Name: Caracterização histológica intacta de Microdevices Brain-implantados e tecido circundante (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Aprenda a caracterizar histologicamente microdispositivos implantados no cérebro de roedores preservando o tecido circundante intacto. Esta técnica avançada utiliza imunohistoquímica e microscopia confocal para analisar respostas biológicas em nível subcelular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Todos os experimentos foram realizados sob a supervisão da Animal Care Purdue e do Comitê do Programa de Uso e Animais de Laboratório da Universidade Purdue. Este trabalho foi patrocinado pela Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Microsystems Tecnologia Office (OMP), sob os auspícios do Dr. Jack W. Judy (jack.judy @ darpa.mil), como parte do Programa de Tecnologia de confiança Neural, através de Espaço e Guerra Naval Systems Command (SPAWAR) Systems Center (SSC) Pacific Grant No. N66001-11-1-4013. Os autores gostariam de agradecer Mikhail Slipchenko, Don Ready, Greg Richter, Aaron Taylor e Kevin Eliceiri para compartilhar seus conhecimentos microscopia.

Soluções Tampão fosfato salino (PBS) -, em g / l, 9 g de NaCl, 0,144 g de KH 2 PO 4, 0,795 g de Na 2 HPO 4, pH 7,4 O formaldeído a 4% - em ml / l; 202 ml de fosfato de sódio dibásico solução (0,4 M de Na 2 HPO 4), 48 ml de fosfato de sódio monobásico solução (0,4 M NaH 2 PO 4), 500 ml de solução de formaldeído a 8%, 250 ml de água Milli- Q DDi água, a pH 7,4 HEPES salino tamponado de Hank com azida de sódio (HBHS) -, em g / l, 7,5 g de NaCl, 0,3 g de KCl, 0,06 g de KH 2 PO 4, 0,13 g de Na 2 HPO 4, 2 g de glucose, 2,4 HEPES g, 0,05 g de MgCl2 6 partes de H 2 O, 0,05 g de MgSO 4 7 partes de H 2 O, 0,165 g de CaCl2, 0,09 g de NaN3, pH 7,4 Solução de Lavagem (WS) - 1% vol / vol, nemsoro de cabra normal, 0,3% de Triton X-100, em HBHS com azida de sódio (NaN3). Refrigerar a WS a 4 ° C antes da sua utilização nos passos subsequentes. U2 Sca l Solução e - ureia 4 M, glicerol a 30% e 0,1% de Triton X-100 17 PROCEDIMENTO Todos os experimentos foram realizados sob a supervisão da Animal Care Purdue e do Comitê do Programa de Uso e Animais de Laboratório da Universidade Purdue. 1. Cirurgia <ol><li> Vários métodos cirúrgicos assépticos são compatíveis com o método apresentado histológica. O uso de uma armação estereotáxica e inserters automatizados são recomendados para melhorar a reprodutibilidade e controlo das matrizes de microeletrodos (MEA) Ângulo de implante em relação aos planos estereotáxicas. </li></ol> Nota: Nesta demonstração o nosso método cirúrgico é a seguinte: manter o sujeito em roedor estereotáxico earbars while sob anestesia isoflurano (entre 1-3%) realizadas pelo oxigênio da classe médica. Teste para a falta de um dedo do pé pinch-reflectir no rato ou a falta de um reflexo de aperto da cauda no ratinho para confirmar que o animal é completamente anestesiada. Aplicar pomada e limpar o local da cirurgia, com três lavagens alternadas de Betadine e álcool. Lavar as mãos, luvas cirúrgicas, hairnet madrugada, máscara e bata. Injetar um bolus de Lidocaína para anestesiar a área cirúrgica, criar uma incisão com tesoura ou periósteo, bisturi claro com raspador de osso e aplicadores de algodão, e criar uma craniotomia usando uma peça de mão broca de dentista e broca. Dirija um MEA haste única para o córtex usando um micromanipulador. Ter uma ajuda assistente cirúrgico para manter condições cirurgia asséptica e documentar o andamento da cirurgia. <ol start="2"><li> Após a implantação da MEA no cérebro, recolha de imagens por meio de um microscópio cirúrgico, para informar a eventual remoção do crânio a partir de em torno do bchuva. Porções dos dispositivos implantados serão preservados in situ. </li></ol> Nota: A recolha eventual de tecido com os dispositivos in situ baseia-se no que segue de perto o plano da inserção do dispositivo com o plano de seccionamento de tecidos. Notas detalhadas sobre o plano de inserção do dispositivo em relação ao cérebro, são, portanto, muito importante. <ol start="3"><li> Após o procedimento, aplique o elastômero de silicone Kwik-Sil (WPI), em torno de todo exposto MEA hastes