Name: Imunofluorescência combinados e FISH DNA em 3D preservado núcleos interfásicos para estudar mudanças na organização nuclear 3D (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 55 s
Description: Aprenda a combinar imunofluorescência e DNA FISH para detectar modificações de histonas e sequências de DNA simultaneamente em núcleos interfásicos preservados em 3D. Este método avançado permite visualizar a dinâmica da cromatina com microscopia confocal tridimensional.

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Gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório Skok, especialmente Susannah Hewitt, para discussões e comentários. Este trabalho é apoiado pelo Instituto Nacional de bolsas de Saúde R01GM086852, RC1CA145746 (JAS). JAS é um Leukemia &amp; Lymphoma Society estudioso. JC é um Irvington Fellow Instituto do Cancer Research Institute. MM é apoiado por um National Science Foundation Grant Integrativa Pós-Graduação Pesquisa e Estágio (NSF IGERT 0.333.389).

1. DNA Labeling Sonda com fluoróforos: Nick Tradução (~ 6 horas) <ol><li> Limpeza BAC DNA (preparado por maxi-prep) ou plasmídeos ou produtos de PCR, todos ressuspenso em H 2 O, podem ser utilizados para a rotulagem. Note-se que para um sinal de FISH robusto, as sondas devem abranger pelo menos 10 kb. </li><li> Incubar DNA em RNase A durante 30 min a 37 ° C (todos os reagentes estão listados na Tabela 1). </li><li> Incubar a reacção de tradução de nick durante 2 horas a 16 ° C (ver Tabelas 2 e 3). Os métodos alternativos de marcação directa pode ser utilizado (exemplo: Tag FISH, Invitrogen). </li><li> Inactivar a reacção durante uma hora à temperatura de -80 ° C ou durante a noite a -20 ° C. </li><li> Determinar o tamanho da sonda sobre um gel de agarose a 2%. O esfregaço deve estar entre 100 e 1000 pb, com a maioria a cerca de 300-500 pb (Note-se que a mancha de Cy5 sondas não é visível). Se o DNA não é digerida suficiente, mais DNA Pol I eDNase I pode ser adicionado à mistura reaccional e incubou-se durante mais duas horas a 16 ° C. </li><li> Purifica-se as sondas de 0,025 milímetros filtros em duas provetas de litros cheio com H 2 0 por duas horas no escuro. </li><li> Adicionar factores de bloqueio para as sondas como se segue: 10 ug de ADN Cot-1, 10 ug de DNA Hybloc e 100 ug de esperma de salmão de 10 ^ g de sondas de DNA. Loja de sondas de ADN a -20 ° C. </li></ol> 2. Probe Precipitation / desnaturação / pré-hibridação (3-4 horas) <ol><li> Entre 0,3 ug e 1 ug de DNA de sonda é usada por lamela. Sondas de mistura com 0,1 volumes de NaAc 3M (pH 5,2) e 2,5 volumes de etanol a 100%, a incubação durante uma hora a -80 ° C ou durante a noite a -20 ° C e centrifugação a 13.000 rpm para baixo a 4 ° C durante 30 min. Note-se que a quantidade de sonda de DNA pode ser ajustada em função da qualidade do DNA e da região nuclear de hibridação. Os métodos alternativos de marcação directa podem permitir a utilização de quantidades reduzidas desonda. Para a detecção de sinais de DNA várias peixe em um slide, as diferentes sondas pode ser precipitada juntos (exceto sondas que não deve ser pré-recozido, como seqüências de repetição). Sondas para várias experiências realizadas ao mesmo tempo, podem também ser precipitados juntos. Pellets deve ser levemente coloridos de acordo com os fluoróforos usados ​​(se pequenas quantidades de sondas são precipitados, o sedimento pode não ser visível). </li><li> Pelotas secas e ressuspender-los em 15 ul de tampão de hibridação (ver Tabela 4) por cada lamela com agitação (usando um Thermomixer de Eppendorf) no escuro a 37-45 ° C (durante cerca de 20 min). </li><li> Sondas desnaturar durante 5 min a 75-95 ° C. </li><li> Pré-recozer sondas, a 37 ° C durante 30-60 min. Comprimento de pré-hibridação pode ser ajustada em função da complexidade e da qualidade das sondas. </li><li> Aplicar sondas para as lamelas para cruzamentos durante a noite (ver Seção 3). </li></ol> 3. 