosilikat Cam kılcal, od 1.5 mm, 1.0 mm id, hiçbir filament </td><td> Dünya Precision Instruments ABD </td><td> PG52151-4 </td></tr><tr><td> DII </td><td> Invitrogen ABD </td><td> D3899 </td></tr><tr><td> Sylgard Elastomer Seti 184 (Dow Corning) </td><td> <a href="http://www.ellsworth.com" target="_blank">www.ellsworth.com</a> </td><td> 184 SIL ELAST TAKIMI </td></tr><tr><td> ND filtre seti (monte edilmemiş) </td><td> Renk parlaklığı </td><td> 22000b serisi </td></tr><tr><td> Elektrot tutucu 1-HL-U </td><td> Molecular Cihazlar </td><td> HL-1-U </td></tr></tbody></table>

hazırlanması<em&gt; drosophila</emiçin&gt; orta nöronlar<em&gt; in situ</em&gt; patch sıkma

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

Kısa üretim süreleri ve basit genetik teknikler meyve sineği Drosophila melanogaster temel sinirbilim araştırması mükemmel bir genetik model olun. Onlar nöronal uyarılabilirliği arabuluculuk yana İyon kanalları tüm davranışların temelini oluşturur. Klonlanmış birinci voltaj kapılı iyon kanalı Drosophila voltaj bağımlı potasyum kanalı Shaker 1,2 idi. Sinir sistemi fonksiyonu için iyon kanalları ve membran eksitabilite rolünü anlamak doğru yerinde yama klemp kayıtları ile Drosophila güçlü genetik mevcut araçları birleştirmek için yararlıdır. Uzun yıllar boyunca bu kayıtlar Drosophila MSS küçük boyutu nedeniyle zorlanıyor. Ayrıca, glia ve kollajen yapılmış sağlam bir kılıf merkezi nöronlara yama pipet erişimlerinde engeller oluşturmuştur. Bu kılıf kaldırılmasını yetişkin Drosophila CNS herhangi bir nörondan yama kelepçe kayıt için gerekli bir ön koşuldur. Son yıllardabilim adamları yetişkin beyin 3,4 ve embriyonik 5,6, larva 7,8,9,10 ve yetişkin Drosophila 11,12,13,14 ventral sinir kablosunu nöronlardan yerinde yama klemp kayıtları yapmak mümkün olmuştur. İstikrarlı giga-mühür iyi bir yama için temel ön ve kaçak akımları önlemek için hücre zarı ile yama pipet temiz bir temas bağlıdır. Bu nedenle, erişkin Drosophila nöronların yerinde yama klemp kayıtları tüm hücre için iyice temizlenmesi gerekir. İlk adım olarak, ganglionik kılıf enzimatik olarak tedavi edilmesi için olan ve mekanik olarak hedef hücrelere erişilebilir hale getirmek için kaldırılmıştır. İkinci adımda, zar glia hücre, kolajen ya da diğer herhangi bir malzeme tabakası giga yapışma oluşumunun bozabilir, böylece cilalı gerekir. Bu makalede, somatik bütün c Drosophila ventral sinir kablosu, uçuş motonöron 5 (MN5 15), bir tespit merkez nöron nasıl hazırlanacağını anlatırell yama klemp kayıtları. Nöron tanımlanması ve görünürlük MN5 içinde GFP hedeflenen ifade ile elde edilir. Biz yama klemp tekniği kendisini açıklamak amacı yoktur.

In situ yama kelepçe kayıtları bozulmamış devresi nöronların elektrofizyolojik karakterizasyon için kullanılır. MSS küçük ve sağlam bir kılıf ile çevrili olduğundan Drosophila genetik model yama klemp ise zordur. Bu makale sonraki yama klemp kayıtları için kılıf ve temiz nöronlar kaldırmak için prosedürü açıklar.

Hazırlanması<em&gt; Drosophila</emIçin&gt; Orta Nöronlar<em&gt; In situ</em&gt; Patch Sıkma

Kısa nesil süreleri ve kolay genetik teknikler, meyve sineği Drosophila melanogaster'i temel nörobilimde mükemmel bir genetik model haline getirmektedir...

Bu prosedürün genel amacı, Drosophila uçuş motor nöron beşini C2 patch clamp kayıtları için hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle Drosophila ventral sinir kordonunun, 40x su daldırma objektif kullanılarak GFP etiketli uçuş motor nöronları bir ila beş aracılığıyla görüntülenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, motor nöron beşe erişimi engelleyen debris glia ve trakeaları gevşetmek amacıyla, GFP etiketli motor nöronlara proteaz uygulamak için proteaz dolu bir patch pipeti kullanılır.Ardından, gevşemiş döküntüler ve glia hücreleri pipetle nazikçe çekilerek ve pozitif ile negatif basınç uygulanarak trakea kenara çekilip uzaklaştırılarak temizlenir. Alternatif olarak, bu aşamada, GFP filtresiyle floresan ışık altında görülmeyen kalıntılar parlak alan ışığı kullanılarak temizlenir. Sonuç olarak, temizlenmiş motor nöron beş parlak alan ışığında hafifçe görülebilirken, GFP filtresiyle floresan ışık kullanıldığında net bir şekilde görülür.Hücreler 15 ila 20 dakika boyunca salin ile yıkandıktan sonra, müteakip situ iki patch clamp kayıtları için hazırlanırlar. Bugün size göstereceğim prosedür, nörofizyoloji alanındaki hangi iyon kanallarının hangi iyonik akımlara ve dolayısıyla hangi iyonik

