Name: Modelo de ratos de sangue-cérebro Rompimento de barreira para permitir alvejado Neurovascular Therapeutics (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Aprenda a romper a barreira hematoencefálica em ratos usando manitol intra-arterial para permitir a entrega de fármacos ao cérebro. Este método validado com corante Evans Blue possibilita testar terapias neurovasculares direcionadas.

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Este trabalho foi financiado pela Fundação Marshall JB.

1. Prepare Animal e Equipamentos para Procedimento <ol><li> Antes de iniciar a cirurgia, preparar o local cirúrgico e do animal. Fazer o cateter da carótida, inserindo uma agulha de calibre 23 em uma extremidade romba, de 12 &quot;de tubagem PE50. Cortar um chanfro de aproximadamente 45 ° na extremidade oposta do cateter. Esterilizar equipamento antes do procedimento. Usar uma capota de cabelo, máscara cirúrgica e luvas estéreis. </li><li> Coloque uma almofada de aquecimento sobre a superfície onde a cirurgia será realizada. Ative-a e deixe-o aquecer. Cobrir a área com um pano absorvente banco. </li><li> Verifique se você tem manitol 25% em solução sem cristais. Se estiverem presentes cristais, dissolvê-los, colocando o frasco num banho de água quente a 80 ° C e agitando periodicamente. </li><li> Registar a massa do animal. </li><li> Prepare uma diluição de propofol para entrega a 0,8 mg / kg / min, a uma taxa de 0,1 ml / min. </li><li> Colocar o rato na caixa de indução durante 3 min. Definições: 5% de isoflurano, 2 L / mintaxa de fluxo no ventilador. </li><li> Em cima de uma toalha descartável, fazer a barba do pescoço e duas coxas. </li></ol> 2. Entubar the Rat <ol><li> Colocar a parte de trás dos animais na caixa de indução durante 3 min. </li><li> Prepare o seu tubo endotraqueal com cateter IV. Para este tamanho e linhagem de rato, usamos um cateter 18 ga. O tubo deve ser grande o suficiente para permitir a ventilação adequada, mas pequena o suficiente para caber na traquéia sem causar danos. Puxe a agulha para fora do cateter de plástico e cuidadosamente quebrar a cerca de agulha. 1 cm da sua ponta afiada. A agulha bunted será a sua caneta. Colocar a parte de trás da agulha no cateter. </li><li> Desligar o rato pelos seus dentes sobre uma superfície inclinada. </li><li> Brilhar uma luz diretamente contra o pescoço do animal e alinhados entre suas orelhas. </li><li> Inserir uma cerca pequena espátula. 3 centímetros para a orofaringe. Levante para cima, enquanto puxando a língua para fora da boca. </li><li> Visualize a abertura da traqueia. Você vai seeA pequeno buraco aberto e próximo com cada respiração. </li><li> Insira cuidadosamente cateter no orifício. Às vezes você pode sentir o plástico entrar na cartilagem da traqueia. A traquéia é sensível. Não force o cateter. </li><li> Definir o ventilador a 1 L / min e 60 bpm e o isoflurano a 2%. </li><li> Conectar o cateter ao ventilador e o tubo de fita com a superfície de operação. </li><li> Verificar que o animal é anestesiado, realizando um aperto do dedo do pé. </li></ol> 3. Estabelecer Propofol Anesthesia IV <ol><li> Fixe o rato gravando todos os quatro membros ea cauda à superfície operacional. </li><li> Esfregue o pescoço raspada e sites virilha com clorexidina sabão três vezes. Em seguida, esfregue com clorexidina lavar três vezes. </li><li> Anexar uma seringa de propofol com um conjunto de extensão IV. Montar a seringa numa bomba de infusão. </li><li> Utilizando um bisturi, cortar através da pele da coxa rapada. Evitar o corte do músculo. </li><li> Abrir a incisão com uma forçaps para visualizar a veia femoral. </li><li> Puxar o tecido ao longo da artéria para expor o recipiente. </li><li> Insira um 26 ga Monoject veterinária cateter IV na veia. Quando a agulha perfura a parede da veia você vai sentir-se mais fácil de empurrar. Retrair a agulha e empurra o cateter dentro do vaso. </li><li> O início da infusão de propofol a 0,1 ml / min. </li><li> 3-5 min após o início da perfusão de propofol, mudar o gás de anestesia