ou cabos, e deixar curar. A peça de plástico esterilizado, tal como uma ponta de pipeta de corte, pode ser usado para ajudar a conter o elastómero de silicone em um pequeno poço em torno da craniotomia enquanto cura. </li><li> Aplique uma camada de duas partes em acrílico dental (&quot;Liquid Jet&quot; e &quot;Pó Jet&quot; de Lang Dental) sobre o Kwik-Sil e qualquer crânio exposto. </li></ol> Nota: Num passo posterior, o headcap vai ser derretido através de permitir que o implante seja separadoa partir do crânio. De cura UV acrílico devem ser evitados durante a Kwik-Sil e craniotomia, como esta acrílico duro é difícil de remover mais tarde. Materiais com visual opaco ao redor do implante também devem ser evitados; clara Kwik-Sil fornece uma visão do implante durante as etapas subseqüentes deste protocolo. <ol start="5"><li> Realizar procedimentos de cuidados pós-operatórios de acordo com o protocolo local dos regulamentos bem-estar animal, e retornar assuntos ambulatoriais a única alojados gaiola-boxes. </li></ol> 2. Perfusão e coleta de tecido Nota: Veja Gage et al. para um passo a passo detalhado de perfusão procedimento no modelo animal de ratos 19. <ol><li> Use a anestesia e perfusão protocolo aprovado pelo cuidado da instituição animal e comitê de uso. Após profundamente anestesiar o roedor (confirmado por uma falta do dedo pinch-reflexo em ratos ou cauda pinch-reflexo em camundongos) e expor o coração, fazer cortes rasos de tesoura empara o ventrículo esquerdo e átrio direito. Inserir uma agulha romba para dentro do ventrículo esquerdo e entregar temperatura ambiente PBS. Fornecer um total de ~ 10 ml de PBS a ~ 5 ml / min, em ratinhos, e ~ 200 ml de PBS a ~ 100 ml / min, em ratos. Olhe para depuração do sangue do fígado durante. </li><li> Injectar etiquetas químicas relevantes transcardially histologicamente, se assim for desejado, por entrega de seringa com o cuidado de evitar a introdução de bolhas de ar. </li></ol> Nota: As etiquetas vasculares (por exemplo, dii) e corantes de ácidos nucleicos, por exemplo, para contraste (Hoechst 33342) são exemplos de etiquetas químicas administráveis ​​durante a perfusão. Quando administrado corretamente, esses marcadores histológicos deve rotular o animal inteiro 20. <ol start="3"><li> Entregar temperatura ambiente tamponado, formaldeído 4% transcardially para fixar o animal. Evitar perfuração do septo através do coração, que pode ser evidenciado pelos pulmões nariz de drenagem durante a perfusão. Procure por tremores de fixação nos grandes músculospara indicar a perfusão completa. Fornecer um total de ~ 10 ml de fixador em ~ 5 ml / min, em ratinhos, e ~ 200 ml de fixador em ~ 100 ml / min, em ratos. </li><li> Na sequência de perfusão, decapitar o animal, expor parte do tronco cerebral ou cerebelo usando fórceps, tesouras, e cabeça lugar em solução de formaldeído a 4% durante a noite a 4 ° C. </li><li> Lava-se a cabeça em três mudas de PBS com um a quatro horas de intervalo entre as lavagens. </li><li> Armazenar as cabeças fixas em HBHS contendo azida de sódio a 4 ° C durante dias a meses. </li></ol> 3. Remoção cérebro com Dispositivos situ Nota: Execute esta seção em uma coifa enquanto usava equipamento de proteção individual. Evitar a dessecação dos tecidos, devolvendo a cabeça fixa para HBHS solução periodicamente. <ol><li> Dissecar cuidadosamente afastado pele e outros tecidos de todo o gorro acrílico com pinças e tesouras pequenas. </li><li> Quando estiver usando o calor-iluvas nsensitive, utilizar um ferro de solda para remover acrílico dental e expor uma área de subjacente claro Kwik-Sil (Figura 2a). </li></ol> Nota: O objectivo deste passo é o de permitir que os micro-tesouras um ângulo adequado de acesso a posições em que os dispositivos implantados entram no cérebro, de modo que os componentes implantados cerebrais pode ser separado a partir de componentes fixados ao crânio. <ol start="3"><li> Sob um microscópio cirúrgico, cortado em elastómero de silicone com curvas micro-tesoura, removendo pequenos pedaços de Kwik-Sil, com uma pinça para baixo para a posição em que os dispositivos de entrar no cérebro. </li><li> Continuar o corte ao longo da superfície da