preparation-of-drosophila-central-neurons-for-in-situ-patch-clamping

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu teknik immünohistokimya veya elektrofizyolojik kayıt için Drosophila embriyonik neuromusculature ortaya çıkarır. Nöromüsküler gelişiminde erken olayları okuyan veya yumurtadan değil mutantlar elektrofizyoloji yapmak için yararlıdır.

Hasat ve hazırlanması Drosophila</emElektrofizyolojik Kayıt ve Diğer İşlemler> Embriyolar

Elektrofizyolojik Kayıt Drosophila Embriyo

Biz sahnelenen hazırlamak için prosedürü...

Tüm montaj Embriyonik Sinir Sistemi Görselleştirme Drosophila Embriyolar

Video, bir tam hücre konfigürasyonu oluşturarak Drosophila'nın ommatidiumunun fotoreseptör nöronlarındaki elektriksel aktivitenin kaydedilmesini göstermektedir. Geçici reseptör potansiyel kanallarının ışık darbeleri ile aktivasyonunu vurgular ve ölçülebilir kuantum çarpmalarına neden olur.

Drosophila Fotoreseptörlerinden Tüm Hücre Voltaj Kelepçesi Kayıtları

Ince yapı analizi için nöronal işlemleri korumak için, camsı bir buz tabakası içinde süspansiyon haline numune verecek şekilde flaş dondurma, ardından elektron mikroskobu taramalarında primer nöron kaplanması için bir protokol açıklar. Bu örnekler nanometre ölçeğinde yapıları görselleştirmek için bir kriyo-elektron mikroskobu ile muayene edilebilir.

Cryo-Elektron Tomografi kullanma Frozen-hidratlı Devlette neurites görselleştirme İlköğretim Nöronlar hazırlanması

Bu protokol, düz monte hazırlık retina nöronlar üzerinde tüm hücre yama kelepçe kayıt yapmak gösterilmiştir.

Deafferentated Fare Retina bir düz montaj Hazırlık patlaması amacrine hücreleri Yama Kelepçe Kaydı

Drosophila melanogaster fotoreptörlerinden alınan bütün hücreli kayıtlar, çeşitli koşullar altında kendiliğinden oluşan karanlık yumruları, kuantum darbeleri, ışığa karşı makroskopik tepkileri ve akım-voltaj ilişkilerini ölçebilir. D. melanogaster genetik manipülasyon araçları ile birlikte bu yöntem, her yerde bulunan inositol-lipid sinyal yolunu ve TRP kanalının hedefini incelemeyi mümkün kılar.

Tam Hücreli Gerilim Kelepçesi Kayıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em&gt; Drosophila</emPhotoreceptors

Sinaptik akımları, Drosophila Üçüncü INSTAR larva nöromüsküler kavşak görüntülenmeyecektir sinaptik boutons üzerinden focally kaydedilebilir. Bu teknik, tek bir sinaptik bouton etkinliğini izleme sağlar.

Drosophila larva nöromüsküler kavşak sinaptik akımlardan Fokal Macropatch kayıtları

Bu makalede tarafından istihdam Tetradotoksin ve Tetradotoksin dayanıklı sodyum kanal, NaChBac arasındaki monosynaptic bağlantıları sınamak için bir yöntem sunar.

Tetradotoksin dayanıklı sodyum kanallarını kullanarak Drosophila Monosynaptic bağlantıları inceleyerek

Bu yazıda, Xenopus laevis Kurbağa yavrularını retinotectal devre eğitim için tüm cep telefonu yama kelepçe kaydetmek için kullanılan üç beyin hazırlıkları görüşmek. Kendi belirli avantajları ile her hazırlık Xenopus iribaş deneysel tractability nöral devre işlevi incelemek için bir model olarak katkıda bulunmaktadır.

Ürünleri ve tüm hücre yama kelepçe kayıt Xenopus laevis Tectal nöronlar için iletişim kuralları

Öğrenin, Drosophila uçuş motor nöronlarını in situ patch clamp kayıtları için nasıl hazırlayacağınızı. GFP etiketleme ve proteaz uygulamasıyla nöron erişimini kolaylaştırarak elektrofizyolojik çalışmalarda kullanın.

Hazırlanması

Daha fazla video keşfet