Name: 특정 기능 내장 신호를 결합하여 네크로의 마이크로 도메인과 투 광자 영상에서 뉴런의 대상 라벨링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-12T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: 학습하세요 내재적 신호 광학 영상과 투광자 현미경을 결합하여 신피질의 특정 기능 미세영역에서 뉴런을 정밀 표적화하고 고해상도로 구조와 기능을 연구하는 방법을. 이 기법은 신경과학 연구에 필수적입니다.

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그림 5A에 표시된 수석을 추적하는 그레이스 디온;이 작품은 또한, 우리는 수술 절차에 도움을 마 Petrella 감사 국립 안과 연구소 R01EY017925과 R21EY020985과 데이 &amp; 화이트 홀 재단에서 PK까지 자금의 보조금에 의해 지원되었으며, Pratik Chhatbar에 대한 원고에 대한 의견.

1. 외과 준비 <ol><li> 마취를 유도하고 지속적으로 심장 박동을 모니터링 갯벌 CO 2, EEG, 온도를 모두 종료합니다. 모든 절차는 사우스 캐롤라이나의 의과 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다 우리는 이전에 9,15을 발표 이들에 기초했다. </li><li> 메스 블레이드로 피부를 절단하여 두개골의 등 표면을 쉽게받을 수 있습니다. Brudon의 퀴렛를 사용하여 뼈를 놓인 결합 조직을 해부. 면 스쳐 applicators과면 거즈를 사용하여 뼈를 청소합니다. 작은 사자의 정맥을 통해 가끔씩 출혈을 멈추게하기 위해 두개골에 뼈 왁스 (필요에 따라) 적용됩니다. </li><li> 검은 색 페인트 (자료 참조)과 혼합 치과 시멘트를 사용하여 두개골 (craniotomy을 수행 할 것입니다 관심 지역 이상)에 티타늄 스테인레스 스틸 헤드 판을 연결합니다. 머리 판의 중앙에 사각형 오픈 craniotomy에 대한 액세스 및 광학 이미징을 제공합니다. 머리 판 위에 금속 챔버를 연결합니다. 이 챔버는 물 침적 목적 렌즈와 이미징을위한 유체 저수지 역할을합니다. </li><li> 금속 게시물을 사용하여 XY 스테이지에 헤드 판을 고정합니다. </li><li> 치과 드릴을 사용하여 headplate의 사각형 오픈에서 뼈의 넓은 지역을 희석. 얇게 할 영역은 잘 계획 craniotomy의 경계를 넘어 확장해야합니다. craniotomy 사이트에서, 뼈의 두께가 coverglass과 neocortical 표면 사이의 아가로 오스의 두께를 지시하기 때문에 고해상도 이미지가 네크로에서 획득 할 경우 비 쥐 포유류의 두꺼운 두개골은 (아래 참조) 얇게해야합니다 . </li><li> craniotomy의 뼈에서 2 X 2mm 광장 윤곽을 뚫는다. 뼈 조각을 제거하고 기본 피질에 열 손실을 최소화하기 위해 새로운 인공 뇌척수 (ACSF)에 정기적으로 실을 씻어. 필요에 따라 가끔씩 출혈을 멈추게하기 위해 뼈 왁스를 적용합니다. </li><li> 난생t # 3 포셉과 뼈 플랩. </li><li> 제외한 모든 좋은 포셉 (# 5CO)와 Vannas 스프링 가위를 사용하여 경질의 맨 아래 레이어를 제거합니다. 비 쥐 포유류의 경질은 두껍고 불투명하지만 서로 다른 층으로 제거 할 수 있습니다. 출혈은 드문이지만, Gelfoam으로 중단 할 수 있고 어떤 혈흔이 부드럽게 경질는 포셉을 사용하고 ACSF와 린스의 나머지 계층에서 제거해야합니다. 경질의 마지막 층은 투명하고 pial 선박은 확실하게 표시됩니다. 고유 신호 이미징 동안 경질의 최종 레이어를 그대로두면 (토론 참조) 실험 이후 두 광자 이미징 단계에 형광 칼슘 지표 대량로드의 성공 속도를 증가 할 것이다. </li><li> 따뜻한 2% 아가로 오스 (ACSF에 용해)의 드롭을 적용하고 즉시 craniotomy을 통해 coverglass를 놓습니다. 호흡기 및 심장 혈관 pulsations은 수술 해부 현미경이나의 oculars 사용하여 최소한 있는지 확인하기 위해 craniotomy을 확인 두 -밝은 분야 모드에서 광자 현미경. </li></ol> 2. 고유 신호 광학 이미징 <ol><li> 고유 신호 이미징 동안 건조에서 아가로 오스를 방지하기 위해 coverglass의 바깥 주위에 ACSF로 적셔 젤 거품을 추가합니다. </li><li> 두 광자 현미경 (그림 1) 위의 표준 C-마운트 포트에 고유 신호 이미징 CCD 카메라를 연결합니다. XY 스테이지 (그림 1A) 근처의 공기 테이블에 조명 광원을 배치합니다. 