3PEIXES-dimensional DNA - Primeiro Dia (~ 3 horas) <ol><li> As células não aderentes são concentrados num pequeno volume de 1x PBS (~ 2x10 5 células em 5-10 ul de PBS 1x por lamela) e deixado cair no centro de uma lamela de poli-L-lisina revestido. As células aderentes deverá ser cultivadas em lamelas durante pelo menos 24 h (~ 70% de confluência) (lamelas podem ser revestidos com gelatina a 0,1%). Quadrados 18x18 para lamelas 24-24 mm são colocados em placas de 6 poços, e ao longo do protocolo, dois ml de cada solução é usada por poço (alternativamente redondo 1,5 mm, podem ser lamelas colocadas em placas de 12/24-well). </li><li> Fixar as células em paraformaldeído a 2% / PBS 1x, pH 7-7,4, durante 10 min à TA (stocks PFA a 4% pode ser dividido em alíquotas, armazenado a -20 ° C). Paraformaldeído podem ser comprados em solução (16%), ou as soluções de reserva de 4% pode ser preparada a partir de pó / grânulos. Paraformaldeído em pó é dissolvido em 1x PBS a&gt; 60 ° C (pH pode ser aumentado para 8-9 para facilitar a dissolução), arrefecido para baixo sobre o gelo, ajustared a pH 7-7,4, filtrada, aliquotadas e armazenadas em falcões durante semanas à temperatura de -20 ° C. </li><li> Após três lavagens em PBS 1x, permeabilizar as células em gelado fria de 0,4% de Triton-X-100/1 x PBS durante 5 min em gelo. Comprimento de permeabilização pode ser ajustado dependendo do tipo de célula-NB:. PEIXES Se o DNA é combinado com imunofluorescência, a imunomarcação devem ser realizados nesta fase (ver secção 4). </li><li> Após três lavagens em PBS 1x, as células a incubar com 0,1 ug / ul de ARNase A em 1x PBS, durante uma hora a 37 ° C. As lamelas são colocadas lado a célula para baixo sobre uma gota de 100 ul de solução em parafilme ou uma lâmina em câmara húmida. As lamelas são em seguida cuidadosamente removida com uma pinça. Se alguma resistência é encontrada, lamelas devem ser inundado com 1x PBS, a fim de evitar danificar as células. </li><li> Após três lavagens em PBS 1x, permeabilizar as células em gelado fria de 0,7% de Triton-X-100 / HCl 0,1 M durante 10 minutos em gelo. </li><li> Após três lavagens in 1x PBS, as células desnaturam em HCl 1,9 M durante 30 min à temperatura ambiente. Alternativamente, as células podem ser desnaturadas em formamida 50% / 2x SSC a 75-80 ° C durante pelo menos 30 min. Note-se que a hibridação comprimento (e da temperatura), pode ser optimizada, dependendo do tipo de célula. </li><li> Após três lavagens em gelo frio 1x PBS, hibridar com sondas de células durante a noite a 37 ° C numa câmara escura e húmida. Lamelas são colocados lado a célula para baixo em uma queda de 15 ul de sonda em um slide, e selado com cimento de borracha. </li></ol> 4. 3-dimensional Imuno-FISH - Primeiro dia (~ 6-7 horas) <ol><li> Por combinados FISH imunofluorescência / DNA, imuno-coloração deve ser realizada após a permeabilização em 0,4% de Triton-X-100 (Passo 3.3). </li><li> Incubar as células em solução de bloqueio durante 30 minutos a RT (2,5% de albumina sérica bovina (BSA), soro de cabra normal a 10%, 0,1% de Tween-20). A solução de bloqueio é filtrado, aliquotadas em 1,5 ml eppendorfs e armazenado para meses a -20 ° C. </li><li> Incubar as células com o anticorpo primário produzido contra a proteína ou a modificação das histonas de interesse diluído em solução de bloqueio, por uma hora, à temperatura ambiente numa câmara húmida. Aqui, mostramos o exemplo de um anticorpo contra a serina-139 fosforilada da H2AX (γ-H2AX, Millipore; Consulte a Tabela 5 para detalhes). As lamelas são colocadas lado a célula para baixo sobre uma gota de 100 ul de solução em parafilme ou uma lâmina em câmara húmida. As lamelas são em seguida cuidadosamente removida com uma pinça (inundado com 1x PBS, se necessário). Note-se que a diluição e tempo de incubação pode ser ajustada em função da qualidade do anticorpo e tipos de células. </li><li> Lave as células em 0,2% BSA / 0,1% de Tween-20/1 x PBS, três vezes 5 min à temperatura ambiente com agitação. </li><li> Incubar as células com o anticorpo conjugado com fluoróforo adequado secundário diluído em solução de bloqueio durante uma hora, à temperatura ambiente numa câmara escura e húmida. Aqui vamos mostrar um exemplo de detecção com umasecundário anticorpo de cabra anti-rato (Alexa Fluor 488 ou 555, Invitrogen; Consulte a Tabela 5 para detalhes). Hapteno-anticorpos secundários conjugados (biotina, digoxigenina, etc) podem também ser usados. Neste caso, um passo adicional para a detecção apropriada (estreptavidina, anti-dig, etc) pode ser realizada antes ou depois durante a noite a hibridação de DNA-FISH. </li><li> Enxaguar as células em 0,1% de Tween-20/1 x PBS, três vezes 5 min à temperatura ambiente com agitação no escuro. </li><li> Pós-fix células em paraformaldeído a 2% / PBS 1x durante 10 min à RT, no escuro. </li><li> Continuar FISH DNA como acima de incubação em RNase A (Passo 3.4). </li></ol> 5. 