Name: Preparação de Drosophila Os neurônios centrais para In situ Patch aperto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Aprenda a preparar neurônios motores de Drosophila para gravações de patch clamp in situ usando marcação GFP e aplicação de protease. Este método permite o estudo eletrofisiológico de circuitos neurais intactos em modelo genético.

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<ol><li>Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Tempel, B. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+genomic+and+complementary+DNA+from+Shaker%2C+a+putative+potassium+channel+gene+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cloning of genomic and complementary DNA from Shaker, a putative potassium channel gene from Drosophila.</a> Science. 237, 749-753 (1987).</li>
<li>Tempel, B. L., Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+a+probable+potassium+channel+component+encoded+at+Shaker+locus+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sequence of a probable potassium channel component encoded at Shaker locus of Drosophila.</a> Science. 237, 770-775 (1987).</li>
<li>Gu, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Cell+Recordings+from+Brain+of+Adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila.</a> J. Vis. Exp. (6), e248(2007).</li>
<li>Gu, H., Jiang, S. A., Campusano, J. M., Iniguez, J., Su, H., Hoang, A. A., Lavian, M., Sun, X., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cav2-type+calcium+channels+encoded+by+cac+regulate+AP-independent+neurotransmitter+release+at+cholinergic+synapses+in+adult+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Cav2-type calcium channels encoded by cac regulate AP-independent neurotransmitter release at cholinergic synapses in adult Drosophila brain.</a> J. Neurophysiol. 101, 42-53 (2009).</li>
<li>Baines, R. A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+development+of+central+neurons+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo.</a> J. Neurosci. 18, 4673-4683 (1998).</li>
<li>Lin, W. H., Wright, D. E., Muraro, N. I., Baines, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+in+the+voltage-gated+sodium+channel+DmNav+regulates+activation%2C+inactivation%2C+and+persistent+current%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing in the voltage-gated sodium channel DmNav regulates activation, inactivation, and persistent current.</a> J. Neurophysiol. 102, 1994-2006 (2009).</li>
<li>Worrell, J. W., Levine, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+voltage-dependent+Ca2%2B+currents+in+identified+Drosophila+motoneurons+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of voltage-dependent Ca2+ currents in identified Drosophila motoneurons in situ.</a> J. Neurophysiol. 100, 868-878 (2008).</li>
<li>Srinivasan, S., Lance, K., Levine, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+differences+in+firing+properties+and+potassium+currents+in+Drosophila+larval+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Segmental differences in firing properties and potassium currents in Drosophila larval motoneurons.</a> J. Neurophysiol. , (2011).</li>
<li>Choi, J. C., Park, D., Griffith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+and+morphological+characterization+of+identified+motor+neurons+in+the+Drosophila+third+instar+larva+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological and morphological characterization of identified motor neurons in the Drosophila third instar larva central nervous system.</a> J. Neurophysiol. 91, 2353-2365 (2004).</li>
<li>Pulver, S. R., Griffith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spike+integration+and+cellular+memory+in+a+rhythmic+network+from+Na%2B%2FK%2B+pump+current+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spike integration and cellular memory in a rhythmic network from Na+/K+ pump current dynamics.</a> Nat. Neurosci. 13, 53-59 (2010).</li>
<li>Fayyazuddin, A., Zaheer, M. A., Hiesinger, P. R., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nicotinic+acetylcholine+receptor+Dalpha7+is+required+for+an+escape+behavior+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The nicotinic acetylcholine receptor Dalpha7 is required for an escape behavior in Drosophila.</a> PLoS Biol. 4, e63(2006).</li>
<li>Duch, C., Vonhoff, F., Ryglewski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrite+elongation+and+dendritic+branching+are+affected+separately+by+different+forms+of+intrinsic+motoneuron+excitability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Dendrite elongation and dendritic branching are affected separately by different forms of intrinsic motoneuron excitability.</a> J. Neurophysiol. 100, 2525-2536 (2008).</li>
<li>Ryglewski, S., Duch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaker+and+Shal+mediate+transient+calcium-independent+potassium+current+in+a+Drosophila+flight+motoneuron%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Shaker and Shal mediate transient calcium-independent potassium current in a Drosophila flight motoneuron.</a> J. Neurophysiol. 102, 3673-3688 (2009).</li>
<li>Ryglewski, S., Lance, K., Levine, R. B., Duch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cav2+Channels+Mediate+LVA+and+HVA+Calcium+Currents+in+Drosophila+Motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cav2 Channels Mediate LVA and HVA Calcium Currents in Drosophila Motoneurons.</a> J. Physiol. , (2011).</li>
<li>Ikeda, K., Koenig, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+identification+of+the+motor+neurons+innervating+the+dorsal+longitudinal+flight+muscle+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Morphological identification of the motor neurons innervating the dorsal longitudinal flight muscle of Drosophila melanogaster.</a> J. Comp. Neurol. 1273, 436-444 (1988).</li>
<li>Boerner, J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Mount+Preparation+of+the+Adult+Drosophila+Ventral+Nerve+Cord+for+Giant+Fiber+Dye+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection.</a> J. Vis. Exp. (52), e3080(2011).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Quando a visualização das células com proteínas fluorescentes como GFP, é importante não sobre-exposição da preparação a muita luz. Isto pode resultar em dano da foto. Usamos 100W HBO lâmpadas de mercúrio de arco curto para iluminação, e também usamos de densidade neutra (ND) de 0,8 (filtros ND Chroma 0,3 e 0,5). Para ser capaz de avaliar a qualidade da limpeza boa visibilidade é crucial. Por conseguinte, os filtros podem ser removidos ND por curtos períodos de cerca de 20 s para múltiplas vezes. <p class="jove_cont...