위치 및 craniotomy 및 headplate / 챔버 (그림 1B)를 통해 빛 가이드를 확보. 고유 신호에 필요한 반사 붉은 빛이 CCD 카메라 (그림 1C-D)에 craniotomy에서 직접 통과 할 수 있도록 기본 이색 성 및 C-마운트 포트 아래에있는 거울을 취소. 4 배 공기 목적 (0.13 NA, 17mm WD),보기의 2 X 2mm 필드를 사용하면 고유 신호 이미징 사용할 수 있습니다. </li><li> 리터에 열 필터를 삽입난방에서 피질을 방지하기 위해 항공 경로를 설정합니다. 녹색 빛 (546 nm의 중심 λ)와 대뇌 피질의 표면 혈관의 디지털 참조 이미지를 기록을 통과 필터를 사용합니다. </li><li> 대뇌 피질의 표면 아래 500 μm로 Z 포커스를 이동합니다. 고유 신호를 측정하는 피질을 밝히는 빨간색 필터 (630 nm의 중심 λ)를 사용합니다. 대뇌 피질의 표면이 균일하게 조명되는 등의 빛 가이드를 배치합니다. 시각적 자극 디스플레이에 의​​해 발생 된 빛에서 craniotomy을 보호. 시각적 자극과 기록 반사율 데이터 이미지의 순서를 제시한다. 10 분 내에 오리엔테이션지도를 생성하려면, 8 자극 (각 방향 4 방향 및 두 방향)의 순서 4 반복에 해당하는 데이터를 수집합니다. </li><li> 거짓 컬러 방향지도를 생성하는 고유 신호 데이터를 분석합니다. 뉴런의 두 광자 라벨, 예를 들어, 오리엔테이션 바람개비의 이론에 대한 잠재적 타겟 지역 선택 -지도에서 지점 위치모든 기본 방향은 (그림 2A) 수렴. 오리엔테이션지도와 대뇌 피질의 표면 vasculature (그림 2B-C)의 이미지를 입혀 라. 대형 혈관과 arterioles 15 위치를 피하고 대상을 선택 기능 도메인 및 대형 표면 선박의 위치의 레이아웃을 사용합니다. </li></ol> 3. 형광등 칼슘 지표의 대량로드 <ol><li> 5 μl DMSO에 1g의 Pluronic을 추가하여 20 % Pluronic / DMSO의 솔루션을 준비합니다. 완전히 Pluronic를 해산하기 위해 10 분 동안 60 ° C에서 혼합물을 가열. 혼합물이 실내 온도에 냉각 할 수 있습니다. 형광 칼슘 표시기 오레곤 그린 488 Bapta-1시 (AM OGB-1)의 50 μg의 유리 병에 Pluronic / DMSO 혼합물의 4 μl를 추가합니다. 그런 다음 빨간색 염료 (알렉사 형석 594, 2 MM 주식 솔루션) 1 μl와 OGB - 새벽 1 시까 지 1 ㎜의 최종 농도에 대한 피펫 솔루션의 35 μl를 (자료 참조) 추가 할 수 있습니다. 에 ½ 시간에 대한 솔루션을 Sonicate차가운 물 목욕 후 불순물을 제거 할 필터 0.45 μm와 원심 분리기. </li><li> 2.0-2.5 μm의 외부 팁 직경 긴 테이퍼 피펫을 당겨. 피펫으로 염료 혼합물의 5 μl를로드합니다. </li><li> 피펫 삽입을 용이하게하고 최고 품질의 두 광자 이미지를 얻을 경질의 마지막 층을 제거합니다. </li><li> 피펫은 대뇌 피질의 레이어 3분의 2 년에 목표에 도달하기 위해 배치해야하는 대뇌 피질의 표면에 정확한 위치를 결정합니다. 우리 미리 대뇌 피질의 목표는 방향지도 (그림 2)에 바람개비 특이점입니다. 피펫은 챔버 벽과 목적 사이를 통과하기 위해 30 ° 각도로 피질로 구동해야합니다. 따라서, 200 μm 대뇌 피질의 표면 아래에 대상 지역을 라벨, 대뇌 피질의 표면에 피펫 항목 위치가 대상 위치 (그림 3 AB)에 측면 약 350 μm 될 것입니다. </li><li> (XY 스테이지를 이동하는 동물과 Pipette의 micromanipulator은 센터 목적 (그림 3C)에서 대뇌 피질의 표면 입력 위치에) 배치됩니다. 피펫 쉽게 craniotomy의 벽을 따라 목적이나 뼈를 건드리지 않고도 피질을 입력 될 수 있도록 최소 3 ㎜ (자료 참조) 작동 거리 (WD)으로 20x 또는 40x 목표를 사용합니다. 항목의 위치는 목표 아래 중앙되면, 2mm (그림 3D)에 의해 목표의 Z 위치를 올립니다. 녹색 에피 형광 빛이 피펫에 빨간색 알렉사 염료를 시각화에 대한 설정으로, (그 팁을 중심으로 될 때까지 직접 대뇌 피질의 표면 항목 위치 위의 목적에 따라 (그리고 집중) 피펫을 이동 micromanipulator의 대각선 축를 사용하여 그림 3E). </li><li> 지속적으로 ocu을 통해 피펫 팁을 보면서 피펫은 대뇌 피질의 표면 (그림 3 층)에 도달 할 때까지 피펫 수직을 (Z 축을 따라) 낮 춥니 다현미경의 라스 요. 