3-dimensional DNA FISH / Imuno-FISH - Segundo dia (~ 2 horas) <ol><li> Remova cuidadosamente cimento de borracha, lamínulas de inundação com 2x SSC, remova cuidadosamente com uma pinça e colocá-los em poços contendo solução de lavagem. </li><li> Lave as células em 2x SSC durante 30 min a 37 ° C no escuro, com agitação.</li><li> Lave as células em 2x SSC durante 30 min à RT, no escuro, com agitação. </li><li> Lave as células em 1x SSC durante 30 min à RT, no escuro, com agitação Note-se que em caso de desnaturação com formamida, lavagens deve ser substituído pelo seguinte:. Lavagens três lavagens em 50% de formamida / SSC 2x e 3 em 2x SSC, 5 min cada, a 37 ° C. </li><li> Montar as células em meio de prolongar a ouro de montagem contendo 1,5 ug / ml de DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol) para contracoloração de DNA total. Lamelas são colocados lado a célula para baixo em uma queda de 10-15 ul de meio de montagem de um slide e selado com unha polonês. As lâminas são mantidos durante meses a -20 ° C. </li></ol> 6. Microscopia 3D e Análise <ol><li> Imagens em 3D podem ser adquiridos com diversos sistemas de microscópio. Nas nossas experiências, secções ópticas separadas por 0,3 pm são recolhidas num AOBS SP5 Leica sistema confocal (acústico-óptico divisor de feixe). Note-se que a separação entre optical aviões pode ser ajustada dependendo do tipo de análise. </li><li> Pilhas de imagens em 3D podem ser analisados ​​utilizando um software diferente e ferramentas. Usamos o software Image J para avaliar medidas de distância entre loci de interesse e analisar diferentes tipos de associação dos locos de interesse com sub-compartimentos nucleares ou proteínas. </li><li> Todas as análises estatísticas foram realizadas para comparar dois (ou mais) diferentes condições biológicas com pairwise avaliação (s) de significância: comparação entre diferentes tipos de células ou estágios, a comparação entre os diferentes loci de interesse. Em todos os testes estatísticos, valores de P ≤ 5.00E-2 (a = 0,05) estão a ser tomadas significativa (1.00E-2 ≤ P ≤ 5.00E-2 * significativo; 1.00E-3 ≤ P ≤ 1.00E-2 * * muito significativa, P &lt;1.00E-3 *** altamente significativo). </li></ol> A análise estatística das distribuições inteiras de distâncias entre dois alelos. Nós c primeiroonstruct curvas de freqüência acumulada em toda a faixa de distâncias entre dois alleles.To avaliar a significância das diferenças nas distribuições de empíricos inter-alélicas distâncias usamos o teste não paramétrico de duas amostras de Kolmogorov-Smirnov (KS) 13,14. A análise estatística da associação estreita (ou seja, o emparelhamento) de dois alelos usando uma distância ideal de corte. Para identificar a gama de a maioria das diferenças robustas em distâncias entre dois alelos ou loci, usamos uma série de bicaudal teste exato de Fisher 15 s. Ou seja, em cada distância medida que testa se uma condição é significativamente sobre-representados em distâncias mais curtas entre as duas amostras. A mínima na distribuição dos valores de P indica a gama de distâncias que devem ser considerados como um ponto de corte para a íntima associação (emparelhamento ie) um dos dois alelos. Posteriormente, a bicaudal teste exato de Fisher é usado tó avaliar a importância do emparelhamento de dois alelos identificados no valor de corte 15. Correcções de teste são aplicados a contabilizar o número total de testes de Fisher realizada 16. A análise estatística da associação entre o locus de interesse com sub-compartimentos nucleares ou proteínas. O teste de duas caudas exacto de Fisher-é utilizado para analisar a importância da associação do locus de interesse com compartimentos diferentes ou proteínas 15.

