Aplicação local de Drogas para estudar a função do receptor nicotínico de acetilcolina no cérebro do rato Fatias

O objetivo geral deste procedimento é estudar a função do canal iônico dependente de ligante em neurônios de fatias de cérebro preparadas agudamente derivadas de camundongos adultos. Isso é feito extraindo primeiro um cérebro intacto de um camundongo adulto que foi trans Cardi perfundido com líquido cefalorraquidiano artificial especializado. O segundo passo é preparar fatias de cérebro da região cerebral de interesse na orientação desejada.

Em seguida, fatias cerebrais individuais colocadas em uma câmara de gravação sob o microscópio e neurônios individuais dentro da fatia são identificados para gravação. A etapa final é o registro de um neurônio com patch clamp de célula inteira, seguido pela aplicação local de drogas para ativar os canais iônicos dependentes de ligantes usando uma segunda micropipeta de vidro. Em última análise, este método de estudo de canais iônicos dependentes de ligantes é usado para mostrar as propriedades biofísicas dos receptores nativos em neurônios vivos.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como aplicação de banho ou administração de medicamentos no YouTube, é que a entrega de medicamentos ao neurônio registrado é muito rápida e localizada. Pequenas quantidades de droga podem ser administradas e vários neurônios podem ser estudados a partir de uma única fatia. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do receptor nicotínico de acetilcolina, como determinar os receptores nicotínicos nativos envolvidos nas respostas biofísicas, biológicas e comportamentais da célula à nicotina.

Neste procedimento, depois de sacrificar um camundongo adulto e obter o cérebro, corte o cérebro na orientação desejada para incluir a área de interesse em uma placa de metal gelada. Em seguida, fixe o bloco cerebral com super cola na superfície seca do estágio de um fatiador vibratório. Em seguida, mergulhe o bloco cerebral em solução de recuperação NMDG de quatro graus Celsius e borbulhe continuamente a solução com carbogênio.

Em seguida, corte as fatias de 250 mícrons de espessura cada uma da área do cérebro de interesse. Em seguida, puxe uma micropipeta padrão com uma resistência de quatro a seis mega ohms usando o extrator marrom flamejante programável. Encha a micropipeta com uma solução de gravação intracelular adequada.

Em seguida, transfira uma fatia para a câmara de gravação no estágio de um microscópio vertical continuamente super fundir a fatia com carbonatado 32 graus Celsius Gravação padrão A CSF a 1,5 a 2,0 mililitros por minuto. Sob o microscópio, localize e centralize a área de interesse do cérebro usando uma objetiva de ar 10x. Depois disso, visualize os neurônios individuais usando uma objetiva de imersão em água de infravermelho próximo de 40 x conectada à óptica de contraste de interferência diferencial IR e um dispositivo acoplado carregado de infravermelho próximo de alta velocidade ou câmera de vídeo CCD Sob observação IR DIC, neurônios saudáveis exibem uma membrana plasmática cinza claro lisa após a visualização celular.

Realize o registro de células inteiras usando técnicas convencionais. Agora puxe outra micropipeta de grampo de remendo padrão como antes para produzir duas pontas irmãs idênticas do mesmo pedaço de vidro com uma resistência ideal de aproximadamente cinco mega ohms. Preencha uma das micropipetas com a solução de medicamento diluída em registro padrão carbonatado A CSF, aponte a ponta para baixo e mova a micropipeta cheia de medicamento para remover quaisquer bolhas de ar presas na micropipeta.

Em seguida, monte a micropipeta cheia de medicamento em um suporte de pipeta conectado ao manipulador microm. O porta-pipetas deve ser conectado com tubulação a um sistema de ejeção de pressão adequado. Ejete manualmente a pressão três a quatro vezes para a micropipeta para aumentar a pressão adequada atrás da coluna de fluido.

Em seguida, abaixe a pipeta de drogas na fatia usando o manipulador microm usando IRDIC. Observação. Posicione a micropipeta de drogas na superfície da fatia de tecido. Execute uma ejeção de pressão e monitore a vizinhança da ponteira quanto ao movimento de detritos relacionados à ejeção e à microponteira da pipeta.