a uma mistura de 50% de O 2 e 50% de N 2 O e desligar o isoflurano. </li></ol> 4. Expor a bifurcação da artéria carótida comum <ol><li> Faça uma incisão na linha no pescoço com lâmina de bisturi. </li><li> Cortar entre os dois grandes glândulas salivares com tesoura ou bisturi. </li><li> Dissecar o tecido lateralmente à linha média para expor a artéria carótida. Use uma pinça para abrir as camadas de tecido. Você pode usar uma tesoura para retirar peças que você expõem com a pinça e determinar a ser minimally vascular. Controlar a hemorragia com gaze, cotonetes, e cauterização, se necessário. </li><li> Injectar 3 IP ml de soro fisiológico se houve moderada a forte sangramento. </li><li> Use afastadores para puxar tecido para longe da carótida. Encontrar a bifurcação. </li><li> Exponha a artéria occipital apenas distal à bifurcação. Cauterizar o entre fórceps e separá-lo com uma electrocauterização. </li><li> Use uma pinça para expor totalmente a bifurcação da carótida e tanto quanto do ECA possível. </li><li> Expor a artéria tireóide superior ramificando-se o ECA distal à artéria occipital. Cauterizar o entre fórceps e separá-lo com uma electrocauterização. </li></ol> 5. Cateterização da artéria carótida externa <ol><li> Coloque 2 comprimentos de 4/0 de seda sob o ECA. </li><li> Pegue um comprimento de sutura com sua pinça hemostática e recolher o ECA volta caudalmente (em direção aos pés do rato). </li><li> Tome a sutura outros e amarrar até cranialmente (para a boca do rato) como w possívelnó um cirurgião om o. Isso forma uma ligadura permanente para sacrificar o ECA. </li><li> Remova a pinça hemostática primeiro (o que foi aplicar tensão caudal) e pegar a sutura outro (o que é amarrado ao redor do ECA) e aplicar tensão suave cranialmente com a pinça hemostática. </li><li> Amarre outro nó cirurgião livremente (não proteger - deixar mal amarrado) distal para proximal da bifurcação e à ligadura permanente. </li><li> Irrigar com lidocaína a 1% para relaxar a artéria. </li><li> Preencha o seu cateter com solução salina heparinizada. </li><li> Colocar um clipe recipiente temporário tão perto quanto possível da bifurcação. Clipe lugar vaso em um ângulo para maximizar o espaço para a cateterização. Deslize o nó frouxo na direção do clipe. </li><li> Faça um pequeno arteriotomia (corte) no ECA apenas proximal à ligadura usando microtesoura. Não deve haver nenhum sangramento, se o clipe e ligadura são seguras. </li><li> Usando fórceps para controlar as paredes da ECA, passe a extremidade chanfrada do cateter para dentro do vaso. </li&gt; <li> Fixe o cateter com o nó de sutura frouxa. Ligar a artéria ao redor do cateter. </li><li> Remova o clipe e limpar a área com um cotonete. </li><li> Avançar o cateter, para cerca de 1 mm distal à bifurcação. Segurar a artéria com uma pinça proximal ao nó de assegurar a embarcação está imobilizada. </li></ol> 6. Administrar Manitol <ol><li> Encher um 8 &quot;conjunto de extensão IV e uma seringa de 6 ml com manitol sem a criação de quaisquer bolhas de ar na Conserva-se a incubadora a 37 ° C. Nota: trabalho rapidamente com manitol - será prontamente precipitar para fora da solução, à temperatura ambiente.. </li><li> A fim de visualizar BBBD, pode administrar corante azul de Evans e vê-lo introduzir as áreas do cérebro em que a barreira tenha sido interrompida. Para fazer isso, dar ao animal 2 ml / kg de azul de Evans a 2% através de um local novo IV na perna contralateral ao propofol. </li><li> Coloque a extensão definida para um mM 5 filtrar e preenchê-lo com o manitol para remover o ar bubbles. Depois, fixe esta atinja a torneira sem criar bolhas. </li><li> Administrar manitol a 0,09 ml / seg a 25 seg. Preste atenção para o manitol para alcançar o equilíbrio com o fluxo na carótida comum em um ponto imediatamente proximal à ACI. Ele deve aparecer a pulsar com a taxa de rato coração. Se o manitol simplesmente flui para o coração que você superar a pressão do rato sangue. Isto pode causar complicações potencialmente fatais e BBBD pobres. </li></ol>

