Name: ex vivoでマウス神経上皮における単一細胞分裂のライブイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: 学ぶマウスE8.5神経上皮における単一細胞分裂のex vivoライブイメージング法。タイムラプス共焦点顕微鏡と蛍光マーカーを用いて、発生神経科学における細胞動態のリアルタイム観察を可能にする。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

この研究プロジェクトは、ARRAサプリメント、5 R01 NS056380によってサポートされていました。追加のサポートは、ウイルスベクターコアとエモリー神経NINDSコア設備助成、P30NS055077の顕微鏡コアを介して提供されました。 SSTR3-GFPレンチウイルスコンストラクトのために、ブラッドリーYoder発信;安定SSTR3-GFP IMCD3細胞ラインのグレッグPazour、我々はGENSATからマウスラインを導出するためのコアをターゲットエモリートランスジェニックマウスと遺伝子に感謝します。モノクローナル抗体は、NICHDの後援の下で開発された発達研究ハイブリドーマ銀行、、から入手し、アイオワ大学、生物科学科、アイオワシティ、アイオワ52242によって維持された。すべての動物の手順はIACUCとエモリー大学のバイオセーフティ委員会によって承認された。

成体マウスは、機械頸椎脱臼により安楽死させる。すべての動物の手順はIACUCとエモリー大学のバイオセーフティ委員会によって承認された。 1。胚の生成<ol><li>クロスタモキシフェン誘導性Creをライン、CAGGCreER、およびdsRedCreレポーターライン点（Tg（CAG-Bgeo、-DsRedを* MST）1Nagy）（ 図1）5,6。娘細胞、クロスCAGGCreERとOlig2-EGFP BACトランスジェニックマウス（Tgは（Olig2-EGFP）EK23Gsat）（ 図1）7,8とDsRedのラインにおけるShhの応答の相対的なタイミングを監視する。 </li><li> 100％エタノールでタモキシフェンを溶解し、Creの発現と細胞の小さなサブセットでDsRedのラベルを誘導するために胚6.5（E6.5）で妊娠した女性に体重40グラムあたり2.5 mgのタモキシフェンの腹腔内注射を行う。 </li><li> 48時間、後、胚を解剖蛍光顕微鏡を用いたDsRed肯定胚を特定し、培養皿にそれらを転送しobservex vivoでの撮影時の電子の単一細胞分裂（下記参照）。 </li></ol> 2。全体マウス胚培養<ol><li> 10％新生仔ウシ血清及び1％ペニシリン/ストレプトマイシン（P / S）9を補充したDMEM/F12（1:1）を含む予め温めた洗浄媒体でE8.5胚を解剖する。 </li><li>直接蛍光顕微鏡下で37℃の加熱ステージ上で解剖、場所後の胚及びGFPおよび/またはDsRedをプラス（下記参照）として識別します。 </li><li> L-グルタミン、フェノールレッドを含まない50％のSprague-Dawley系雄性ラットの血清および50％DMEM/F12（1:1）を含む予め平衡培地500μlの降下との1％に2胚まで転送0.85％NaCl及びP / S 9の1M HEPES。 </li><li>蒸発を防ぎ、培養皿を37℃、5％CO 2インキュベーターに胚を含む転送する媒体を介して平衡化した軽油の薄い層（0.1センチ）を適用します。 </li></ol> 3。ウイルス感染<ol><li>神経上皮におけるラベル繊毛するためには、E8.5胚を含む培養培地500μlの平衡化の一滴までSSTR3-GFPレンチウイルスの5-10μlを、約200万ビリオンを追加します。 </li><li>文化の18時間後、ウイル​​スを洗い流すと、神経管のスライスを準備するために洗浄媒体の数滴に感染した胚を移す。 </li></ol> 4。ライブイメージングのための神経管のスライス標本<ol><li> 1％寒天コーティングされた皿に、マイクロナイフの大きさ0.025ミリメートルを使用して予め温めておいた洗浄媒体におけるE8.5胚の神経管を解剖。 </li><li> 35ミリメートルポリ-L-リジンコートガラスボトムディッシュ上のフェノールレッドなしの平衡化培地150μlのドロップで孤立神経管腹側を下に置きます。 </li><li>するために、ガラスカバースリップの狭い部分で100％純粋なワセリンとマウント神経管の周りに溶けたろうそくのろう（IKEAからろうそく）、ゆっくりと押しから作られた1:1の混合物の少量を入れてサンプルを固定。 </li><li>平衡化した軽油の薄い層（〜0.1センチメートル）（ 図2）皿をカバーしています。 </li></ol> 5。ライブイメージングとタイムラプス共焦点顕微鏡<ol><li>温度を調節する環境室を装備ニコンA1Rレーザ走査共焦点倒立顕微鏡下に置く皿は、37℃、5％CO 2を設定してください。 </li><li> 40倍の油浸対物レンズの使用がOlig2-GFPとDsRedの陽性細胞を監視する一方、GFPラベル繊毛とDsRedの陽性細胞を記録するために60倍の油浸対物レンズを使用してください。 </li><li>タイムラプス撮影条件を設定するためにNISの要素ソフトウェアを開きます。 10分ごとに1.5ミクロン（40倍目標）と0.4μmの（60倍目標）の間隔で最大8ミクロンの間隔で25ミクロンまでのzスタックを取得する。必要に応じて488と561 nmの励起波長と送信チャネルを使用してください。 512×512のサイズで画像を取得する。 int型の複数のユーザ定義領域を設定する同時記録​​を行うことerest。 、スキャン速度1、線平均2とピンホールの大きさ（61、画像のレーザパワーと明るさに最適な露出、使用低いレーザー強度（4.5％までEGFP 488分の405 mCherry 561は最大11％）で調整したDsRedのためのミクロン; Olig2ための28.1ミクロン; SSTR3GFPための72ミクロン、DsRedのとSSTR3GFPための61.3ミクロン、DsRedのとOlig2用58ミクロン）。遺伝的に符号化された蛍光レポーターの使用は、低レーザパワーと明るさを検出することができました。 </li><li> Imaris 3D再構築ソフトウェアを使用して記録されたデータを分析します。 </li></ol> 6。免疫蛍光<ol><li>ガラス皿で1時間氷上で4％パラホルムアルデヒド/ 0.1 Mリン酸緩衝液（4℃）で胚あるいは孤立神経チューブを固定します。 </li><li>氷（4℃）でPBSのサンプル2時間（変化PBS数回）洗浄し、一晩または胚シンクまで、30％スクロース/ 0.1Mリン酸緩衝液に入れ。 </li><li> -80でドライアイスや店舗℃の上、10月に凍結を埋め込むPクライオスタット（10ミリメートル）で切片erform。 </li><li> 1％の熱不活化羊血清および0.1％トリトンX-100 PBS中を含む洗浄溶液中で10分間スライドを洗浄します。 </li><li>ウサギ抗血清Arl13b 1:1500及びマウスモノクローナル抗Arl13b 1時05分（295B/54）;、ウサギ抗Olig2ラットモノクローナル抗RFP（5F8）、1:200以下の濃度で洗浄溶液中の一次抗体を希釈1:300、マウスモノクローナルPax6の、シーッとNkx2.2-すべて1時10分、およびKi67の1:500ポリクローナルウサギ。乾燥避け、4℃で一晩のままにフラット加湿チャンバー内のスライドあたり150μlの、パラフィルムでカバー周り追加℃に</li><li>三回、20分毎に時間室温で洗浄溶液中でスライドを洗浄します。 </li><li> 1:200濃度の洗浄溶液で二次抗体アレクサフルーア488、568、350を希釈。核を染色するためにヘキスト1:3,000またはTO-PRO-3 1:500を使用します。スライドあたり150μlを添加し、光から保護加湿チャンバー内で室温で1時間のままにしておきます。 </li><li>洗浄ソリューションTWのスライドを洗うoが時間、室温で30分間、毎回。 </li><li> 80％でマウントスライドは24時間以内にゴールドアンチフェード試薬およびビューを延ばす。 </li></ol>