Para quaisquer sinais de que a ponteira está entupida ou bloqueada, se a ponteira estiver entupida, retraia a pipeta e substitua-a por uma nova. Aproxime-se da célula gravada diagonalmente a partir do topo da fatia. Quando está na posição final, a ponta da pipeta cheia de medicamento está no mesmo plano focal que a célula registrada e a ponta do eletrodo de registro, e está a cerca de 10 a 40 mícrons da célula registrada.

Se a ponta da pipeta cheia de drogas estiver acima da célula registrada, a força da ejeção de pressão pode interromper o giga selo da célula e, em seguida, registrar as correntes celulares induzidas por acetilcolina e/ou nicotina enquanto mantém os neurônios no modo de grampo de tensão. Embora a rejeição de pressão possa ser acionada manualmente ao usar um pico spritzer três para resultados mais reprodutíveis, é aconselhável acionar a rejeição de pressão usando o sistema de aquisição e um pulso TTL digital. Para melhorar o experimento, o porta-pipetas cheio de medicamentos pode ser montado em um tradutor elétrico pizo de dimensão única que é capaz de aceitar uma entrada de tensão analógica, que é então montada no micro manipulador de alta precisão.

Um tradutor elétrico pizo é útil porque o movimento da pipeta cheia de drogas para dentro e para fora da fatia, incluindo o tempo e a velocidade de entrada e saída, pode ser mais facilmente controlado e reproduzido de experimento para experimento. Em seguida, ajuste a tensão para seu valor máximo com o potenciômetro controlado manualmente no pizo electric voltage amplificador controlado. Use o micro manipulador para posicionar a pipeta cheia de medicamento na fatia.

Retraia a pipeta reduzindo manualmente a tensão a zero no pazo elétricotage controlado amplifier usando um sinal de saída analógica do sistema de aquisição de gravação. Mova a pipeta cheia de medicamento para a fatia antes que ocorra o pulso TTL de ejeção de pressão. Depois que o pulso ocorrer, retraia a pipeta.

Esta figura mostra a resposta representativa de um neurônio dopaminérgico a 100 micromolares de acetilcolina aplicada localmente, e esta figura mostra a resposta representativa de outro neurônio dopaminérgico a 100 micromolares de nicotina aplicada localmente. Aqui estão os potenciais de ação espontânea de um neurônio dopaminérgico em uma fatia de cérebro de camundongo Alpha six L nine prime S sendo mantida no modo de pinça atual. A aplicação de um micromolar de nicotina usando uma rejeição de pressão de 250 milissegundos induziu mudanças na ação, na taxa de disparo potencial e no potencial de membrana em repouso.

Usando a pesquisa de limiar no software P clamp, a taxa de disparo instantânea foi derivada para classificar os neurônios pelos tipos de resposta à acetilcolina neurônios colus superiores individuais. Em uma fatia de cérebro de camundongo Alpha six L nove primes foram pinçadas por voltagem, seguidas pela aplicação local de nicotina micromolar por meio de ejeção de pressão, os neurônios do tipo um exibiram IPCs aumentados. Após a aplicação de nicotina, os neurônios do tipo dois exibiram grandes correntes internas e EPCs aumentadas em resposta à aplicação de nicotina.

O tradutor elétrico Pizo oferece consistência e protege contra vazamento de drogas. Um neurônio dopaminérgico VTA em uma fatia de cérebro de um camundongo Alpha six L nine prime S foi registrado no modo de palmas de voltagem. Durante a aplicação de um micromolar de nicotina, a pipeta cheia de nicotina foi manobrada para a posição final antes da ejeção da pressão e retraída após a ejeção usando um tradutor elétrico pazo.

Uma segunda resposta foi registrada dois minutos após a primeira para demonstrar que nenhuma dessensibilização N-A-C-H-R havia ocorrido. Os experimentos foram repetidos com a aplicação de nicotina 10 micromolares. Novamente, nenhuma dessensibilização foi observada na segunda resposta quando comparada à primeira.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em menos de três horas, se feita corretamente. Em alguns casos, 10 a 15 neurônios podem ser estudados a partir de uma única fatia de cérebro em um dia Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de posicionar com precisão a pipeta cheia de drogas para manter um equilíbrio entre a ativação total dos receptores nicotínicos de superfície e a integridade do selo giga.