Molécula única imagem da regulação gênica Em vivo Uso de ativação Cotranslational por clivagem (CoTrAC)

O objetivo deste procedimento é adquirir imagens de fluorescência de lapso de tempo de colônias de e coli em crescimento, expressando construções de co-rastreamento para identificar o número de moléculas de proteína recém-produzidas. Isso é feito preparando primeiro uma amostra de células, coex expressando uma proteína de interesse fundida a um repórter Cora fluorescente e uma protease que cliva especificamente entre o repórter Cora e a proteína de interesse. O segundo passo é preparar um gel de baixa temperatura de fusão Aris feito com M nove meios mínimos.

Em seguida, uma almofada de gel AROS é preparada para uso com uma câmara de amostra com temperatura controlada. As células de e coli são colocadas no gel e a câmara é montada. A etapa final é colocar a câmara em um microscópio de fluorescência e obter imagens de várias colônias de células em crescimento em intervalos regulares ao longo de várias gerações.

O fotobranqueamento de moléculas de relatório TRE recém-produzidas em cada intervalo de todas as vezes é usado para adquirir traços de tempo de produção de proteínas em células vivas com resolução de molécula única e célula única. A vantagem desta técnica sobre as medidas ex de célula única usando fusão de proteína de fluorescência é que a produção de qualquer câncer de moléculas de proteína pode ser seguida com o procedimento de molécula única e o resultado afetando as funções dessas moléculas. Para projetar as sequências de inserção de cepa, codificando uma sequência de localização de membrana, uma proteína fluorescente de maturação rápida e uma sequência de reconhecimento de protease e terminal para e no quadro com uma proteína de interesse neste caso específico, um fator de transcrição ou tf.

Neste procedimento, foi utilizado o repórter venoso TSR direcionado à membrana. O repórter foi fundido à sequência de reconhecimento de protease ubiquitina para contar o número de bactérias expressas no fago Lambda Repressor, moléculas de proteína C one. Depois de incorporar a construção no cromossomo e coli, o plasmídeo que codifica a protease específica para a sequência de reconhecimento é transformado em uma cepa que expressa o repórter fluorescente e a proteína de interesse na fusão translacional.

Neste protocolo, foi utilizada a protease ubiquitina carboxi Hydro, que cliva imediatamente após o resíduo de ubiquitina terminal C. Para iniciar este protocolo, escolha uma colônia de e coli de uma placa de ágar recém-listrada em um mililitro M nove, meio mínimo suplementado com um mínimo de aminoácidos essenciais e antibióticos apropriados. Incubar um agitador na temperatura desejada por tempo suficiente para atingir uma densidade óptica de 600 nanômetros ou OD 600 maior que 1,0.

Em seguida, diluir a cultura em um mililitro de meio M nove fresco com antibióticos apropriados para um OD 600 de 0,02. Incubando um agitador na temperatura apropriada, a densidade celular inicial pode ser aumentada, se necessário, para o crescimento em baixa temperatura. Quando o OD 600 for igual a 0,2 a 0,3, comece a preparar a almofada de gel ARO pesando 10 a 20 miligramas de aros de baixa temperatura de fusão em um microtubo de 1,5 mililitro.

Adicione o volume apropriado M nove, meio mínimo sem antibióticos para fazer uma solução de 3% de surgimento. Em seguida, aqueça a solução levantada por 30 minutos a 70 graus Celsius para derreter. Inverter o tubo para garantir que a solução está completamente derretida e homogénea.

Para a montagem da almofada de gel, enxágue uma lamínula pré-limpa e um microaqueduto Slide com água estéril. Seque a lamínula e deslize soprando com ar comprimido. Coloque a junta de borracha na corrediça do microaqueduto de forma que cubra as entradas e saídas.

No lado de vidro da lâmina, aplique 50 microlitros de solução ARO no centro do microaqueduto. Deslize a solução ARO com a lamínula limpa e seca. Deixe a solução agro repousar em temperatura ambiente por 30 minutos.

Quando as células atingem um OD 600 de 0,3 a 0,4, elas estão prontas para a imagem. Transfira um mililitro de cultura incubada para uma centrífuga de tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro a 10.000 vezes G por um minuto em uma microcentrífuga de bancada. Depois de descartar o agente de SUP, adicione um mililitro de M nove médio fresco e resus.

