Name: Molécula única imagem da regulação gênica Em vivo Uso de ativação Cotranslational por clivagem (CoTrAC) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Aprenda o método CoTrAC para visualizar a produção de proteínas em células vivas de E. coli com precisão de molécula única usando microscopia de fluorescência. Esta técnica não invasiva permite estudar a dinâmica de fatores de transcrição.

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O pCG001 plasmídeo expressando Ubp1 foi gentilmente cedido por Rohan Baker na Curtin João Escola de Pesquisa Médica. Este trabalho foi financiado pela March of Dimes Bolsa de Investigação 1-FY2011, March of Dimes O&#39;Connor Iniciado Basil Prêmio de Pesquisa Acadêmico # 5-FY20 e NSF concessão de CARREIRA 0.746.796.

1. Fluxo de Trabalho de Engenharia tensão <ol><li> Inserir as sequências de codificação (a) uma sequência de localização da membrana, (b) uma proteína fluorescente amadurecimento rápido e (c) uma sequência de reconhecimento de protease N-terminal e para a armação com uma proteína de interesse (por exemplo, um factor de transcrição). Utilizou-se a membrana alvo Tsr-Venus repórter 2 e fundiu-o para a sequência de reconhecimento da protease de Ubiquitina (Ub) para contar o número de moléculas expressas bacteriófagos λ proteína repressora CI. Detalhes sobre como se construídas a proteína de fusão Tsr-Venus-Ub-CI, em substituição do tipo selvagem CI região codificante e que incorpora o arquétipo na E. cromossoma coli utilizando λ recombinação Red 3, estão descritos em detalhe na ref. 1. </li><li> Verifique se todas as modificações por seqüenciamento. </li><li> Transformar um plasmídeo que codifica uma protease específica para a sequência de reconhecimento usado acima para uma estirpe que expressa o repórter fluorescente e proteína de interesseem fusão traducional. Utilizou-se a protease Ubp1, que cliva imediatamente a seguir ao resíduo C-terminal da ubiquitina 4. </li></ol> 2. As células de cultura e preparar a amostra <ol><li> Escolha um E. coli colónia de interesse a partir de uma placa de agar de fresco listado em 1 ml M9 meio mínimo suplementado com 5 1X ácidos aminados do MAM e antibióticos apropriados. Incubar num agitador à temperatura desejada por tempo suficiente para alcançar OD 600&gt; 1.0 (densidade óptica a 600 nm). </li><li> Dilui-se a cultura em um meio M9 ml fresco com os antibióticos apropriados para a = 0,02 OD 600. Incubar num agitador à temperatura apropriada. Densidade celular inicial pode ser aumentada, se necessário para a baixa temperatura de crescimento. </li><li> Quando o OD 600 = 0,2-0,3 (a 37 ° C, com uma cultura inicial de células de DO600 = 0,02, isso vai levar 3-4 horas), iniciar a preparação do gel de agarose a almofada (passo 3). </li><li> As células estão prontas para imagiologia quando OD <sub&gt; 600 = 0,3-0,4. </li><li> Transferir 1 ml da cultura incubada num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, de centrifugação a 10000 xg durante 1 minuto numa microcentrífuga de bancada. </li><li> Descartar o sobrenadante e adicionar 1 ml de meio fresco M9 e ressuspender o pellet cuidadosamente. </li><li> Centrifugar a 10.000 xg durante 1 min. </li><li> Repita o passo 1,6 e 1,7. Descartar o sobrenadante. </li><li> Delicadamente ressuspender em 1 ml M9 mídia. As células podem ser directamente utilizados para imagiologia de microscópio ou 10 diluída - a 100 vezes para assegurar densidades celulares baixas para imagiologia timelapse. Note-se que as densidades celulares baixas são importantes para a imagiologia timelapse estendida. A câmara de imagem (passo 4) é vedada durante a experiência. Devido ao crescimento exponencial de células, as concentrações de células iniciais elevadas podem reduzir significativamente o oxigénio no interior da câmara após crescimento prolongado na almofada de gel, reduzindo a maturação da proteína