<ol><li>Yamada, T., Pfaff, S. L., Edlund, T., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+pattern+in+the+neural+tube%3A+motor+neuron+induction+by+diffusible+factors+from+notochord+and+floor+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of cell pattern in the neural tube: motor neuron induction by diffusible factors from notochord and floor plate.</a> Cell. 73, 673-686 (1993).</li>
<li>Ericson, J., Muhr, J., Placzek, M., Lints, T., Jessell, T. M., Edlund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+induces+the+differentiation+of+ventral+forebrain+neurons%3A+A+common+signal+for+ventral+patterning+within+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog induces the differentiation of ventral forebrain neurons: A common signal for ventral patterning within the neural tube.</a> Cell. 81, 747-756 (1995).</li>
<li>Briscoe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeodomain+Protein+Code+Specifies+Progenitor+Cell+Identity+and+Neuronal+Fate+in+the+Ventral+Neural+Tube%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Homeodomain Protein Code Specifies Progenitor Cell Identity and Neuronal Fate in the Ventral Neural Tube.</a> Cell. 101, 435-445 (2000).</li>
<li>Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+ciliary+localization+sequences+within+the+third+intracellular+loop+of+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors.</a> Mol. Biol. Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).</li>
<li>Vintersten, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+red%3A+red+fluorescent+protein+expression+in+mouse+ES+cells%2C+embryos%2C+and+adult+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals.</a> Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).</li>
<li>Hayashi, S., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+recombination+in+diverse+tissue+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre%3A+a+tool+for+temporally+regulated+gene+activation%2Finactivation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient recombination in diverse tissue by a tamoxifen-inducible form of Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse.</a> Dev. Biol. 244 (2), 305-318 (2002).</li>
<li>Gong, S., Zheng, C., Doughty, M. L., Losos, K., Didkovsky, N., Schambra, U. B., Nowak, N. J., Joyner, A., Leblanc, G., Hatten, M. E., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Deneen, B., Lukaszewicz, A., Novitch, B. G., Wichterle, H., Jessell, T. M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olig2%2B+neuroepithelial+motoneuron+progenitors+are+not+multipotent+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Olig2+ neuroepithelial motoneuron progenitors are not multipotent stem cells in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1551-1556 (2006).</li>
<li>Jones, E. A. V., Crotty, D., Kulesa, P. M., Waters, C. W., Baron, M. H., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+in+vivo+imaging+of+postimplantation+mammalian+embryos+using+whole+embryo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture.</a> Genesis. 34, 228-235 (2002).</li>
<li>Piotrowska-Nitsche, K., Caspary, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+individual+cell+divisions+in+mouse+neuroepithelium+shows+asymmetry+in+cilium+formation+and+Sonic+hedgehog+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Live imaging of individual cell divisions in mouse neuroepithelium shows asymmetry in cilium formation and Sonic hedgehog response.</a> Cilia. 1 (6), In Press (2012).</li>
<li>Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mouse+development+with+confocal+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Enzymology. 476, 351-377 (2010).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されていない。

当社のex vivoでシステムが直接、リアルタイムで開発神経上皮内の単一細胞分裂を観察することを可能にします。例として、我々はマウス胚神経管の中に細胞分裂を検討し、繊毛形成またはShhの応答のいずれかを監視した。私たちは、イメージング結果（N = 24）私たちの技術は生理学的に適切なデータを提供示す固定部（N = 178）の結果と一致していたことを確認した。 我々の手法は、タモキシフェンの投与量が正確でなければならないので、細胞のサブセットに限定されるものではCreの誘導に依存しています。我々は、単一の細胞を標識するための投薬を働いた。我々は、それがタモキシフェン6に用量依存的な反応を示したCAGGcreERラインの初期分析に基づく線量のわずかな増加と細胞の小さなクローンにラベルを付けることは簡単だろうと考えています。条件がオフである場合に発達異常が発生するとさらに、胚培養条件は、重要である。私たちは、開発は、少なくとも36時間11のために働くことが知られている我々が使用される培養条件...