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<li>Neuwelt, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+CNS+lymphoma+treated+with+osmotic+blood-brain+barrier+disruption%3A+prolonged+survival+and+preservation+of+cognitive+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+oncology%22%5BJournal%5D)">Primary CNS lymphoma treated with osmotic blood-brain barrier disruption: prolonged survival and preservation of cognitive function.</a> Journal of clinical oncology. 9, 1580(1991).</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Existem alguns meios de maximizar a eficácia de BBBD. É importante minimizar a hemorragia durante a fase de corte para baixo. A pressão arterial ea freqüência cardíaca pode ser afetada por sangramento substancial e esses fatores são conhecidos por afetar o grau de BBBD 13. Sangramento pode ser reduzido pelo uso de suturas para ligar grandes vasos, tais como o da tiróide superior e as artérias occipitais, as quais devem ser divididas. Além disso, a electrocauterização pode ser usado para dividir vasos e dissec...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome de material </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentário </td></tr><tr><td> Ratos Long Evans </td><td> Harlan Laboratories </td><td></td><td> 210-250 g, do sexo masculino </td></tr><tr><td> PE 50 Tubulação </td><td> Beckton-Dickinson </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Calibre 18 x 2,5 &quot;cateter IV </td><td> Terumo </td><td></td><td> Para tubo ET </td></tr><tr><td> 30 &quot;extensão IV define </td><td> Abbott </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 26 medidor de cateter IV veterinária </td><td> Monoject </td><td></td><td></td></tr><tr><td> O corante azul de Evans </td><td> Sigma </td><td> E2129 </td><td></td></tr><tr><td> Bipolar </td><td> Codman </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Filtro, 5 micrómetros </td><td> Braun </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

modelo de ratos de sangue-cérebro rompimento de barreira para permitir alvejado neurovascular therapeutics

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Células endoteliais com junções apertadas, juntamente com a membrana de base e os pés de extremidade de astrócitos rodeiam os vasos sanguíneos cerebrais, para formar a barreira sangue-cérebro 1. A barreira selectivamente exclui moléculas de cruzamento entre o sangue e o cérebro com base no seu tamanho e carga. Esta função pode impedir a entrega de terapêuticas para doenças neurológicas. Um certo número de fármacos quimioterapêuticos, por exemplo, não irá efectivamente atravessar a barreira sangue-cérebro para atingir as células tumorais 2. Assim, melhorando a libertação de fármacos através da barreira sangue-cérebro, é uma área de interesse. Os métodos mais comuns para melhorar a administração de fármacos ao cérebro, são perfusão cerebral directa e barreira hemato-encefálica ruptura 3. Directos garantias de infusão intracerebrais terapias que chegar ao cérebro, no entanto, este método tem uma capacidade limitada para dispersar a droga 4. Hemato-encefálica ruptura da barreira (BBBD) albaixos de drogas para fluir directamente a partir do sistema circulatório no cérebro e, assim, atingir mais eficazmente dispersas células tumorais. Três métodos de interrupção barreira incluem rompimento barreira osmótica, a interrupção barreira farmacológico e ultra-som focalizado com microbolhas. Ruptura osmótica, iniciada por Neuwelt, utiliza uma solução hipertónica de 25% de manitol que desidrata as células da barreira sangue-cérebro, causando-lhes a encolher e perturbam as suas junções apertadas. Ruptura da barreira também pode ser realizada com compostos farmacologicamente vasoactivos, tais como a histamina 5 e 6 de bradicinina. Este método, no entanto, é selectiva em primeiro lugar para a barreira cérebro-tumoral 7. Além disso, RMP-7, um análogo do péptido bradiquinina, verificou-se ser inferior quando comparado cabeça-a-cabeça com BBBD osmótico com manitol 25% 8. Outro método, de ultra-som focado (FUS) em conjunto com agentes de contraste de microbolhas de ultra-som, também tem sido demonstradoa reversivelmente abrir a barreira sangue-cérebro 9. Em comparação com o FUS, porém, manitol 25% tem um longo histórico de segurança em pacientes humanos que o torna uma ferramenta comprovada para pesquisa translacional 10-12. A fim de realizar BBBD, manitol devem ser entregues a uma taxa elevada directamente na circulação arterial cerebral. Em seres humanos, um cateter endovascular é guiado para o cérebro, onde o fluxo rápido e directo pode ser realizado. Este protocolo de modelos humanos BBBD tão perto quanto possível. Na sequência de um corte para baixo em relação à bifurcação da artéria carótida comum, um cateter é inserido dentro da ECA retrógrado e usados ​​para entregar o manitol directamente para dentro da artéria carótida interna (ICA) a circulação. Propofol e N 2 O anestesia são usados ​​para a sua capacidade para aumentar a eficácia de ruptura da barreira 13. Se for executado adequadamente, este procedimento tem a capacidade de segurança, de forma eficaz, e reversivelmente abrir a barreira sangue-cérebro e improve a entrega de medicamentos que normalmente não chegam ao cérebro 8,13,14.

