Flexão Medidas rigidez de Biopolímeros usando ensaios de deslizamento

O objetivo geral deste procedimento é usar um ensaio deslizante para medir a rigidez do UAL dos microtúbulos. Isso é feito primeiro anexando especificamente a proteína motora cinesina a uma lâmina de microscópio com domínios motores livres para ligar os microtúbulos. O segundo passo é adicionar microtúbulos marcados com fluorescência à amostra, que são traduzidos pela cinesina.

Em seguida, vídeos de microtúbulos deslizantes são coletados usando microscopia de fluorescência. A etapa final é analisar os vídeos do ensaio deslizante para calcular a rigidez à flexão dos microtúbulos. Em última análise, os ensaios de deslizamento são usados para determinar a rigidez à flexão de microtúbulos individuais.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da mecânica do citoesqueleto, como a rigidez à flexão de polímeros individuais do citoesqueleto. Demonstrando este procedimento estará Anna Ratliff, uma estudante do meu laboratório. Para iniciar este procedimento, prepare o tampão de ensaio de trabalho adicionando 10 microlitros de 200 mili mole DIO três atol ou DTT a um mililitro da solução tampão de ensaio de estoque e misture.

Mantenha esta e todas as outras soluções de trabalho em temperatura ambiente durante o procedimento. Em seguida, usando o tampão de ensaio de trabalho, prepare 40 microlitros de tampão BSA de biotina combinando albumina de soro bovino biotinilada filtrada estéril a dois miligramas por mililitro com o tampão de ensaio de trabalho na proporção de um para um e misturando a solução. Em seguida, prepare o tampão BSA combinando 645 microlitros de tampão de ensaio com 5,5 microlitros de 117 miligramas por mililitro BSA e misturando a solução.

Prepare também o tampão de tritina misturando 57 microlitros de tampão de ensaio com três microlitros de estreptococo filtrado estéril a 10 miligramas por mililitro no tampão de ensaio. Em seguida, construa as pistas de fluxo em uma lamínula de 24 por 60 milímetros extrudada cinco linhas finas de graxa a vácuo de uma seringa de 10 mililitros. Usando uma ponta de pipeta de 200 microlitros para regular o fluxo, as linhas devem estar separadas por aproximadamente quatro milímetros.

Coloque uma lamínula de 22 por 22 milímetros em cima da graxa a vácuo e pressione levemente para formar os canais. Com um volume aproximado de 10 microlitros, as linhas de graxa a vácuo devem se espalhar até aproximadamente o dobro da largura original. O próximo passo é pré-pavimentar as pistas com albumina de soro bovino biotinilado, pipetando 10 microlitros do tampão bioTE BSA em cada pista de fluxo usando força capilar para aspirar o tampão incubar por cinco minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, enxágue cada pista três vezes injetando 15 microlitros do tampão BSA em um lado de cada pista enquanto retira a solução do outro lado usando um lenço Kim ou papel de filtro. Tome cuidado para não introduzir bolhas de ar nas pistas. Em seguida, 15 microlitros de tampão estreptavidina em cada pista e incubar por até duas horas com um mínimo de 10 minutos.

Durante a incubação, prepare o alfa KC em tampão misturando 200 microlitros de tampão BSA, 50 microlitros de alfa KC filtrado estéril em cinco miligramas por mililitro em tampão de ensaio e 0,8 microlitros de 15 micromolares a TP em pH sete. Prepare também a solução de cinesina pipetando o tampão alfa KCM em um novo tubo e adicionando a biotina cinesina a 10 nano molares e, em seguida, misturando após a incubação com o tampão estreptavidina. Enxágue cada pista três vezes com 15 microlitros de tampão BSA.

Em seguida, enxágue cada pista com 15 microlitros do tampão alfa kcn para reduzir a ligação não específica de cinesina e microtúbulos ao vidro. Em seguida, adicione 15 microlitros de solução de cinesina a cada pista e incube por 15 minutos a uma hora. Durante esse período, a biotina cinesina formará uma forte ligação com a estreptavidina ligada à superfície e permitirá que os domínios motores da cinesina sejam acessíveis para a ligação de microtúbulos.

Enquanto isso, prepare uma solução de paclitaxel 40 micromolar e alfa KC e tampão. O paclitaxel é importante para evitar a despolimerização dos microtúbulos. Em uma capela de exaustão, prepare o tampão anti-branqueamento de fluorescência misturando 95 microlitros de tampão alfa KCM, 2,5 microlitros de estoque de glicose, um microlitro de 100 x eliminação de oxigênio.

Misture um microlitro de Paclitaxel e DMSO a quatro milimolares. E, finalmente, um microlitro de beta me capto etanol. Após a incubação, enxágue qualquer biotina cinesina livre lavando cada pista com 15 microlitros de temperatura ambiente.

O paclitaxel em solução de alfa Kian usando tampão frio pode despolimerizar os microtúbulos. Finalmente, pipee o tampão anti-alvejante de fluorescência para um novo tubo e adicione os microtúbulos marcados com fluorescência a uma diluição de um a 100 a um a 1000. Em seguida, adicione um milimolar a TP e misture.

Injete 15 microlitros da solução de microtúbulos em uma pista e observe usando microscopia de fluorescência em 30 minutos. Os aspectos mais críticos deste procedimento são ter uma concentração ideal de microtúbulos para garantir que eles não se sobreponham e ter um fundo baixo. As pistas restantes são usadas para otimizar a concentração de microtúbulos, e usamos o próprio microscópio para alinhá-las e focalizá-las.

A imagem dos microtúbulos deslizantes é feita usando um microscópio de fluorescência de reflexão interna total caseiro. Uma objetiva de abertura numérica de 100 x alta exibe um campo de aproximadamente 50 mícrons por 50 mícrons, o que é espaço suficiente para visualizar o movimento por aproximadamente 100 segundos a uma taxa de 0,5 mícrons por segundo definida. O laser usado para excitação para uma configuração de potência de três a cinco miliwatts.

Essa potência é baixa o suficiente para evitar o fotobranqueamento do piso de quatro mais rapidamente do que 100 segundos para permitir um tempo de imagem adequado. Usando o software de captura de imagem, colete sequências de imagens a cinco quadros por segundo por dois minutos. As sequências devem ser longas o suficiente para que os microtúbulos atravessem todo o campo de visão.

Analise os dados da imagem usando uma rotina IDL, como o arquivo, obtenha o LP Pro, que pode ser obtido do material suplementar. Essa rotina DL retorna um valor de comprimento de persistência baseado em todos os microtúbulos deslizando em uma determinada sequência de imagens. Modifique os parâmetros de intensidade dependendo da intensidade do flúor quatro e da configuração do microscópio.

Aqui é mostrado um ensaio deslizante feito com microscopia de fluorescência de reflexão interna total. Os quatros de flúor podem ser vistos esparsamente decorados ao longo do comprimento dos microtúbulos. As trajetórias de quatro flúor único que acabamos de mostrar são mescladas, combinando uma média de 10 quatro flúor em um único ponto por 100 nanômetros para melhorar a análise de dados.

Ao olhar para um único microtúbulo, o ângulo tangente entre cada ponto pode ser facilmente calculado e mapeado em função do comprimento. Usando ângulos tangentes, o comprimento de persistência pode ser calculado e o cosign médio por comprimento de segmento pode ser plotado usando a equação mostrada aqui. Uma linha de melhor ajuste pode ser determinada Uma vez dominada.

Essa técnica pode ser usada para medir a rigidez à flexão de várias dezenas de microtúbulos em três ou quatro horas, se for executada corretamente.