<table><tbody><tr><td>Z/RED系統 (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>005438</td><td></td></tr><tr><td>Olig2-eGFP系統 (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd</td><td>MMRRC,</td><td>010555-UCD</td><td></td></tr><tr><td>CAGGCreER</td><td>Jackson Laboratory</td><td>003724</td><td></td></tr><tr><td>タモキシフェン</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>GIBCO</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>新生仔牛血清</td><td>Lonza</td><td>14-416F</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ラット血清（SDオス）</td><td>Harlan Bioproducts</td><td>4520</td><td></td></tr><tr><td>1M Hepes</td><td>BioWhittaker</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>GIBCO</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>軽質液体パラフィン</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Sstr3-GFPレンチウイルス</td><td>Emory Viral Core</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロナイフ、サイズ 0.025 mm</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62091</td><td></td></tr><tr><td>35 mm ポリ-L-リシンコートガラスボトムディッシュ</td><td>MatTek</td><td>P35GC-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>100% ワセリン</td><td>Kroger</td><td>FL9958c</td><td></td></tr><tr><td>A1R レーザー走査共焦点倒立顕微鏡</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements ソフトウェア</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 3D ソフトウェア</td><td>Bitplane AG</td><td>Imaris 7.2.3</td><td></td></tr><tr><td>OCT化合物</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>クリオスタット</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>熱不活化羊血清</td><td>Invitrogen</td><td>16210-072</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝液</td><td>自製</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ラットモノクローナルanti-RFP (5F8)</td><td>Chromotek</td><td>110411</td><td></td></tr><tr><td>ウサギanti-Arl13b血清</td><td>NeuroMab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マウスモノクローナルanti-Arl13b 1:5</td><td>NeuroMab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウサギanti-Olig2</td><td>Chemicon</td><td>AB9610</td><td></td></tr><tr><td>マウスモノクローナル Pax6</td><td>Developmental Hybridoma Bank</td><td>Pax6</td><td></td></tr><tr><td>マウスモノクローナル Shh</td><td>Developmental Hybridoma Bank</td><td>5E1</td><td></td></tr><tr><td>マウスモノクローナル Nkx2.2</td><td>Developmental Hybridoma Bank</td><td>74.5A5</td><td></td></tr><tr><td>ウサギポリクローナル Ki67</td><td>Abcam</td><td>AB15580</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568</td><td>Molecular Probes</td><td>A11031</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 350</td><td>Molecular Probes</td><td>A11046</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst</td><td>Fisher</td><td>AC22989</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 退色防止剤</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivoでマウス神経上皮における単一細胞分裂のライブイメージング

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

私たちは、蛍光マーカーおよび胚マウス神経上皮の培養スライスのライブイメージングを統合するシステムを開発しました。私たちは、トレース系統遺伝細胞のための既存のマウス系統を利用しました：タモキシフェン誘導性CreのラインとのCreレポーターラインはCreを媒介組換えによりDsRedの発現。タモキシフェンの比較的低レベルを用いて、我々は我々は、個々の細胞分裂に従うことを可能にして、少数の細胞で組換えを誘導することができた。さらに、我々は、Olig2-EGFPトランスジェニックライン1-3を使用して、我々はウイルスが繊毛マーカー、SSTR3-GFP 4を発現培養スライスを感染させることにより繊毛の形成を監視シグナリング（シーッ）ソニック·ザ·ヘッジホッグに転写応答を観察した。イメージするためには神経上皮は、我々は神経管を単離し、E8.5で胚を採取し、撮影室への適切な培養条件の神経スライスをマウントし、タイムラプス共焦点イメージングを行った。当社EX生体ライブイメージング法は、一次繊毛形成と生理学的に適切な方法でShhの応答の相対的なタイミングを評価するために、単一の細胞分裂をトレースすることを可能にします。この方法は簡単明瞭な蛍光マーカーを使用して適応され、フィールドを、その場で 、リアルタイムで細胞の挙動を監視するためにどのとツールを提供しすることができます。