<img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50019/50019fig1.jpg" /> Figura 1. Visualizando hematoencefálica ruptura da barreira através de extravasamento de corante azul de Evans. Corante azul de Evans é um pigmento que se liga a albumina e não é extravasado para o cérebro, em condições fisiológicas. O rompimento da barreira sangue-cérebro de um lado do cérebro permite azul de Evans para introduzir e manchar o azul hemisfério interrompido enquanto o hemisfério n...

Hemato-encefálica ruptura da barreira auxilia a distribuição de certas drogas para o cérebro. Manitol entregue intra-arterialmente células vizinhas encolhe vasos sanguíneos, a fim de interromper a barreira física.

Modelo de ratos de sangue-cérebro Rompimento de barreira para permitir alvejado Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

O objetivo geral deste procedimento é romper a barreira hematoencefálica. Isso é feito colocando primeiro o animal em anestesia IV com uma via aérea endotraqueal. Em seguida, a bifurcação da artéria carótida comum é exposta.Em seguida, um cateter é inserido na artéria carótida externa. Finalmente, o manitol é administrado. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a ruptura da barreira hematoencefálica por meio do extravasamento do corante azul de Evan.A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes de terapia intra-arterial é que ela permite que drogas entrem no cérebro, que normalmente não atravessam a barreira hematoencefálica em condições fisiológicas. Isso tem implicações no campo da neurociência porque nos permite testar novas terapias que têm pouca capacidade de atravessar a barreira hematoencefálica. As implicações dessa técnica se estendem à neuro-oncologia, pois muitos agentes quimioterápicos não atravessam a barreira hematoencefálica.Bem, embora esse método nos forneça informações sobre a nova oncologia, ele também pode nos fornecer informações sobre outros distúrbios neurológicos tratados por medicamentos com baixa permeabilidade à barre

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Medicina

Microbolhas mediada ruptura ultra-som focalizado da barreira sangue-cérebro (BBB) ​​é uma técnica promissora para não-invasivo de entrega de drogas alvo no...

Guiada por MRI rompimento da barreira hemato-encefálica utilizando Ultrassom Focalizado transcraniana em um modelo de rato

Neste vídeo, descrevemos um protocolo abrangente para estabelecer um modelo in vitro que imita a barreira hematoencefálica. O modelo promete entender a entrega de agentes terapêuticos para o tratamento de tumores cerebrais.

Barreira hematoencefálica ou modelo BBTB: uma adaptação da barreira hematoencefálica ou modelo BBB para avaliar a administração terapêutica ao tumor

Estabelecimento de modelos humanos da barreira sangue-cérebro (BBB) ​​pode beneficiar de pesquisa em condições cerebrais associadas com insuficiência certificação. Descrevemos aqui uma técnica melhorada para a preparação de um modelo de certificação de contacto, o que permite coculturing de astrócitos e células endoteliais cerebrais sobre os lados opostos de uma membrana porosa.

