Medidas de ruptura vacuolar única célula causadas por patógenos intracelulares

Este experimento monitora a ruptura de VA provocada por patógenos intracelulares em células únicas. Primeiro carregue as células com o corante CCF 4:00 AM, que é clivado por esterases celulares. Em seguida, prepare e aplique as neurobactérias FL nas quatro células carregadas do CCF, incube as células a 37 graus Celsius para invasão bacteriana das células hospedeiras.

Em seguida, determine a proporção de intensidades emitidas nos canais de 450 nanômetros e 535 nanômetros. Os resultados mostram a presença de patógenos no citosol devido à sua adaptabilidade a sistemas de alto rendimento. Esta técnica facilita a identificação de novos antibióticos, abordando um problema-chave da localização subcelular de bactérias durante as interações de patógenos hospedeiros.

Juntamente com meu colega Tran Vanu, estávamos interessados em desenvolver abordagens para observar patógenos intracelulares com alta resolução temporal. Isso levou ao estabelecimento do ensaio de ruptura regular de quatro betalactamases CCF. Hoje, essa abordagem será apresentada experimentalmente por dois alunos de pós-graduação em laboratório, Nora MellU e Charlotte Keller Inocular as cepas bacterianas selvagens e mutantes em oito mililitros de TCSB contendo 50 microgramas por mililitro de ampicilina colocar as culturas em um agitador de 37 graus Celsius agora semear cinco vezes 10 para o terceiro células hela por poço.

Em 100 microlitros de DMEM contendo 10% de soro fetal de bezerro 1% de cultura de estreptomicina de penicilina, as células em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono no dia seguinte subcultivam as bactérias em uma diluição de um 100º em TCSB suplementado com 50 microgramas por mililitro de ampicilina crescem em um agitador a 37 graus Celsius por duas horas e meia. Agora, para carregar as células hela, prepare o corante CCF às 4:00 da manhã, lave as células uma vez com PBS. Em seguida, adicione 25 microlitros de mistura de carregamento CCF às 4:00 da manhã por poço em temperatura ambiente no escuro por duas horas e 30 minutos para preparar as bactérias para a infecção pelota um mililitro de cultura por centrifugação após uma lavagem com 500 microlitros de PBS Resus, suspenda a bactéria em 500 microlitros de PBS suplementado com 10 microgramas por mililitro de poliol lisina e 40 microgramas por mililitro de beta-lactamase.

Incube por 10 em uma roda giratória à temperatura ambiente, depois lave uma vez com 500 microlitros de PBS e ressuspenda cada pellet bacteriano em 500 microlitros de um milimolar Probenecida em tampão EM, lave as células uma vez com 150 microlitros de um milimolar prob em tampão em. Em seguida, dilua 10 microlitros de bactérias em 100 microlitros de uma solução sondada milimolar e distribua-a para cada poço de células hela. Após 15 minutos de incubação no escuro à temperatura ambiente, transfira a placa para 37 graus Celsius por uma hora.

Lave uma vez com 150 microlitros de uma solução de probit milimolar. Em seguida, fixe as amostras com 50 microlitros de aldeído paraforme a 4% em uma solução milimolar Pro por 10 minutos no escuro Após uma lavagem com solução de probenecida, adicione 30 microlitros de corante nuclear 10 micromolar drac five para uma segmentação celular ideal. Incubar as células por 30 minutos, lavar uma vez e adicionar 100 microlitros de solução milimolar para adquirir imagens usando um microscópio de epifluorescência invertido.

Use um comprimento de onda de excitação de 405 nanômetros. Detecte a emissão por meio de filtros de 450 nanômetros e 535 nanômetros usando tempos de exposição de cinco milissegundos para luz transmitida. 1000 milissegundos para 535 nanômetros e 500 milissegundos para 450 nanômetros.

O uso de um dispositivo de calibração de foco acoplado à microscopia automatizada permite a aquisição simultânea de dezenas de posições diferentes em vários poços. Se estiver usando um microscópio confocal, use tempos de exposição de 240 milissegundos a 450 nanômetros, 360 milissegundos a 535 nanômetros para o laser de 405 nanômetros e 640 milissegundos para o laser de 640 nanômetros. Analise os dados por um algoritmo de computador que permite a pontuação automatizada do sinal fluorescente para cada célula individual.