밝은 분야 조명을 사용하여 대뇌 피질의 표면 혈관과 남아있는 수막 멤브레인 (피아와 거미집 모양의)는 피펫은 대뇌 피질의 표면을 접근으로 쉽게 볼 수 있습니다. 피펫가 원하는 항목 위치에 도달하지 않는 경우, 피펫을 마련하고 대뇌 피질의 표면에 혈관 랜드 마크를 기반으로 타겟팅을 재조정. </li><li> 목표를 제거 craniotomy에서 초과 중추 신경계를 등심과 보푸라기가없는 흡수 창을 사용하여 인접한 뼈를 건조. craniotomy (그림 3G)를 통해 볼 수 있습니다 피질을 안정하는 따뜻한 3퍼센트 아가로 오스 (ACSF에 용해)의 방울을 적용합니다. 비 설치류에서 3% 아가로 오스는 뉴런의 형광 염료의 성공적인 이해에 pulsations을 저해 할 필요가 있습니다. 2퍼센트 아가로 오스와 coverglass의 조합에 필요한 안정성을 제공하기 때문에 고유 신호를 광 이미징의 경우 불과 2 %의 아가로 오스가 필요합니다. 여기 더 coverglass는 3% 아가로 오스 그래서 염료로드 단계를위한 것입니다 사용되지 않습니다필요. 아가로 오스가 확정 된 후 ACSF과 챔버를 40x 목표를 삽입 (0.8 NA, 3.3 mm WD)하고 다시 작성하십시오. </li><li> 밝은 분야의 두 광자보기로 전환하여 피펫 팁을 찾습니다. 그 끝이 피질 (그림 3H)에서 원하는 깊이를 도달 할 때까지 micromanipulator의 대각선 축를 사용하여 피펫 이동합니다. 염료 혼합물 (몇 PSI, 각 펄스 0.1 초)의 수시 압력 분출 퍼프는 막힘에서 피펫 팁을 방지하는 데 도움이됩니다. OGB-1은 세포를 입력시 표시됩니다 AM 때문에, 붉은 알렉사 염료는 피질 내부의 피펫 팁의 시각화를 위해 중요합니다. </li><li> 피펫 팁의 깊이를 확인하는 대뇌 피질의 표면에 재 집중, 염료의 전체 용량과 목표를 대뇌 피질의 층 3분의 2의 뉴런을로드하고 끝이의 레이아웃에 따라 대상 위치에 있는지 확인하기 전에 표면 혈관. 피펫은 레이어 3분의 2 인 경우, 염료 혼합물의 작은 퍼프가를 조명한다세포 공간과 어두운 그림자처럼 원형 세포 기관의 조밀 한 조립을 알 수있다. </li><li> 대뇌 피질 300-600 μm 직경의 영역에 neuronal 세포의 시체를로드를 들어, 30-90 펄스, 각 펄스 1.0 초, 2-10 PSI를 사용하여 세포 공간으로 염료 혼합물을 주입. 압력 펄스는 조직 움직이 너무 강한 안됩니다. 주입이 완료되면, 몇 분 기다린 다음 피펫과 목표를 제거합니다. OGB-1 뉴런에 의해 완벽하게 촬영 업 할 수 있도록 오전 1 시간 기다립니다. </li><li> 염료로드에 사용 된 아가로 오스를 제거하고 녹음 챔버를 씻어. 표면에 2~3% 아가로 오스의 작은 방울을 넣고 빠르게 craniotomy을 통해 coverglass를 놓습니다. 형광 염료가 빛에 민감한 때문에, 밝은 필드 또는 에피 형광등에 피질이 과잉 노출하지 마십시오. XY 단계를 사용하여 목적에 따라 목적 홀더 및 재 중심이라는 대뇌 피질의 영역으로 높은 NA (1.0) 20x 목표를 넣습니다. 예에서 craniotomy을 보호traneous 광원, 예를 들어, 시각 자극 디스플레이, 정전 소재의 여러 레이어를 사용합니다. </li></ol> 4. 형광 염료의 단일 셀 Electroporation <ol><li> 수지상 형태를 연구의 경우, 100 μM 알렉사 형석 594 (2 MM 알렉사 형석 594 주식 ACSF에 1시 20분 희석)의 솔루션을 준비합니다. 수석의 기능 이미징을위한 OGB 소금은 16,17을 사용할 수 있습니다. </li><li> 1 μm의 끝 크기가 긴 테이퍼 피펫을 뽑아 피펫으로 염료의 5 μl를로드합니다. 기능 도메인을 타겟팅하는 다른 모든 단계를 대량로드 방법 (그림 1-3)과 동일합니다. neuronal 전지 본체 막에 인접한 피펫 팁을 위치, 전극 임피던스의 증가를 모니터링하고 세포 공간을 조명하고 두 광자 이미징 동안 그림자처럼 세포의 시체를 볼 수있는 염료의 압력 퍼프를 적용 할 수 있습니다. </li><li> 피펫 팁은 neuronal 전지 본체 막에 인접한 경우, 적용 할 Axoporator 800A를 사용1-3 펄스 (-8에 -10 V, 10 밀리 초 펄스). 염색과 신경의 즉각적인 충전이 두 광자 현미경으로 쉽게 시각화입니다. 피펫를 제거하고 생체의 수석과 axons의 고해상도 이미지를 수집합니다. </li></ol>