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<li>Deriano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RAG2+C+terminus+suppresses+genomic+instability+and+lymphomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The RAG2 C terminus suppresses genomic instability and lymphomagenesis.</a> Nature. 471, 119-123 (2011).</li>
<li>Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+repositioning+of+genes+in+the+nucleus+of+lymphocytes+preparing+for+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division.</a> Molecular cell. 3, 207-217 (1999).</li>
<li>Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+the+histone+guardian+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+repair%22%5BJournal%5D)">H2AX: the histone guardian of the genome.</a> DNA repair. 3, 959-967 (2004).</li>
<li>Croft, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+localization+and+morphology+of+chromosomes+in+the+human+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus.</a> The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).</li>
<li>Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Xist+RNA+in+the+formation+of+a+repressive+nuclear+compartment+into+which+genes+are+recruited+when+silenced%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced.</a> Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).</li>
<li>Walter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+many+colors+in+FISH+on+3D-preserved+interphase+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+and+genome+research%22%5BJournal%5D)">Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei.</a> Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).</li>
<li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+wave+of+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">A new wave of cellular imaging.</a> Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).</li>
<li>Dobbie, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OMX%3A+a+new+platform+for+multimodal%2C+multichannel+wide-field+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).</li>
<li>Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+with+high-complexity+repeat-free+oligonucleotide+probes+generated+by+massively+parallel+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+research+%3A+an+international+journal+on+the+molecular%2C+supramolecular+and+evolutionary+aspects+of+chromosome+biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis.</a> Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.