ここでは、E8.5マウス神経上皮内の単一細胞分裂のex vivoでのライブイメージングを行った。個々の細胞を標識するためには、組換え5,6（ 図3A）に基づいDsRedを表明したCreレポーター行を含む細胞のサブセットにCreリコンビナーゼを誘導した。したがって、48時間後に我々はex vivoでイメージング（ 図4A-D）の間に単一の細胞分裂を観察することができました。 1-3、標識された細胞は、BACトランスジェニックOlig2-EGFPライン（ 図4G-N図3C-D）に変更Shhの転写レポーターを含めて、Shhの応答になったときに付随して、我々は監視した。繊毛の形成を観察するために、我々は文化の中で胚を感染させるためにSSTR3-GFPレンチウイルスを生成した（ 図3B、図4A-D）4。免疫蛍光は、 インビボの結果（ 図4E-F） で</...

ここでは、のために必要なツールを開発<em&gt; ex vivoで</emマウスE8.5神経上皮内の単一細胞分裂をトレースする&gt;ライブイメージング

我々は、蛍光マーカーのライブイメージングと、マウス胚神経上皮スライスの培養を統合したシステムを開発した。我々は……を活用した。

本手順の全体的な目的は、マウス胚の神経上皮スライス培養において、蛍光マーカーのライブイメージングを統合することです。まず、誘導型CreマウスラインとCreリポーターラインを交配させ、分裂中の細胞を遺伝的に可視化して標識します。次に、マウス胚全体を解剖し、レンチウイルスの存在下でin vitro培養を行います。次に、胚をスライスして、ライブイメージング用の神経管切片を調製します。最後に、タイムラプス共焦点顕微鏡を用いて神経管切片のイメージングを行います。これにより、ex vivo ライブイメージングを通じて、発達中の神経上皮における単一細胞分裂をリアルタイムで直接観察した結果を得ることができます。このプロトコルの強みは、個々の細胞をin vivoでモニタリングでき、それによって各細胞のシグナル伝達イベントおよび各細胞の挙動に関する問いを立てられる点にあります。まず、タモキシフェン誘導性Creマウス系統であるCAGG CRE ERと、DsRed Creレポーター系統を交配させます。娘細胞におけるsonic hedgehog応答の相対的なタイミングをモニタリングするには、CAGG CRE ER ds red系統をOG two EEGと交配させます。FPバックトランスジェニックマウスを用い、タモキシフェンを100%エタノールに溶解させ、妊娠E 6.5の雌に腹腔内投与することで、胚細胞の少数のサブセットにおいてCRE発現とDS red標識を誘導しました。48時間後、胚を摘出し、蛍光顕微鏡を用いてDS red陽性の胚を特定します。これらを培養皿に移し、ex vivoイメージングにより単一細胞分裂を観察します。E 8.5胚を、10%新生仔牛血清および1%ペニシリン・ストレプトマイシンを添加したD-M-E-M-F 12の1:1混合溶液を含む、予熱済みの洗浄培地内で解剖します。ステージを37 °Cに加温した蛍光顕微鏡下で、または37 °Cのホットプレートの傍らで、直ちにGFPおよび/またはDS RED陽性の胚を同定します。最大2個までの胚を、あらかじめ平衡化した500 µLの培養液のドロップへと転移させます。蒸発を防ぐため、培地上に平衡化したライトミネラルオイルを薄く重ね、胚を含む培養皿を37 °C、5% 二酸化炭素条件下でインキュベートします。神経上皮の繊毛を標識するため、胚を含む500 µLの平衡化した培養液のドロップに、S sst, R 3G FP レンチウイルスを5〜10 µL（約200万コピー）添加します。18時間培養した後、感染させた胚を数滴の洗浄用培地に移してウイルスを洗浄し、神経管スライスを調製します。胚を1%アガロースコート皿に移し、0.025 mmのマイクロナイフを用いて神経管を切り出します。フェノールレッド不含の平衡化培地150 µLを35 mmポリリシ

ex-vivo-live-imaging-of-single-cell-divisions-in-mouse-neuroepithelium

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

リアルタイムでイメージング胚組織では、長期間にわたって挑戦されています。ここでは、高い空間分解能と時間分解能で長時間ニワトリ脊髄の細胞とサブ細胞の変化を監視するためのアッセイを示す。この手法は、神経系や胚の他の地域に適応することができます。...