craniotomia com curvas micro-tesoura para separar componentes do dispositivo ligados a silício policristalino e do crânio a partir de componentes implantados no cérebro. Mais uma vez usar a ampliação microscópio e muito cuidado ao cortar as componentes do dispositivo expostos, tomando cuidado para evitar empurrando ou arrastando o implants no tecido fixado. </li><li> Remover o osso ao redor do headcap com cuidado usando fórceps. Usar uma espátula para separar o cérebro com os dispositivos implantados no crânio. Guarde o cérebro em solução HBHS até estar pronto para cortar. </li><li> Colocar o cérebro de uma placa de Petri de vidro cheio de HBHS, e utilizar uma lâmina de barbear para remover tecidos estranhos, tais como medula, cerebelo, bulbo olfativo ou, dependendo de se são relevantes para o local de implantação do dispositivo. Usar um bloco cérebro (Ted Pella) e lâminas de barbear para a secção do cérebro e criar uma superfície plana que segue de perto o ângulo dos dispositivos implantados, o que é conseguido através da colocação do cérebro em um bloco de cérebro de tamanho apropriado, orientando o cérebro de tal modo que qualquer porção visível do implante é paralelo com a guia de lâmina de barbear, e a colocação de uma lâmina de barbear de uma lâmina de guia de pelo menos 2 mm a partir do implante. Pressionar a lâmina através do tecido. Montar esta superfície para uma plataforma de vibratome. Alternarespectivamente, uma lâmina de barbear montada de um micromanipulador pode ser usado de uma forma semelhante como o controlo de bloco cérebro para criar um plano que segue de perto a direcção do implante. </li><li> Lugar de gelo sob a plataforma vibratome, e, depois de permitir que a superfície do tecido para secar brevemente sobre uma toalha de papel, aderir o cérebro para um vibratome usando Super Glue. Cola ao plano do tecido liso criado na etapa anterior é o estágio. Com as dimensões de tecido assimétricos, orientar a amostra de tal modo que a maior dimensão é colado para baixo em paralelo com a direcção do movimento da lâmina de vibratome para ajudar a evitar que a lâmina potencialmente batendo o tecido acabado. Depois dos conjuntos de cola (~ 1-2 min), adicionar gelada (~ 4 ° C) ao prato de PBS vibratome em torno do tecido. </li><li> Colete fatias de tecido de espessura entre 200-400 pm, incluindo o tecido de controlo, utilizando a taxa de vibração máxima (~ 100 Hz) e uma taxa de progressão lenta da lâmina (&lt;0,2 mm por segundo), com um ângulo da lâmina de 10 ° a partir de horizontal. Colete fatias cuidadosamente com uma espátula de escova ou colher e armazenar em HBHS em uma placa de 24 poços a 4 ° C. </li><li> Uma vez que o dispositivo em situ é visível a olho nu ou um microscópio cirúrgico, recolher as secções mais finas para se aproximar do dispositivo em incrementos de fatias de 100 um ou menos. </li></ol> Nota: típicos de silicone micro-implantes são visíveis a olho nu em formaldeído fixo tecido do córtex cerebral de roedor, entre 300 e 500 um a partir da superfície do dispositivo. <ol start="10"><li> Com o dispositivo em situ agora próximo da superfície do tecido, recolher uma fatia de tecido&gt; 250 um, contendo o dispositivo de dentro. Estimativa da espessura necessária pode ser auxiliada por referência fatias previamente recolhidas. </li></ol> Nota: Os dispositivos maiores, dispositivos multidentes e dispositivos angulares podem exigir cortes mais finos de tecido (&gt; 500 um) para capturar o dispositivo de uma só peça de tecido; remembro que tanto a penetração de rótulos aplicados ea profundidade imagens de microscopia será limitado na coleta de dados eventual dessas fatias muito grossas. Se possível, evitar a colidir com o dispositivo, com a lâmina vibratome, pois pode provocar a arrastar do dispositivo através da deformação do tecido e morfológicas. 