As técnicas descritas acima foram usadas no nosso laboratório para analisar a regulação da recombinação V (D) J de imunoglobulina e Tcra / d loci no desenvolvimento de linfócitos 30,31. Estamos confiantes de que esta técnica pode ser adaptada para a detecção de várias proteínas nucleares, compartimentos nucleares e locos, em diferentes tipos de células. Modificações do protocolo pode ser necessário, e, neste caso, os passos principais para se concentrar são as seguintes. Em primeiro lugar, o...

Estabelecimento de mecanismos epigenéticos gatilho e herança de desenvolvimento e de células do tipo perfis específicos de transcrição. Em um nível, este envolve a modulação da embalagem da cromatina, que define as regiões genômicas ativas ou em silêncio. Numa escala maior, a organização 3D global do genoma e arquitectura nuclear também desempenhar um papel no controlo da transcrição de padrões. Assim, o esvaziamento desses recursos epigenômico é essencial para um entendimento completo de como os genes são regulados 6-11. FISH DNA combinado imunofluorescência e 3D fornecem uma oportunidade única para complementar análises moleculares e bioquímicos, avaliando interacções específicas / associações de sequências de ADN e / ou proteínas dentro do núcleo. Além disso, enquanto do genoma técnicas de alto rendimento, como cromatina imunoprecipitação (CHIP-seq) ou conformação cromossomo captura juntamente com o seqüenciamento de profundidade (4C-seq, 5C, Hi-C) fornecer dat mundialuma população de células em 12, técnicas de imunofluorescência / ADN FISH permitir análises ao nível da célula individual. Aqui nós descrevemos um protocolo para a detecção simultânea de modificações de histonas por seqüências de DNA por imunofluorescência e FISH DNA seguido por microscopia 3D e análises (3D imuno-FISH). A vantagem deste protocolo é a visualização conjunta de DNA e preservação de estruturas de proteínas. A nossa experiência neste campo nos permitiu melhorar e simplificar os protocolos existentes. Apesar de termos utilizados neste protocolo para a detecção de ADN de cadeia dupla em intervalos linfócitos submetidos a recombinação, este método pode ser aplicado a outras proteínas e de outros tipos de células.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Material </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> Pescador </td><td> # BP2470 </td><td></td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Sigma </td><td> # R4642 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP </td><td> Sigma </td><td> # DNTP100 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa dUTP </td><td> Invitrogen </td><td> # C11397 a C-11401 </td><td></td></tr><tr><td> Cy3 ou Cy5 dUTP </td><td> Pescador </td><td> N º 45-001-xxx </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Roche </td><td> # 04536282001 </td><td></td></tr><tr><td> DNA Pol I </td><td> Biolabs </td><td> # M0209 </td><td></td></tr><tr><td> 0,025 mM filtros </td><td> Millipore </td><td> # VSWP02500 </td><td></td></tr><tr><td> Cot-1 DNA 1 mg / ml </td><td> Invitrogen </td><td> # 18440 </td><td></td></tr><tr><td> Hybloc ADN de 1 mg / ml </td><td> Genética Aplicada </td><td> # MHB </td><td></td></tr><tr><td> Esperma de salmão </td><td> Sigma </td><td> # D1626 </td><td> pó a serem ressuspensas a 10 mg / ml em H2O </td></tr><tr><td> NaAc (Acetato de sódio, pH 5,2, solução tampão) </td><td> Sigma </td><td> # S7899 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 400 (Mol. Biol grau) </td><td> Pescador </td><td> # 525 </td><td></td></tr><tr><td> Polivinilpirrolidona (Mol Biol grau) </td><td> Pescador </td><td> # BP431 </td><td></td></tr><tr><td> Dextran pó de sulfato </td><td> Sigma </td><td> # D8906 </td><td></td></tr><tr><td> SSPE (Solução salina-fosfato de sódio-EDTA) solução 20x </td&gt; <td> Pescador </td><td> # BP1328 </td><td></td></tr><tr><td> Formamida </td><td> Pescador </td><td> # BP227 </td><td></td></tr><tr><td> Lamelas </td><td> Pescador </td><td> º 12-548-B </td><td></td></tr><tr><td> Slides </td><td> Pescador </td><td> # 12-550 </td><td></td></tr><tr><td> Placas de 6 poços </td><td> Pescador </td><td> # 0720080 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, 10x </td><td> Pescador </td><td> # MT-46-013-CM </td><td></td></tr><tr><td> Poli-L-lisina solução </td><td> Sigma </td><td> # P8920 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeído, grânulos, 95% </td><td> Sigma </td><td> # 441244 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X-100, Mol Biol grau </td><td> Sigma </td><td> # T8787 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (Albumina de Soro Bovino) Fracção V </td><td> Pescador </td><td> # BP 1600 </td><td></td></tr><tr><td> Soro normal de cabra </td><td> Vector Labs </td><td> # S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20, Mol Biol grau </td><td> Sigma </td><td> # P9416 </td><td></td></tr><tr><td> SSC (citrato de sódio Saline) solução 20x </td><td> Pescador </td><td> # BP1325 </td><td></td></tr><tr><td> Prolongar reagente Antifade Ouro </td><td> Invitrogen </td><td> # P36930 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI (4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindol) </td><td> Sigma </td><td> # D9542 </td><td></td></tr><tr><td> Melhor teste de um cimento de borracha casaco </td><td> Abastecimento de lojas de arte ou de escritório </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabela 1. Reagentes específicos e pequenos equipamentos. </td></tr></tbody></table>