fluorescente e que afectam o crescimento das células. </li></ol> 3. Preparar a solução de agarose <ol><li> Pesar 10-20 mgbaixo ponto de fusão à temperatura de agarose para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Adicionar adequado volume médio mínimo M9 sem antibióticos para fazer uma solução de 3% de agarose. </li><li> Aquece-se a solução de agarose durante 30 min a 70 ° C para derreter, invertendo o tubo para assegurar que a solução é completamente fundida e homogénea. A almofada de gel pode ser vertido neste ponto (passo 4), ou a temperatura pode ser reduzida para 50 ° C e mantida durante várias horas para uso posterior. </li></ol> 4. Prepare Pad Gel na Câmara <ol><li> Cerca de 50 min antes da imagiologia, lavar uma corrediça Microaqueduct com água. </li><li> Lavar uma cobertura de vidro limpas (usando um método rigoroso de limpeza como o descrito no ponto 6) e Microaqueduct lâmina com água estéril e seco por sopragem com ar comprimido. </li><li> Coloque a junta de borracha na corrediça Microaqueduct modo que cubra as entradas e saídas do lado da lâmina de vidro Microaqueduct (este pode ser modificado para aplicações emque a mídia é perfundido através da amostra). Aplicar 50 ul de solução de agarose (passo 3) para o centro da lâmina Microaqueduct. </li><li> Topo da solução de agarose com a tampa de vidro limpo, seco. </li><li> Deixar a solução de agarose mantida à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Enquanto isso, a preparar uma amostra de células (passo 2). </li><li> Retire cuidadosamente o vidro de cobertura da parte superior da almofada de gel. Adicionar 1,0 uL de cultura de células lavadas a parte superior da almofada de gel. Espere por ~ 2 min para a cultura a ser absorvido pela almofada de gel. É importante não esperar tanto tempo que os overdries almofada de gel, mas tempo suficiente para que as células estão devidamente aderiu à almofada de gel. O tempo ideal de espera vai variar com a temperatura e umidade. </li><li> Enquanto espera, secar outra tampa de vidro previamente limpas. </li><li> Cobrir a amostra com a tampa de vidro novo assegurando que a tampa de vidro deslizante e Microaqueduct estão bem alinhados. </li><li> Montar a temperatura da câmara de crescimento controlado seguindo as instruções do fabricante.Pode agora ser usado para imagens com microscópio (passo 5). </li></ol> 5. Imagem e Aquisição de Filmes Timelapse <ol><li> Ligar o laser e microscópio seguindo as instruções do fabricante (por exemplo, o laser pode precisar aquecido para ~ 0,5 h antes da experiência). </li><li> Bloquear a câmara montada na fase de inserção no microscópio. Definir a temperatura da câmara de crescimento e o aquecedor objectivo, a 37 ° C ou a temperatura de crescimento desejado outro. </li><li> Se imaging acima da temperatura ambiente, o foco ou almofada de gel, normalmente deriva significativamente para ~ 15 min após a mudança de temperatura inicial. Na prática, usar este tempo para encontrar regiões de interesse e modificar os scripts de imagem como necessário para uma experiência. </li><li> Encontrar as células no microscópio e armazenar a posição de cada célula após centrando-o dentro de uma região de imagem pré-definidos e alinhados. Mais do que uma célula pode ser trabalhada em cada janela de tempo de aquisição de imagem. Para timelapse imagens sobre mquaisquer gerações, assegurar que as células são inicialmente separadas imaged de outras células por pelo menos algumas centenas de ^ M, de modo que outras colónias não irá entrar na região de imagem durante o crescimento. </li><li> Ajustar a intensidade da excitação com laser, de modo que quase toda a Fotobranqueador moléculas fluorescentes dentro de 6 posições (Figura 5). </li><li> Usando um script de imagem automatizado / jornal, adquirir dados timelapse utilizando o algoritmo descrito no fluxo de trabalho experimental na Figura 3. </li></ol>