Melhoria da Metodologia para a Elaboração de um baseado em celular, Contact Modelo Humano da barreira hemato-encefálica

O objetivo do presente estudo foi validar a reprodutibilidade de um modelo in vitro BBB envolvendo um singênico rato co-cultura de células endoteliais e astrócitos. A monocamada de células endoteliais apresentaram alta TEER e baixa permeabilidade LY. Expressão de proteínas TJ específicos, foram avaliadas as respostas funcionais a inflamação e a funcionalidade de transportadores e receptores.

Criação de um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de Rato barreira hemato-encefálica (BBB): A Focus on BBB impermeabilidade e Transportes Receptor mediada

Aqui nós apresentamos um ensaio de permeabilidade vascular do cérebro de rato usando injeção intraperitoneal de traçadores fluorescentes, seguido de perfusão que é aplicável aos modelos animais de disfunção da barreira hemato - encefálica. Um hemi-cérebro é usado para avaliar quantitativamente a permeabilidade e o outro para visualização/imunocoloração de traçador. O procedimento leva 5-6 h por 10 ratos.

Na Vivo barreira hemato - encefálica permeabilidade ensaio nos ratos usando fluorescente etiquetado traçadores

O objetivo geral deste procedimento é fornecer uma técnica altamente reprodutível para avaliação na vivo do rompimento da barreira hemato - encefálica em modelos do rato de acidente vascular cerebral isquêmico.

Uma avaliação In Vivo do rompimento da barreira hemato - encefálica em um modelo do rato de acidente vascular cerebral isquêmico

Aqui nós apresentamos um protocolo descreve a configuração de um cellulo em BBB (barreira hemato-encefálica)-cultura de poliéster membrana porosa Minibrain inserir o sistema a fim de avaliar o transporte de biomoléculas ou agentes infecciosos em um BBB humana e seus fisiológico impacto sobre as células cerebrais vizinhas.

Um modelo de Interface de sangue-cérebro humano para estudar os cruzamentos de barreira por agentes patogénicos ou medicamentos e suas interações com o cérebro

Direcionamento de drogas para tumores do sistema nervoso central é um grande desafio. Aqui descrevemos um protocolo para produzir um mímico in-vitro do tumor-barreira sangue-cérebro usando células murino e/ou humanas e discutir sua relevância para a previsibilidade do sistema nervoso central tumor direcionamento em vivo.

Prever em cargas entrega Vivo usando uma Tumor-barreira sangue-cérebro em um prato

A barreira hematoencefálica (BBB) é uma unidade neurovascular multicelular que regula fortemente a homeostase cerebral. Ao combinar iPSCs humanos e tecnologias de organ-on-chip, geramos um chip BBB personalizado, adequado para modelagem de doenças e previsões de penetrabilidade de medicamentos CNS. Um protocolo detalhado é descrito para a geração e operação do chip BBB.

Geração de um chip de barreira hematoencefálica baseada no iPSC humano

Este protocolo descreve um método para estabelecer um modelo in vitro de barreira hematoencefálica humana (BBB). As células endoteliais e os pericitos são semeados em cada lado de um filtro de inserção (compartimento sanguíneo), e os astrócitos são semeados no poço inferior (compartimento cerebral). O modelo caracterizado foi utilizado para experimentos de transporte de nanopartículas.

Um sistema celular de cultura tripla modelando a barreira hematoencefálica humana

A barreira hematoencefálica (BHE) tem um papel crucial na manutenção de um ambiente cerebral estável e saudável. A disfunção da BHE está associada a muitas doenças neurológicas. Desenvolvemos um modelo 3D, derivado de células-tronco do BBB para investigar a patologia cerebrovascular, a integridade do BBB e como o BBB é alterado pela genética e pela doença.

Reconstrução da Barreira Hematoencefálica In Vitro para Modelar e Combater Terapeuticamente a Doença Neurológica

Aprenda a romper a barreira hematoencefálica em ratos usando manitol intra-arterial para permitir a entrega de fármacos ao cérebro. Este método validado com corante Evans Blue possibilita testar terapias neurovasculares direcionadas.

Modelo de ratos de sangue-cérebro Rompimento de barreira para permitir alvejado Neurovascular Therapeutics

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