imunofluorescência combinados e fish dna em 3d preservado núcleos interfásicos para estudar mudanças na organização nuclear 3d

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Hibridização fluorescente in situ utilizando sondas de DNA em 3-dimensionalmente núcleos preservados seguido por microscopia confocal 3D (3D FISH DNA) representa a forma mais direta de visualizar a localização de locos gênicos, cromossômica sub-regiões ou territórios inteiros em células individuais. Este tipo de análise fornece insights sobre a arquitetura global do núcleo, bem como o comportamento de loci genômicos e regiões específicas dentro do espaço nuclear. Imunofluorescência, por outro lado, permite a detecção de proteínas nucleares (histonas modificados, variantes de histonas e modificadores, maquinaria de transcrição e factores nucleares, sub-compartimentos, etc.) O principal desafio na combinação FISH DNA imunofluorescência e 3D é, por um lado, para preservar o epitopo detectada pelo anticorpo, bem como a arquitectura 3D do núcleo, e, por outro lado, para permitir a penetração da sonda de ADN para detectar locos gênicos ou territórios cromossômicos 1-5. Aqui nós fornecemos um protocolo que combina visualização de modificações da cromatina com loci genômicos em núcleos preservados 3D.

DNA e imuno-FISH são utilizados no laboratório Skok para estudar as alterações na organização nuclear associadas com o processo de recombinação V (D) J de receptor de antigénio, durante loci B e T o desenvolvimento de linfócitos. As técnicas acima descritas nos permitir i) medir distâncias entre as duas extremidades de um locus (contração) ii) medir distâncias entre alelos ou loci (emparelhamento), iii) analisar os danos no DNA que ocorrem dentro loci, iv) avaliar a localização de alelos e locos em relação ao nuclear su...

Aqui nós descrevemos um protocolo para a detecção simultânea de modificações de histonas por imunofluorescência e seqüências de DNA por FISH DNA seguido por microscopia 3D e análises (3D FISH imuno-DNA).

Imunofluorescência combinados e FISH DNA em 3D preservado núcleos interfásicos para estudar mudanças na organização nuclear 3D

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

O objetivo geral deste procedimento é detectar modificações da cromatina e sequências de DNA simultaneamente usando microscopia confocal 3D, as primeiras sondas de DNA específicas são geradas. Enquanto isso, as células experimentais são fixas permanentes e imunocoradas. Para os marcadores de histonas de interesse.As células são então desnaturadas e uma fluorescência noturna dentro de você. A hibridização ou peixe é realizada usando uma ou mais sondas de DNA. Finalmente, as células são lavadas e montadas para fluorescência 3D.A análise microscópica das imagens resultantes revela localização nuclear de loci de interesse e associação com modificações específicas de cálculos de His. A principal vantagem dessa técnica é que ela combina a visualização de proteínas nucleares, incluindo cálculos com loci genômicos em núcleos de preservação 3D, e pode ajudar a responder a questões-chave no campo da organização nuclear epigenética da cromatina ou regulação gênica. Para este procedimento, plasmídeos traseiros ou produtos de PCR podem ser usados para rotulagem.Estes devem ser preparados conforme descrito no texto anexo. Observe que, para um sinal de peixe robusto, as sondas devem gastar pelo m

combined-immunofluorescence-dna-fish-on-3d-preserved-interphase

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fluorescência dupla In situ Hibridação nas Seções cérebro fresco