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

우리는 네크로의 미리 정해진 기능 마이크로 도메인에 neuronal 세포 기관 (또는 수석과 axons)의 라벨을 타겟팅하는 방법을 제시한다. 두 광자 현미경과 고유 신호 광학 이미징을 병합하는 시냅스와 세포가 어떤 기능지도의 마이크로 도메인에 기여하는 결정의 가능성을 제공 여부 기능지도에서 뉴런의 위치, 그리고 neuronal 회로와 neuronal 선택성의 상호 구성 요소를 시각적 경험 7 임상 치료 약물 (18)의 응용 프로그램과 그 변화. 자극 방향, 방향, 안구 지배력, 또는 쌍안경 차이에 대한지도는 성인 야생 형 설치류 6,19-21의 시각적 피질에보고되지 않았습니다. 그러나, 형광 염료와 뉴런를로드하고 마우스에 사용할 수있는 강력한 유전자 도구와 함께 이미지 안정성을 달성의 용이성이 연구의 대부분이 발생하고 있습니다설치류 대신 ferrets, 고양이, 그리고 원숭이에서 수행되는 대뇌 피질의 2 광자 이미징...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 1. 생활 지원 / 실험 사립 </td></tr><tr><td> Isoflurane </td><td> 웹스터 뇌려 </td><td> NDC 57319-474-05 </td><td></td></tr><tr><td> Isoflurane vaporizer </td><td> Midmark </td><td> VIP 3000 </td><td></td></tr><tr><td> 의견 조절 난방 담요 </td><td> 하버드 장치 </td><td> 50 7079F </td><td></td></tr><tr><td> ECG 모니터 </td><td> Digicare 생명 </td><td> LifeWindow 라이트 </td><td></td></tr><tr><td> EEG 증​​폭기 </td><td> AM 시스템 </td><td> 1800 </td><td></td></tr><tr><td> EEG 디스플레이 모니터 </TD&gt; <td> 휴렛 패커드 </td><td> 78304A </td><td></td></tr><tr><td> 갯벌 CO 2 모니터를 종료 </td><td> Respironics </td><td> Novametrix Capnoguard 1265 </td><td> 환기를 최적화 </td></tr><tr><td> 드릴링 뼈에 초경 드릴 burrs </td><td> 헨리 Schein </td><td> 고급 (0.5 mm 팁) 및 정밀 (1.25 mm 팁) </td><td></td></tr><tr><td> headplate / 챔버 용 시멘트 </td><td> Dentsply </td><td> 675571, 675572 </td><td></td></tr><tr><td> 블랙 파우더 온도 그림판 </td><td> 사전 트 아트 주식회사 </td><td> 22-7185 </td><td> 빛 차폐을 개선하기 위해 시멘트 반사를 줄이기 위해 추가 </td></tr><tr><td> 아가로 오스 - 유형 III-A </td><td> 시그마 </td><td> A9793 </td><td> 고유 신호와 두 광자 이미징 동안 pulsations을 최소화하기위한 </td></tr><tr><td> Coverglass : 5 또는 8 밀리미터 직경 0.17 mm의 두께 </td><td> 의 세계 정밀struments </td><td> 502040, 502041 </td><td> 영상 중에 pulsations을 최소화 들어, coverglass이 필요로 절단 할 수 있습니다 </td></tr><tr><td> Brudon의 curettes </td><td> 조지 Tiemann </td><td> 105-715-0, 105-715-3 </td><td> 두개골 표면을 청소 </td></tr><tr><td> 뼈 왁스 </td><td> Ethicon </td><td> W31G </td><td> 신속하게 출혈이 멈추지 </td></tr><tr><td> 면화는 작은 주걱 줬 </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 72308-05 </td><td> 깨끗하고 마른 뼈 표면 </td></tr><tr><td> 뒤몽 # 5CO 집게 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 11295-20 </td><td> 경질 또는 PIA의 개별 레이어를 잡아 </td></tr><tr><td> Vannas 봄 가위 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 15000-03 </td><td> 컷 경질 </td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> 화이자 </td><td> 09-0396-05 </td><td> 경질에 출혈을 중지하려면 </td></tr><tr><td> 흡수 스피어스</td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 18105-01 </td><td> CSF의 초 신속하고 보푸라기가없는 wicking </td></tr><tr><td> 정전 재료 </td><td> Thorlabs </td><td> BK5 </td><td> 방패 craniotomy </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 2. 