Analisando o desenvolvimento de células de Schwann Murino Junto axônios em crescimento

O objetivo do experimento a seguir é analisar o desenvolvimento de células de schwan ao longo de axônios em crescimento, seu habitat natural. Isso é conseguido pela primeira explanação dos gânglios cervicais superiores, ou S cgs de embriões de camundongos em matrizes de colágeno como um segundo passo. Os S cgs são tratados com fator de crescimento nervoso ou NGF, que facilita o crescimento axonal dos neurônios SCG de forma coronal.

Além do crescimento axonal do explanamento X, as células endógenas de schwan podem ser observadas migrando ao longo dos axônios estendidos em direção à periferia. O desenvolvimento de células de Schwan pode ser analisado por imagens de lapso de tempo e também por análise de endpoint de tecido fixo, o que permite medições de distância. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como o ensaio de migração de arranhões, é que o habitat natural das células do cisne está incluído neste ensaio.

A demonstração visual desse método é crítica. Como a montagem correta das métricas de colágeno e a dissecção correta dos sgs são a chave para o sucesso. Essas etapas não são especialmente difíceis de aprender.

Eles só precisam praticar primeiro. Enquanto trabalhava em uma cultura de tecidos, Hood entendeu nossas condições com todas as soluções no gelo. Prepare o meio de cultura de estoque e o colágeno de cauda de rato de acordo com as instruções do protocolo escrito.

Misture 800 microlitros de colágeno de cauda de rato com 210 microlitros do meio padrão. Sem introduzir bolhas, a solução deve permanecer na cor vermelha. Se a solução ficar amarela, a solução de colágeno Ratal é muito ácida e precisa ser refeita com uma concentração maior de hidróxido de sódio pipeta 100 micro liberação da solução em cada poço de uma lâmina de vários poços e certifique-se de que o fundo de cada poço esteja completamente coberto.

Coloque os pratos em uma incubadora de cultura de tecidos umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por duas horas. Após a colheita, os embriões E 16 a E 18 são colocados em uma placa de Petri contendo PBS, em seguida, dissecados do âmnio e decapitados em um cordão nivelado do C clavicular. As regiões da cabeça e do pescoço são então transferidas para uma placa de fundo de silicone e, ao olhar através de um microscópio de dissecação, agulhas de insetos são usadas para prender o tecido nas regiões submandibular e clavicular.

Agora use uma pinça para remover a pele e o tecido subcutâneo da região submandibular. Em seguida, remova as glândulas salivares submandibulares para revelar os músculos supra-hióideo, infra-hial e esternocleidomastóideo. Em seguida, use uma pinça para remover cuidadosamente os músculos infra-hial e esternocleidomastóideo para revelar a laringe e a traqueia.

Segure a traqueia com a pinça e levante a traqueia e a laringe. Uma vez que a laringe e a traqueia foram removidas, as artérias carótidas são visíveis, são ambos os lados dos músculos pré-vertebrais. Os gânglios cervicais superiores estão localizados na bifurcação das artérias carótidas e podem ser identificados como uma forma oval.

Use uma pinça e um porta-agulha montado com uma agulha de inseto para remover os gânglios cervicais superiores e coloque em um prato fresco contendo PBS, em seguida, disseque quaisquer vasos sanguíneos ou tecido conectado dos gânglios. Com a ajuda de agulhas de seringa, remova os géis de colágeno gelatinizados da incubadora e use agulhas de seringa montadas em seringas para transferir os gânglios para os géis. Coloque os explantes na incubadora de cultura de tecidos ajustada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e condições úmidas por uma a duas horas.

Após uma a duas horas de incubação, os explantes do gânglio cervical superior são recuperados da incubadora de cultura de tecidos e 100 microlitros de meio neurobasal contendo suplemento B 27 glutamina e antibióticos são adicionados a cada x explan. Posteriormente, 200 microlitros de meio neurobasal contendo 60 nanogramas por mililitro. O NGF também é adicionado aos poços para facilitar o crescimento axonal.

Podem também ser adicionadas substâncias de ensaio neste momento, que é definido como dia in vitro zero para estudar o efeito nas células de cisne que já começaram a migrar. As substâncias axonais podem ser administradas em três dias in vitro, removendo 180 microlitros do meio existente e substituindo por 200 microlitros de meio contendo a substância de interesse e NGF no dobro da concentração final, a imagem de lapso de tempo é realizada usando uma configuração de microscópio invertido que permitirá a incubação de cultura de células paralela e imagens de lapso de tempo para comparar diferentes substâncias de teste. Em um experimento, uma configuração de várias posições é recomendada no ponto final do experimento.

Após fixar os explantes dentro das lâminas de cultura com 4% de PFA por três a quatro horas e lavar com PBS, realizar a imuno-histoquímica para validar o explante X, pois o SCG bloqueia o tecido com PBS contendo 10% de soro normal de burro e 2% de tritton X 100 por duas horas. Em seguida, siga com a incubação de anticorpos primários em solução de bloqueio durante a noite. No dia seguinte após a incubação de anticorpos primários, transfira o X explan contendo géis para uma placa de 24 poços após a lavagem com PBS, incube com anticorpos secundários marcados com fluorescência por duas horas enquanto protegido da luz, depois lave com PBS e incube com solução de dappy por 10 minutos.

Depois de lavar várias vezes, coloque os géis de colágeno contendo o X explan em um microscópio, deslize, seque as lâminas e, em seguida, monte com vitela. Use um microscópio fluorescente padrão para obter imagens para posterior análise quantitativa. É útil se o software do microscópio for capaz de registrar metadados.

A análise quantitativa das imagens obtidas pode ser realizada com o software Fiji ou ImageJ, que pode ser usado gratuitamente para aplicações científicas. O crescimento axonal de um SCGX EXPLAN esquemático durante quatro dias in vitro é demonstrado neste filme. A imuno-histoquímica pode ser realizada no quarto dia in vitro para identificar claramente o gânglio explantado.

Como um gânglio simpático, as células de schwan podem ser observadas migrando ao longo do axônio, movendo-se do gânglio cervical superior para a periferia. Este vídeo mostra o mesmo padrão de migração que acabamos de ver em uma ampliação maior. As distâncias de migração podem ser facilmente medidas em amostras contra-coloração para núcleos com DPI, medindo a distância dos núcleos das células schwan principais até a borda do SCG explantado em vários locais, conforme ilustrado no esquema e na imagem de uma amostra tratada com NGF rotulada com DPI em quatro dias in vitro, este filme mostra a migração de células schwan na borda de um explane SCG.

A combinação de campo claro e fluorescência permite a visualização de células de cisne positivas para S 100 GFP e dos axônios. Finalmente, este filme mostra a migração de células de schwan na borda de um gânglio cervical superior ex explan. Aqui, apenas o canal de fluorescência é mostrado, permitindo uma interpretação mais fácil das células schwan positivas para S 100 GFP.

Seguindo este procedimento, análises quantitativas adicionais podem ser realizadas, como a quantificação de uma proliferação celular ou a quantificação de uma apoptose celular. Obviamente, a imuno-histoquímica adequada deve ser realizada para análise de endpoint ou os animais transgênicos específicos devem ser usados para mostrar os efeitos no contexto de vida.