開発神​​経上皮における細胞挙動の高解像度のライブイメージング

出典:Daynac, M., et.alです。成体マウス脳室内ゾーンからの神経幹細胞および前駆細胞の細胞選別とそれらの細胞周期ダイナミクスのライブイメージング。J. Vis. Exp.

共焦点顕微鏡を用いたマウス神経幹細胞分裂のタイムラプスイメージング

出典:Ing-Esteves, S. &amp; Lefebvre, J. L. Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations.J. Vis. Exp.

マウス網膜外植片における神経細胞樹状細胞ダイナミクスのタイムラプス共焦点イメージング

神経芽細胞の遊走は、出生後の神経発生における基本的なイベントです。我々は、in vivoでの出生後のエレクトロポレーションおよび急性脳スライスのタイムラプスイメージングを使用して、移行のその後の視覚化によって神経芽細胞の効率的な標識のためのプロトコルを記述します。私たちは、ビデオトラッキングによる神経芽細胞の動態を定量的に分析するための説明が含まれています。...

生体産後エレクトロポレーションおよびマウスの急性脳スライスにおける神経芽細胞移動のタイムラプスイメージング中

このプロトコルは、画像に線虫（Caenorhabditis elegans）の胚における組織内の細胞を分割する方法について説明します。いくつかのプロトコルは、初期胚の画像細胞分裂に、このプロトコルはどのように中期後期胚形成の間に開発し、組織内の細胞分裂像に説明して方法について説明している。...

中に神経芽細胞細胞質分裂を可視化する<em&gt; C.虫</em&gt;胚

神経前駆有糸分裂は、神経新生の重要なパラメータである。神経前駆糸分裂の我々の理解の多くは、固定された組織の分析に基づいている。胚性脳スライス内のライブイメージングは​​、制御された環境で、高い時間·空間分解能で有糸分裂を評価するための汎用的な手法である。...

発生中のマウス胚性皮質における有糸分裂のライブイメージング

このプロトコルは、無傷の幼虫の脳のコンテキストで生細胞イメージングを行うために使用合理化された方法を説明します。ライブセルイメージングのアプローチは、一貫して、以前に見落とされたメカニズムを暴く、非対称神経幹細胞分裂の研究だけでなく、他の神経と発達過程のための非常に貴重である。...

のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経芽細胞

ここでは、共焦点顕微鏡とライブ イメージング技術に適したマウス胚から electroporated...

Ex 子宮エレクトロポレーションと gaba 作動性介在ニューロンの移行のライブ イメージング用マウス萌芽期の脳の脊髄スライス培養

ex vivoスライスアッセイは、オキュロ運動神経の成長をリアルタイムで画像化することを可能にします。スライスは、E10.5...

オキュロ運動神経増殖のタイムラプスイメージングのための胚性GFP発現マウスからのEx Vivo Oculomotorスライス培養

Ex Vivo Live Imagingを用いたマウス歯の再生中の細胞分裂と動きの調査

大脳皮質の発達中、ニューロンとグリア細胞は、心室の内側を覆う心室ゾーンで発生し、脳表面に向かって移動します。このプロセスには多くの遺伝子が関与しています。このプロトコルでは、移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージングの技術を紹介します。...

マウス胚脳切片における移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージング

学ぶマウスE8.5神経上皮における単一細胞分裂のex vivoライブイメージング法。タイムラプス共焦点顕微鏡と蛍光マーカーを用いて、発生神経科学における細胞動態のリアルタイム観察を可能にする。

ex vivoでマウス神経上皮における単一細胞分裂のライブイメージング

さらに動画を探す