<ol><li>Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+expression+dynamics+of+transcription+factor+revealed+by+single-molecule+noise+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).</li>
<li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Gene+Expression+in+Live+Cells%2C+One+Protein+Molecule+at+a+Time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time.</a> Science. 311, 1600-1603 (2006).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li>
<li>Tobias, J. W., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+Functional+Analysis+of+the+Ubiquitin-specific+Protease+Gene+UBP1+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , ed. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. A2.2(2001).</li>
<li>Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aXiao%2C+J+%22Single+Molecules%3A+a+laboratory+manual%22">Single Molecules: a laboratory manual</a>. , 149-169 (2007).</li>
<li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li>
<li>Stagaman, G., Forsyth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright-field+microscopy+of+semitransparent+objects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt.+Soc.+Am.+A%22%5BJournal%5D)">Bright-field microscopy of semitransparent objects.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).</li>
<li>Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-end+rule+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The N-end rule in bacteria.</a> Science. 254, 1374-137 (1991).</li>
</ol>

Nós não temos divulgações.

O método CoTrAC pode ser generalizado para medir a produção de outras proteínas em que N-ou C-terminais convencionais fusões de proteínas fluorescentes podem comprometer a actividade da proteína. A estratégia CoTrAC tem três vantagens únicas sobre os métodos correntes. Em primeiro lugar, co-traducional fusão assegura que uma molécula do repórter fluorescente é produzido para cada molécula da proteína de interesse, permitindo a contagem precisa da produção de proteína em tempo real. Em segundo lugar, o repórter membrana-...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Agarose (temperatura de fusão baixa) </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td><td></td></tr><tr><td> Milli-Q H 2 O </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 × sais M9 </td><td></td><td></td><td> Seguinte receita descrita em 9 </td></tr><tr><td> Glicose 20% </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 x solução de MEM aminoácidos </td><td> Invitrogen </td><td> 11130-051 </td><td></td></tr><tr><td> Temperatura controlada CrescimentoCâmara Adaptador de estágio </td><td> Bioptechs </td><td> FCS-2 </td><td></td></tr><tr><td> Aquecedor objetivo </td><td> Bioptechs </td><td> Modelo depende objetiva de microscópio </td><td></td></tr><tr><td> Deslize Microaqueduct </td><td> Bioptechs </td><td> 130119-5 </td><td></td></tr><tr><td> Micro óculos cobertura </td><td> VWR </td><td> 40CIR-1 </td><td> Pode ser difícil de fonte; também disponível a partir de Bioptechs </td></tr><tr><td> Tampa de vidro / slide junta </td><td> Bioptechs </td><td> FCS2 0,75 mm </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de fluorescência </td><td> Vário </td><td> Exemplo de configuração: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, microscópio Olympus IX-81, Olympus PlanApo 100X 1,45 NA objetivo, Metamorph software </td><td> Deve ter excitação laser, automatizado fase xyz, software de automação capaz de imagem roteirizado e autofocus, óptica capazes de resolvinag únicas proteínas fluorescentes </td></tr><tr><td> EM-CCD da câmera </td><td> Vário </td><td> Exemplo de configuração: Andor ixon DU-898 </td><td> Deve ter ruído suficientemente baixo para detectar proteínas fluorescentes individuais acima fundo </td></tr></tbody></table>