<table border="1"><tbody><tr><td> Agente / item </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Protease tipo XIV </td><td> Sigma Aldrich EUA </td><td> P5147 </td></tr><tr><td> Microfil agulha flexível </td><td> Mundo Precision Instruments EUA </td><td> MF28G-5 </td></tr><tr><td> Os capilares de vidro de borosilicato, od 1,5 mm, id 1,0 mm, sem filamento </td><td> Mundo Precision Instruments EUA </td><td> PG52151-4 </td></tr><tr><td> DiI </td><td> Invitrogen EUA </td><td> D3899 </td></tr><tr><td> Elastômero Sylgard Kit 184 (Dow Corning) </td><td> <a href="http://www.ellsworth.com" target="_blank">www.ellsworth.com</a> </td><td> 184 SIL ELAST KIT </td></tr><tr><td> Filtro ND conjunto (desmontado) </td><td> Chroma </td><td> Série 22000b </td></tr><tr><td> Suporte do eléctrodo 1-HL-U </td><td> MoDispositivos lecular </td><td> HL-1-U </td></tr></tbody></table>

preparação de<em&gt; drosophila</em&gt; os neurônios centrais para<em&gt; in situ</em&gt; patch aperto

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

Tempos de geração curtos e fáceis técnicas genéticas fazer a mosca da fruta Drosophila melanogaster um modelo excelente genética na pesquisa em neurociência fundamental. Canais iônicos são a base de todo o comportamento uma vez que medeiam a excitabilidade neuronal. O primeiro canal de iões de tensão gated clonado era a tensão Drosophila canal de potássio gated Shaker 1,2. Para a compreensão do papel dos canais iônicos e excitabilidade de membrana para a função do sistema nervoso é útil para combinar poderosas ferramentas genéticas disponíveis em Drosophila em gravações com braçadeira situ patch. Durante muitos anos, tais gravações foram dificultados pelo pequeno tamanho do CNS de Drosophila. Além disso, uma bainha resistente feita de colagénio e células gliais constituído obstáculos para o acesso à @ patch pipette @ neurónios centrais. A remoção desse revestimento é uma condição necessária para gravações de patch clamp de qualquer neurônio no SNC adultos de Drosophila. Nos últimos anosos cientistas foram capazes de conduzir em gravações de fixação in situ de patch de neurônios no cérebro adulto 3,4 e cordão nervoso ventral embrionário 5,6, 7,8,9,10 larval e adulto Drosophila 11,12,13,14. Um estábulo giga-seal é a principal condição prévia para um bom patch e depende de contacto perfeito da pipeta remendo com a membrana celular a fim de evitar as correntes de fuga. Portanto, para a célula inteira em gravações de patch situ braçadeira de neurônios adultos de Drosophila deve ser bem limpo. No primeiro passo, a bainha ganglionar tem de ser tratado enzimaticamente e removido mecanicamente para tornar as células alvo acessíveis. No segundo passo, a membrana da célula tem de ser polida, de modo que nenhuma camada de material de colagénio glia, ou outro pode perturbar giga-seal formação. Este artigo descreve como preparar um neurônio central identificada no cordão nervoso ventral Drosophila, o motoneurônio vôo 5 (MN5 15), para todo c somáticaell gravações patch clamp. Identificação e visibilidade do neurónio é alcançado através da expressão da GFP específica de MN5. Nós não têm o objetivo de explicar a técnica patch clamp si.