준비 / 주사를 물들이다 </td></tr><tr><td> 디메틸 Sulphoxide (DMSO) </td><td> 시그마 </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic </td><td> 시그마 </td><td> P2443 </td><td></td></tr><tr><td> 오레곤 그린 488 Bapta - 오전 1시 </td><td> Invitrogen </td><td> O6807 </td><td> 칼슘 표시기 </td></tr><tr><td> 알렉사 형석 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A10438 </td><td></td></tr><tr><td> 원심 필터 (0.45 μm의 기공 크기) </td><td> Millipore </td><td> UFC30HV00 </td><td> 주사하기 전에 불순물을 제거하려면 </td></tr><tr><td> 유리 피펫 풀러 </td><td> 셔터 악기 </td><td> P97 </td><td></td></tr><tr><td> 붕규산 유리는 (1.5 mm 외경) 모세관 filamented </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 1B150F-4 </td><td> 염료 분출 피펫 </td></tr><tr><td> Microloader </td><td> Eppendorf </td><td> 5242 956 003 </td><td> 피펫으로 염색을로드하는 동안 </td></tr><tr><td> Micromanipulator </td><td> 셔터 악기 </td><td> MP-285 </td><td> 피펫을 배치하려면 </td></tr><tr><td> 압력 펄스 컨트롤러 </td><td> 파커 Hannifin </td><td> PicoSpritzer III </td><td> 염료의 압력 분사에 대한 </td></tr><tr><td> 단일 셀 electroporator </td><td> 분자 장치 </td><td> Axoporator 800A </td><td> 염료의 electroporation에 대한 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 3. 고유 한 IMAging </td></tr><tr><td> 4 배 목표 (0.13 NA, 17mm WD) </td><td> 하늘 </td><td> UPLFLN4X </td><td></td></tr><tr><td> 내장 하드웨어 / 소프트웨어 </td><td> 광학 이미징 주식회사 </td><td> 영상 3001 / VDAQ </td><td> VDAQ 소프트웨어는 삽화 이미지에 사용됩니다 </td></tr><tr><td> CCD 카메라 </td><td> Adimec </td><td> Adimec-1000 </td><td></td></tr><tr><td> 광원 전원 공급 장치 </td><td> 한전 </td><td> 15 15M를 ATE </td><td></td></tr><tr><td> 광원 </td><td> 광학 이미징 주식회사 </td><td> HAL 100 </td><td> 대뇌 피질의 표면에서 빛의 세기 3-5 MW입니다 </td></tr><tr><td> 그린 필터 (혈관 이미지) </td><td> 광학 이미징 주식회사 </td><td> λ = 546 nm의 (밴드 패스 30 nm의) </td><td> 표면 vasculature의 참조 이미지 </td></tr><tr><td> 레드 필터 (고유 신호) </td><td> 광학 ImagiNG 주식회사 </td><td> λ = 630 nm의 (밴드 패스 30 nm의) </td><td> 고유 신호를 수집하려면 </td></tr><tr><td> 열 필터 </td><td> 광학 이미징 주식회사 </td><td> KG-1 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 4. 두 광자 장비 / 영상 </td></tr><tr><td> 두 광자 현미경 및 소프트웨어 </td><td> 프레리 기술 </td><td></td><td> 빛 경로, 필터 및 레이저 힘이 센지 외. 2,012을 참조하십시오 </td></tr><tr><td> 티 : 사파이어 레이저 </td><td> 스펙트럼 - 물리 </td><td> 마이 타이 XF </td><td></td></tr><tr><td> 20x (0.5 NA, 3.5 mm WD) </td><td> 하늘 </td><td> UMPLFLN20X </td><td> 0.5 NA 목표는 (아니라 2 광자 이미징 용) craniotomy을 통해 피펫을 정렬으로 만 사용됩니다 </td></tr><tr><td> 20x (1.0 NA, 2.0 mm WD) </td><td> 하늘 </td><td> XLUMPLFLN20X </td><td></td></tr><tr><td> 40x (0.8 NA, 3.3 mm WD) </td><td> 하늘 </td><td> LUMPLFLN40X/IR </td><td></td></tr><tr><td> 에어 테이블 </td><td> 뉴 포트 (Newport) </td><td> ST-200 </td><td> 외부 진동의 준비를 분리 </td></tr><tr><td> XY 스테이지 </td><td> 마이크의 기계 (주) (Attleboro, MA) </td><td></td><td> XY 스테이지에 배치 실험 주제와 셔터의 micromanipulator </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> 요리법 </td></tr><tr><td> 인공 Cerebro - 척수 </td><td> NaCl (135 ㎜), KCl (5.4 ㎜), MgCl 2 (1.0 ㎜), CaCl 2 (1.8 ㎜), HEPES (5 ㎜), pH를 7.4 </td></tr><tr><td> 피펫 솔루션 14 </td><td> NaCl (150 ㎜), KCl (2.5 ㎜), HEPES (10 ㎜), pH를 7.4 </td></tr></tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