Suspender o pellet e centrifugar suavemente a suspensão a 10 000 vezes G durante um minuto. Em seguida, repita a etapa de centrifugação do resus mais uma vez, ressuspenda suavemente o pellet em um mililitro de meio M nine. Nesse ponto, as células podem ser usadas para imagens microscópicas ou diluídas de 10 a 100 vezes para garantir baixas densidades celulares para imagens de lapso de tempo.

Para preparar uma amostra para imagem, retire cuidadosamente a lamínula da parte superior da almofada de gel. Adicione um microlitro de cultura de células lavadas na parte superior da almofada de gel. Aguarde aproximadamente dois minutos para que a cultura seja absorvida pela almofada de gel.

É importante não esperar tanto que a almofada de gel seque demais. O tempo ideal varia de acordo com a temperatura e a umidade enquanto espera secar. Outra tampa de vidro pré-limpa.

Depois que a amostra estiver seca, cubra a amostra com a nova lamínula, garantindo que a lamínula e a lâmina do microaqueduto estejam bem alinhadas. Monte a câmara de crescimento com temperatura controlada seguindo as instruções do fabricante. Agora pode ser usado para imagens no microscópio.

Para iniciar a geração de imagens, ligue o laser e o microscópio seguindo as instruções do fabricante. Trave a câmara montada na inserção do stage no microscópio. Defina a temperatura da câmara de crescimento e do aquecedor objetivo em 37 graus Celsius ou outra temperatura de crescimento desejada.

Se a imagem estiver acima da temperatura ambiente, o foco ou o acolchoamento de gel geralmente se desviarão significativamente por aproximadamente 15 minutos após a mudança inicial de temperatura. Na prática. Use esse tempo para localizar regiões de interesse e modificar scripts de imagem conforme necessário.

Para um experimento. Ajuste a intensidade de excitação do laser para que quase todas as moléculas fluorescentes fotografem alvejante em seis exposições. Encontre células no microscópio e centralize-as em uma região de imagem predefinida e alinhada.

Em seguida, armazene a posição de cada célula, mais de uma célula pode ser visualizada em cada imagem. A janela de tempo de aquisição para imagens de lapso de tempo ao longo de muitas gerações garante que as células de imagem sejam inicialmente separadas de outras células, mas pelo menos algumas centenas de mícrons, para que outras colônias não entrem na região de imagem durante o crescimento. Usando um script de imagem automatizado, adquira dados de lapso de tempo usando o algoritmo descrito neste fluxo de trabalho experimental, que pode ser encontrado no protocolo de texto que acompanha este vídeo.

Essas imagens mostram dados típicos de lapso de tempo de um experimento de controle de código. Imagens de uma única colônia são mostradas em intervalos de 25 minutos. Neste experimento, os dados foram adquiridos a cada cinco minutos de 12 colônias diferentes.

Essas imagens representam imagens de campo claro e imagens de fluorescência YFP de Vênus com o fundo médio subtraído para levar em conta a mudança no fundo de todo o campo de imagem. Com o tempo, quando as imagens são sobrepostas, elas revelam a localização do pólo das moléculas repórter UB venosas TSR e heterogeneidade no número de moléculas produzidas em janelas de tempo de cinco minutos em diferentes células. Aqui são mostrados dados típicos de um único ponto de tempo em um experimento de rastreamento de código, imagens de fluorescência venosa de seis exposições de 100 milissegundos que foram adquiridas no início de cada intervalo de tempo de cinco minutos.

Cada uma das seis exposições foi separada por 900 milissegundos para dar tempo para que moléculas venosas transitoriamente escuras que piscaram se tornassem fluorescentes para análise. A imagem seis é subtraída da imagem um para corrigir moléculas não branqueadas e autofluorescência. As manchas de fundo nesta imagem estão localizadas em linhagens celulares específicas e quantificadas por sua intensidade de fluorescência integrada.

A fluorescência integrada média da colônia é então plotada em seis imagens, ajustando essa linha a um decaimento exponencial. Além disso, um deslocamento constante dá um intervalo de decaimento de aproximadamente um segundo. Neste experimento, as moléculas venosas fotobranqueiam muito mais rapidamente do que a autofluorescência celular.

Portanto, aproximadamente metade do número total de moléculas venosas são fotobranqueadas em cada quadro. Para este procedimento, a análise de imagem de condutividade pode ser realizada em outro para criar trics do número de moléculas de proteína produzidas em células individuais.