molécula única imagem da regulação gênica<em&gt; em vivo</em&gt; uso de ativação cotranslational por clivagem (cotrac)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Descreve-se um método de fluorescência microscopia, Activation Co-translacional pela clivagem (CoTrAC) a imagem a produção de moléculas de proteína de células vivas com uma única molécula de precisão, sem perturbar a funcionalidade da proteína. Este método faz com que seja possível contar o número de moléculas de proteínas produzidas em uma célula durante sequenciais, as janelas de tempo de cinco minutos. Ela requer um microscópio de fluorescência com o laser de densidade de potência de excitação de ~ 0,5-1 kW / cm 2, o que é suficientemente sensível para detectar moléculas individuais de proteínas fluorescentes em células vivas. O repórter fluorescente usada neste método consiste em três partes: uma sequência de membrana alvo, um amadurecimento rápido, proteína fluorescente amarela e uma sequência de reconhecimento de protease. O repórter é traducionalmente fundidas com o N-terminal de uma proteína de interesse. As células são cultivadas em um estágio de microscópio de temperatura controlada. De cinco em cinco minutos, moléculas fluorescentes no interior das células são criadas imagens (e mais tarde coUnted, analisando imagens de fluorescência) e, posteriormente, Foto-descoloração, de modo que apenas as proteínas recém-convertidos são contados na medição seguinte. Imagens de fluorescência resultantes deste método podem ser analisados ​​por detecção de manchas fluorescentes em cada imagem, atribuindo-lhes a células individuais e, em seguida, a atribuição de células de linhagens de células. O número de proteínas produzidas dentro de uma janela de tempo numa dada célula é calculado dividindo-se a intensidade de fluorescência das manchas integrada com a intensidade média de moléculas fluorescentes individuais. Foi utilizado este método para medir os níveis de expressão na gama de 0-45 moléculas individuais em janelas de tempo 5 min. Este método permitiu-nos medir o ruído na expressão do repressor λ CI, e tem muitas outras aplicações potenciais em sistemas de biologia.

Os resultados típicos de uma experiência CoTrAC rastrear a produção do repressor λ CI são mostrados nas Figuras 4 e 5. Nesta experiência, foram obtidas imagens de 12 colónias em intervalos de 5 min. Em cada ponto de tempo, a colónia foi autofocused, centralizado no interior da região da imagem latente. Em seguida, a posição centrada / foco foi armazenada e uma imagem de campo claro foi adquirido. O palco foi então translocado por ~ 0,5 m ao longo do eixo z para mover a partir do plano f...

Descreve-se um método de fluorescência microscopia, Activation Co-translacional pela clivagem (CoTrAC), a imagem a produção de moléculas de proteína de células vivas com uma única molécula de precisão, sem perturbar a funcionalidade da proteína. Este método tem sido utilizado para seguir as dinâmicas de expressão estocásticos de um factor de transcrição, o repressor CI λ<sup&gt; 1</sup&gt;.

Molécula única imagem da regulação gênica<em&gt; Em vivo</em&gt; Uso de ativação Cotranslational por clivagem (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

O objetivo deste procedimento é adquirir imagens de fluorescência de lapso de tempo de colônias de e coli em crescimento, expressando construções de co-rastreamento para identificar o número de moléculas de proteína recém-produzidas. Isso é feito preparando primeiro uma amostra de células, coex expressando uma proteína de interesse fundida a um repórter Cora fluorescente e uma protease que cliva especificamente entre o repórter Cora e a proteína de interesse. O segundo passo é preparar um gel de baixa temperatura de fusão Aris feito com M nove meios mínimos.Em seguida, uma almofada de gel AROS é preparada para uso com uma câmara de amostra com temperatura controlada. As células de e coli são colocadas no gel e a câmara é montada. A etapa final é colocar a câmara em um microscópio de fluorescência e obter imagens de várias colônias de células em crescimento em intervalos regulares ao longo de várias gerações.O fotobranqueamento de moléculas de relatório TRE recém-produzidas em cada intervalo de todas as vezes é usado para adquirir traços de tempo de produção de proteínas em células vivas com resolução de molécula única e célula única. A vantagem desta técnica sobre as medidas ex de

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Biologia

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