특정 기능 내장 신호를 결합하여 네크로의 마이크로 도메인과 투 광자 영상에서 뉴런의 대상 라벨링

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

비 쥐 포유류의 주요 시각 피질에서 뉴런은 같은 방향 1-4, 방향 5-7, 안구 지배력 8,9와 쌍안경 격차 구 등의 자극 기능에 대한 자신의 선호에 따라 클러스터됩니다. 오리엔테이션 선택성이 가장 널리 연구 기능 및 원하는 방향의 준주기적인 레이아웃과 지속적인지도 전체 기본 시각 피질 10,11에 걸쳐 존재합니다. 이 기능지도에 자극 선택적 응답을 초래할, 신경 세포 및 네트워크 기여를 통합하면 mm 공간적 스케일로 하위 미크론에 걸쳐 이미징 기술의 하이브리드가 필요합니다. 기존의 고유 신호를 광 이미징을 통해 시각 피질의 전체 표면에 걸쳐 기능지도의 전체적인 레이아웃은 12 결정될 수있다. 칼슘 민감한 염료를 사용하여 생체 내 두 광자 현미경의 개발은 synapt을 결정하는 하나를 수IC의 입력은 개별 neuronal 세포 기관 6,14 수백에서 동시에 각각의 수지상의 쪽에서 13 또는 기록 활동을 도착. 따라서, 두 광자 현미경의 하위 마이크론 공간 해상도로 고유 신호 영상을 결합하는 것은 수지상 세그먼트 및 세포 네크로의 모든 기능지도의 마이크로 도메인에 기여하는 정확히 결정의 가능성을 제공합니다. 여기 빠르게 대뇌 피질의 방향지도를 취득하고 비 쥐 포유류에 형광 염료와 뉴런을 라벨이 기능지도의 특정 마이크로 도메인을 타겟팅 할 수있는 높은 수율 방법을 보여줍니다. 두 광자 이미징에 사용 된 것과 같은 현미경으로, 우리는 먼저 고유 신호 광학 이미징을 사용하여 오리엔테이션지도를 생성합니다. 그럼 우리가 어느 라벨을 염료로로드 micropipette를 사용하여 관심있는 마이크로 도메인을 타겟팅하는 방법을 보여 neuronal 세포 기관 또는 라벨 수석, 쪽과 axons은에서 볼 수있는 그러한 하나의 뉴런을의 인구생체. 앞의 방법을 넘어 개선이 neocortical 기능 아키텍처의 프레임 워크의 하위 세포 해상도 neuronal 구조 - 기능 관계의 시험을 용이하게합니다.