No patch situ gravações de fixação são usados ​​para a caracterização eletrofisiológica dos neurônios no circuito intacto. No modelo genético Drosophila patch clamping é difícil, porque o SNC é pequeno e está rodeado por uma bainha robusto. Este artigo descreve o procedimento para remover os neurônios bainha e limpa para gravações posteriores braçadeira de patches.

Preparação de<em&gt; Drosophila</em&gt; Os neurônios centrais para<em&gt; In situ</em&gt; Patch aperto

Tempos de geração curtos e técnicas genéticas facilitadas tornam a mosca-das-frutas Drosophila melanogaster um excelente modelo genético na neurociência fundamental...

O objetivo geral deste procedimento é preparar o neurônio motor do voo cinco de Drosophila para gravações por patch clamp em C dois. Isso é realizado primeiramente visualizando o cordão nervoso ventral de Drosophila com os neurônios motores do voo marcados com GFP, de um a cinco, por meio de uma lente de imersão em água de 40x. O segundo passo é usar uma pipeta de patch quebrada e preenchida com protease para aplicar protease sobre os neurônios motores marcados com GFP, a fim de soltar a glia de resíduos e a traqueia que obstruem o acesso ao neurônio motor cinco.Em seguida, os detritos, a glia e a traqueia são removidos sugando suavemente os detritos e a glia soltos para dentro da pipeta e puxando a traqueia para fora do caminho mediante a aplicação de pressão positiva e negativa. Alternativamente, neste momento, utiliza-se luz intensa para remover os detritos remanescentes que não podem ser vistos com luz fluorescente através de um filtro GFP. Em última análise, o neurônio motor cinco limpo pode ser visto levemente à luz intensa, mas é bem visualizado usando luz fluorescente com filtro GFP.Após lavar as células com solução salina por 15 a 20 minutos, elas ficam prontas para gravaç

preparation-of-drosophila-central-neurons-for-in-situ-patch-clamping

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Esta técnica expõe a Drosophila neuromusculature embrionárias para imuno-histoquímica ou gravação eletrofisiológico. É útil para o estudo de eventos no início do desenvolvimento neuromuscular ou a realização de eletrofisiologia em mutantes que não podem eclodir.

Colheita e Preparação Drosophila Os embriões para Gravação eletrofisiológicos e outros procedimentos

Gravação eletrofisiológicas na Drosophila Embrião

Nós descrevemos o procedimento para preparar...

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O vídeo demonstra o registro da atividade elétrica nos neurônios fotorreceptores do omatídio de Drosophila, estabelecendo uma configuração de célula inteira. Ele destaca a ativação de canais potenciais de receptores transitórios por pulsos de luz, resultando em solavancos quânticos mensuráveis.

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Para preservar processos neuronais para análise ultra-estrutural, nós descrevemos um protocolo para revestimento dos neurônios primários em grades de microscopia eletrônica seguido de congelamento flash, rendendo amostras suspensas em uma camada de gelo vítreo. Essas amostras podem ser examinadas com um microscópio crio-eletrônico para visualizar estruturas em escala nanométrica.

Preparação de primário neurônios para visualizar Neuritos num Estado Frozen-hidratado Usando Cryo-Electron Tomografia

Este protocolo demonstra como executar de células inteiras de gravação patch-clamp em neurônios da retina a partir de uma preparação flat-mount.

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As gravações de células inteiras dos fotorreceptores Drosophila melanogaster permitem a medição de solavancos escuros espontâneos, colisões quânticas, respostas macroscópicas à luz e relações tensão-tensão em várias condições. Em combinação com as ferramentas de manipulação genética de D. melanogaster , este método permite o estudo da via de sinalização inositol-lipídico ubíqua e seu alvo, o canal TRP.

Método eletrofisiológico para gravações de tensão de célula inteira de<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores

Correntes sinápticas podem ser gravadas focally de boutons sinápticas visualizados na drosófila terceiro ínstar larvas junção neuromuscular. Esta técnica permite monitorar a atividade de um único bouton sináptica.

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Este artigo apresenta um método para testar as monosynaptic conexões entre neurônios empregando tetrodotoxina e o canal de sódio tetrodotoxina-resistente, NaChBac.

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Neste artigo, discutimos três cérebro as preparações para a gravação de grampo celular patch para estudar o circuito retinotectal de girinos de Xenopus laevis . Cada preparação, com suas próprias vantagens específicas, contribui para a rastreabilidade experimental da larva Xenopus como um modelo para estudar a função do circuito neural.

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