Este artigo descreve a seleção de sondas adequadas para uma única célula FISH, técnicas de espalhamento de núcleos de blastômeros, e hibridização in situ e marcando sinal, aplicada ao diagnóstico genético pré-implantação (PGD) em um ambiente clínico.

FISH para diagnóstico pré-implantação Genética

Neste vídeo, descrevemos o método de imunofluorescência para visualizar a localização das proteínas de reparo de DNA γH2AX e 53BP1 nos locais de quebras de DNA de fita dupla em núcleos de células irradiadas.

Visualização baseada em imunofluorescência das interações da proteína de reparo do DNA

Nós descrevemos um protocolo robusto e versátil para a análise de arquitetura nuclear por FISH DNA 3D usando sondas fluorescentes diretamente marcadas.

Robust FISH DNA 3D utilizando sondas Diretamente rotuladas

O material aqui descreve um método desenvolvido para preservar a estrutura de cromatina tridimensional das células germinativas testiculares. Este foi chamado de método de slides tridimensional (3D). Este método melhora a sensibilidade para detecção de estruturas subnucleares e é aplicável para imunofluorescência, DNA e fluorescência de RNA na hibridização situ (FISH).

Método de preparação de slides para preservar arquitetura de cromatina tridimensional de células germinativas testiculares

Quadridimensional (4D) de imagem é utilizada para estudar o comportamento e as interacções entre os dois tipos de endossomas em terminais nervosos vertebrado vivo. O movimento destas pequenas estruturas é caracterizado em três dimensões, permitindo a confirmação de eventos, tais como a fusão do endossoma e exocitose.

Visualização de endosome Dynamics em Viver terminais nervosos com quatro-dimensional imagens de fluorescência

Desenvolvimento de cílios é vital para a organogênese adequada. Este protocolo descreve um método otimizado para rotular e Visualizar células ciliadas do zebrafish.

Visualização de células Multiciliated no Zebrafish através de um protocolo combinado de toda montagem fluorescente In Situ da hibridação e imunofluorescência

Este protocolo demonstra a imunofluorescência seqüencial e immunohistochemistry em Cryosections dos embriões do zebrafish do cedo-estágio permitindo análises precisas da colocalização em populações específicas da pilha.

Imunofluorescência sequencial e imuno-histoquímica em embriões de zebrafish Crioseccionados

O DNA 3D multicolor FISH representa uma ferramenta para visualizar loci múltiplogenômico dentro de núcleos preservados em 3D, definindo inequivocamente suas interações recíprocas e localização dentro do espaço nuclear em um único nível celular. Aqui, um protocolo passo a passo é descrito para um amplo espectro de células primárias humanas.

Ferramenta de peixe de DNA Multicolor 3D para estudar arquitetura nuclear em células primárias humanas

Apresentamos aqui um protocolo aprimorado para a preparação e imunossagem completa de testículos Drosophila, adequados para microscopia confocal e também permitindo rotulagem reprodutível e confiável. Ilustramos este protocolo por representação 3D e quantificação de experimentos de colocalização nos grandes espermatos S4-S5.

Imunostaining de Testes Drosophila de Monte Inteiro para Análise Confocal 3D de Grandes Espermatocitos

Aprenda a combinar imunofluorescência e DNA FISH para detectar modificações de histonas e sequências de DNA simultaneamente em núcleos interfásicos preservados em 3D. Este método avançado permite visualizar a dinâmica da cromatina com microscopia confocal tridimensional.

Imunofluorescência combinados e FISH DNA em 3D preservado núcleos interfásicos para estudar mudanças na organização nuclear 3D

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