우리 염료 라벨 방법의 정밀도를 설명하기 위해, 우리는 비 쥐 네크로에 알려진 기능지도의 가장 작은 마이크로 도메인을 대상으로. 띄엄 띄엄 이론은 기본 영상 피질의 방향지도를 통해 끝까지. 이들은 모두 원하는 방향 이러한 수렴 지점에서 발생하는 선호하는 취향, &quot;풍차&quot;(그림 2A-B)와 같은 특이한 모양 주변 지역의 위색지도 인치 craniotomy 당 하나의 바람개비는 특히 15 대형 선박과 arterioles을 방지해야하는 것 염료 라벨 (그림 2C에 녹색 동그라미)으로 선택됩니다. OGB-1스러워 대량로드로 방향 격자 시각적 자극의 순서로 neuronal 칼슘 표시기 형광의 추적 변화는 바람개비 이론과 주변의 단일 셀 해상도 기능지도를 (그림 4) 공개한다. 단일 셀 electroporation로, 수석과 axons의 공간 조직에서바람개비의 특이점에있는 화롯불 신경 세포는 생체 ...

방법은 네크로의 미리 결정된 기능 마이크로 도메인에 형광 염료와 뉴런을 라벨에 설명되어 있습니다. 첫째, 고유 신호 광학 이미징은 기능지도를 얻을하는 데 사용됩니다. 그런 다음 두 광자 현미경은지도의 마이크로 도메인 내에서 라벨 및 이미지 뉴런하는 데 사용됩니다.

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

이 절차의 전반적인 목표는 고해상도로 뉴런의 구조와 기능을 연구하기 위해 기능 맵의 마이크로 도메인을 정확하게 표적으로 삼는 것입니다. 이는 먼저 피질의 넓은 영역에 걸쳐 고유 신호 이미징을 수행하여 관심 있는 자극 특징의 지도를 얻음으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 고해상도에서 광자 이미징의 대상이 될 지도에서 정확한 위치를 결정하는 것입니다.다음으로, 형광 염료가 적재된 피펫을 조심스럽게 배치한 후 형광 마커로 표지합니다. 마지막으로, 뉴런 반응 또는 구조의 고해상도에서 광자 이미지가 수집됩니다. 궁극적으로, 내재적 신호 특징 맵을 사용하여 방향 바람개비 특이점과 같은 관심 영역을 찾은 다음 단일 뉴런 해상도에서 연구 대상으로 삼을 수 있습니다.이 프로토콜의 주요 장점은 시스템을 몇 가지만 빠르게 조정하면 동일한 현미경 설정을 사용하여 서로 다른 공간 규모에서 피질을 이미지화할 수 있다는 것입니다. 이를 통해 이러한 기술을 결합하여 코스 해상도 고유 신호 맵을 고해상도 이미징을 위해 형광 프로브로 표지할 뉴런 영역을 선택하기 위한 지침으로 사용할 수 있습니다. 동물은 기관 동물 관리 유도 위원회가 승인한 프로토콜에 따라 마취되었으며 두개골이 노출되고 세척되었습니다.치과 용 시멘트 혼합물은 두개골 중앙에 직사각형 개구부가 있는 스테인리스 스틸 헤드 플레이트를 부착하는 데 사용되었습니다. 헤드 플레이트 상단의 금속 챔버는 Water Immersion 대물 렌즈로 이미징하기 위한 저장소 역할을 합니다. 헤드 플레이트는 금속 포스트를 사용하여 XY 스테이지에 고정되었습니다.치과용 드릴을 사용하여 헤드 플레이트의 직사각형 개구부 내에서 넓은 영역의 뼈를 얇게 만듭니다. 간헐적인 출혈을 멈추기 위해 뼈 왁스를 바르는 것이 필요했습니다. 얇은 영역은 계획된 개두술의 경계를 벗어나는 동안 확장되어야 합니다.그런 다음 개두술을 위해 뼈에 2 x 2mm 정사각형 윤곽을 뚫습니다. 신선한 인공 대뇌척수액으로 챔버를 주기적으로 헹구어 뼈 파편을 제거하고 기저 피질에 대한 열 방출을 최소화합니다. 이제 숫자 3 집게로 뼈를 들어 올립니다.숫자 5 집게와 Vana 스프링 가위를 사용하여 경막의 위쪽 층을 제거하고 아래쪽 층은 그대로 둡니다. 경막의 마지막 층은 투명하며 이를 통해 껍질 혈관이 명확하게 보여야 합니다. A CSF에 용해된 따뜻한 2%에어로스 한 방울을 바르고 즉시 개두술 위에 커버 유리를 놓습니다.먼저, 내재 신호

targeted-labeling-neurons-specific-functional-micro-domain-neocortex

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

네크로 텍스의 microcircuits의 네트워크 역학을 이해하기 위해서는 동시에 뉴런의 다수의 활동을 기록하는 것이 필수적입니다. - 생체내에서 두 광자 칼슘 이미징 하나는 단일 셀 해상도 고밀도의 연결 인구의 활동을 기록하는 수있는 유일한 방법입니다.