Por exemplo, use softwares como metamorph e acapella para criar um script para medir a proporção entre os sinais de emissão de 450 nanômetros e 535 nanômetros. Para este ensaio, inicie uma cultura HELOC com duas vezes 10 elevado à quinta célula em um volume final de dois mililitros. Prepare as bactérias para infecção e carregue as células hela com CCF 4:00 AM organize um microscópio de conversa com uma objetiva de ar de plano N dentro de uma câmara de aquecimento de 37 graus Celsius.

Defina o laser de 405 nanômetros e a emissão por meio de filtros de 450 nanômetros e 535 nanômetros. Insira também tempos de exposição de cinco milissegundos para luz transmitida. 200 milissegundos para 535 nanômetros e 100 milissegundos para 450 nanômetros.

Defina a aquisição de dados para cada 90 segundos em 60 minutos. Agora lave as células uma vez com dois mililitros de uma solução milimolar de probenecida. Adicione dois mililitros de um problema milimolar no tampão em.

Em seguida, monte o prato no palco do microscópio e inicie a aquisição após seis minutos. Coloque a aquisição em espera. Adicione 250 microlitros de ressuspensão bacteriana no topo das células e reinicie a aquisição para a análise pós-aquisição.

Visualize filmes usando metamorfose de velocidade ou imagem J.Obtenha taxas de intensidade de 450 a 535 nanômetros para cada célula individual. A abordagem CCF 4:00 AM beta-lactamase é um método robusto e sensível para rastrear a ruptura ular de patógenos intracelulares, como gel flexneri, após infecção por células HELOC. Com a cepa não invasiva BS 176 AFA one por uma hora, a sonda CCF de quatro trastes permanece intacta e emite um sinal verde.

Em contraste, a cepa virulenta M 90 TFA I muda o sinal para azul consistente com a clivagem da sonda no citosol para a determinação do sinal métrico da razão. Desenvolvemos um script para o software metamorph e acapella para automatizar a detecção das células e medições nos canais de 535 e 450 nanômetros. Os núcleos e o citosol das células são segmentados usando o canal DR cinco.

Em seguida, o algoritmo é capaz de detectar e quantificar as populações de células positivas de 450 nanômetros e 535 nanômetros. As razões médias calculadas são baixas para a cepa mutante e altas para a cepa virulenta. Os experimentos podem ser realizados em diferentes tipos de células humanas, como células epiteliais de Gila e células semelhantes a macrófagos THP one.

Ambos os tipos de células respondem à cepa virulenta M 90 T AFA one cha, mudando o sinal emitido de verde para azul sob infecção. Com a cepa não invasiva, o sinal verde persiste a quantificação usando um script desenvolvido em software metamorfo e uma macro desenvolvida em Excel apresenta histogramas de ruptura ular em função da distribuição celular. O método pode ser adaptado com sucesso para entender a infectividade de diferentes bactérias.

Por exemplo, este conjunto de dados mostra mycobacterium Bovis. O BCG reside no fagossomo durante todo o curso do experimento, conforme mostrado pelo sinal verde persistente. Em contraste, o mycobacterium tuberculosis provoca ruptura da membrana vaga em macrófagos THP um após sete dias de infecção, conforme destacado pela aparição de um sinal de 450 nanômetros após sete dias de infecção usando o mesmo algoritmo.

Quanto ao estudo da ruptura valar por Ella, descobrimos que as células infectadas por Mycobacterium tuberculosis exibem proporções mais altas de 450 a 535 nanômetros do que o Mycobacterium bovis BCG após sete dias de infecção. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estudar a ruptura ular por patógenos com o ensaio CCL quatro betalactamase Uma vez dominado, este protocolo pode ser realizado em quatro horas, mas lembre-se, você deve adicionar proce em cada tampão durante todo o protocolo. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como microscopia eletrônica ou fracionamento por membrana, é que ela pode ser realizada em tempo real sem nenhum tratamento bioquímico.

Análises adicionais, como marcação de actina ou ensaio de proteção com gentamicina, podem ser realizadas para avaliar a absorção e a proliferação das bactérias nas células hospedeiras.