레이어의 VIVO에서 2 광자 칼슘 이미징 마우스의 2 / 3

본 논문은 제한된 억제 뉴런의 인구에 GFP를 표현 형질 전환 생쥐에서 전체 셀 녹음과 photostimulation를 검색 레이저를 결합 방법을 소개합니다. 이 기술은 특정 억제 대뇌 피질의 뉴런의 지역 신경 회로의 광범위한 매핑 및 정량 분석​​ 할 수 있습니다.

레이저 스캐닝 Photostimulation에 의해 억제 Neuronal 회로를 매핑

형광 염료의 역행 전송 해부학 적 투사에 따라 신경 세포의 하위 인구 레이블. 레이블 축삭은 시각적 대상이 될 수...

역행 형광 라벨이 확인 된 신경 세포의 표적 세포 외 단일 단위 기록을 허용<em&gt; 생체 내</em

뉴런의 경험에 의존하는 분자 변화는 행동 문제에 대한 응답으로 적응하는 뇌의 기능에 필수적입니다.

두피 뉴런에서 생체 내 두 - 광자의 영상은 경험에 의존 분자 변경

살아있는 동물의 타임랩스 영상은 온전한 뇌의 구조적 재구성에 대한 귀중한 정보를 제공합니다. 여기에서는 이광자 현미경으로 살아있는 쥐 피질의 형광 표지된 시냅스 구조를 경두개 이미징할 수 있는 얇은 두개골 제제를 소개합니다.

두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상

우리는 전체 세포 패치 - 클램프 및 마우스 뇌의 급성 조직 슬라이스에서 수상 돌기 및 해마 신경 세포의 쪽의 세포 내 나트륨 과도 다중 광자 이미징 신경 활성 화합물의 초점 UV 유도 된 사진 활성화의 조합을 설명합니다.

다중 광자 세포 내 나트륨 이미징 CA1 피라미드 뉴런의 글루타메이트의 UV 매개 초점 Uncaging과 결합

이 비디오는 Thy1-GFP 형질전환 라인에서 생체 내 2광자 현미경을 사용하여 마우스 후비장 피질의 뉴런을 만성적으로 이미징할 수 있는 개두술 절차를 보여줍니다. 이 접근법은 mCherry 발현 아데노 관련 바이러스를 배측 해마에 주입하는 것과 결합됩니다. 이러한 기술을 통해 RSC에서 경험 의존적 구조적 가소성을 장기간 모니터링할 수 있습니다.

동시에 두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 Retrosplenial 코어 텍스에서 시냅틱 입력의 이미징 및 시냅스 대상

우리는 전체 셀 패치 클램프 기록 및 2 광자 이미징 급성 뇌 조각에 신경 모 수석에 캘리포니아2 + 과도 기록 하는 방법 제시.

두뇌 조각에서 신경 모 수석에서 2 광자 칼슘 이미지

여기 우리는 지우기, 형광 라벨, 조직과 마우스 뇌 조직, 종류는 피 질에서의 3 차원 조직의 시각화를 가능 하 게의 대규모 영상에 대 한 절차를 설명 합니다.

마우스 피 질 세포 조직의 대형 3-차원 영상

헤드 플레이트 및 단일 광자 및 이광자 현미경과 호환되는 광학 설계와 통합될 경우, 마이크로프리즘 렌즈는 머리가 고정된 상태에서의 잘 제어된 실험이나 자유롭게 움직이는 동물의 자연스러운 행동 작업을 포함하여 다양한 조건에서 수직 컬럼의 신경 반응을 측정하는 데 상당한 이점을 제공합니다.

자유롭게 움직이고 머리가 고정된 동물에서 마이크로프리즘을 사용하여 식별된 신경 집단의 장기 이미징

이 프로토콜은 여러 기억 관련 뇌 영역에 걸쳐 뉴런과 성상교세포로부터 칼슘 신호를 동시에 기록하는 방법을 포괄적으로 설명하며, 학습 및 기억 행동 패러다임에서의 적용 방식을 시연합니다.

학습 및 기억 행동 중 여러 뇌 영역에 걸친 성상교세포-뉴런 활동을 기록하는 이중 색상 섬유 광도 측정법

학습하세요 내재적 신호 광학 영상과 투광자 현미경을 결합하여 신피질의 특정 기능 미세영역에서 뉴런을 정밀 표적화하고 고해상도로 구조와 기능을 연구하는 방법을. 이 기법은 신경과학 연구에 필수적입니다.

특정 기능 내장 신호를 결합하여 네크로의 마이크로 도메인과 투 광자 영상에서 뉴런의 대상 라벨링

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