4. Processamento de tecidos e de Compensação <ol><li> Lavar 3x em fatias de 5 minutos por lavagem em HBHS </li><li> Incubar em borohidreto de sódio (5 mg NaBH 4/1 ml de HBHS) para 30 total min (15 min cada lado da fatia). Virar as fatias usando um aço inoxidável ou Teflon colher revestido de micro e pequeno pincel (Ted Pella). Movimentos lentos e pensativo melhorar o sucesso de cada flip fatia. Evite tocar em todas as áreas em torno do dispositivo implantado com a escova. Quando possível, adicionar a solução de significativamente mais do que o necessário (&gt; 2 ml) permite manipular e virar as fatias de tecido mais facilmente. </li></ol>Nota: Esta etapa reduz endógena autofluorescência; pular esta etapa se etiquetas fluorescentes foram aplicados durante a perfusão ou XFP marcadores transgênicos estão presentes. <ol start="3"><li> Lavar 3x em fatias de 5 minutos por lavagem em solução de lavagem à temperatura ambiente. </li></ol> Nota: agitação durante as etapas de lavagem e de incubação é opcional. Os autores especulam que subtil brusco do implante rígida em relação ao tecido cerebral circundante pode ocorrer com agitação. No entanto, um misturador orbital em movimento a uma velocidade suave (&lt;rpm 60) pode evitar este enquanto aumenta o movimento de soluções. <ol start="4"><li> Bloquear, durante 2 horas em solução de lavagem à temperatura ambiente (fatias aleta depois de uma hora). </li><li> Incubar em anticorpos primários (diluído em solução de lavagem) durante cerca de 48 h (24 h de cada lado da fatia) a 4 ° C. </li><li> Executar 6 3 lavagens rápidas min com a solução de lavagem. </li><li> Executar 6, 1 hora (3 lavagens lavagemes em cada lado da fatia de tecido), em solução de lavagem (armazenar a 4 ° C durante a noite, se lavar). </li><li> Incubar em anticorpos secundários (diluído com solução de lavagem) durante cerca de 48 h (24 h de cada lado) de 4 ° C. </li><li> Executar 6 3 lavagens rápidas min com a solução de lavagem. </li><li> Executar 6, 1 hr lavagens (3 lavagens de cada lado) na solução de lavagem; armazenar a 4 ° C durante a noite, se lavar. </li><li> Remover Solução de lavagem e adicionar o glicerol-based &quot;U2 - Sca l e&quot; solução de compensação. Permitir a limpar a cerca de 1 semana para rodelas grossas (250-500 um) ou 2-3 semanas para as secções de tecido de grande espessura (&gt; 500 um), a 4 ° C. </li><li> Cobrir a placa com folha de alumínio e armazenar a 4 ° C. </li><li> Montar em lâminas acomodando cortes de tecidos de espessura (Figura 2b, 2c) usando uma solução de limpeza como meios de montagem e selagem com unha polonês claro. Armazenar a 4 ° C ao abrigo da luz. </li></ol> 5. Panorama Imagem de Full TiInterface de ssue e Dispositivo <ol><li> Usando mais-trabalho objetivos distância microscópio (&gt; 2 mm), começam imagem com um laser microscópio confocal ou dois fótons microscópio. Nós vamos demonstrar com um LSM Zeiss 710, lente Carl Zeiss software &quot;Zen&quot; (2010), e um estágio XY controlada por computador traduzindo a imagem de um panorama 3D em torno de um implante. </li></ol> Nota: correto para o índice de refração da solução de limpeza ou em software, através de uma coleira corretiva sobre o objectivo, ou em processamento de dados após a coleta. Nesta demonstração entramos em um valor de índice de refração para a solução de compensação &quot;U2&quot; de 1,4 para o software Leica microscópio Zen; esta definição sutilmente ajusta z-passo intervalos para contabilizar incompatibilidade índice de refração. <ol start="2"><li> No tecido perto do dispositivo, cerca de avaliar as apropriadas do eixo z definições da janela e coleta de dados do z-dimensão para cada canal fluorescente usando laser de baixa potência (~ 00,5-5%) e grandes z-passo tamanhos (&gt; ^ M 25). </li></ol> Nota: Inclua um espaço adicional acima e abaixo ao definir o eixo z ao configurar a coleta de dados panorâmica, como o tecido não pode ficar inteiramente plana no vidro do carro (~ 20 um em cada direção). <ol start="3"><li> Estabeleceu o objectivo no centro xy do panorama eventual, usando o software panorama Zen, determinar o número de posições de coleta necessários para cada eixo (X e Y) para cobrir a sua região de interesse. </li><li> Reavaliar e finalizar a coleção janela eixo z. </li><li> Definir manualmente a sensibilidade do detector de potência de laser e a rampa de forma adequada com maior profundidade, o objectivo é, tipicamente, de manter aproximadamente o mesmo a intensidade da imagem, independentemente da profundidade de imagem na direcção da fatia de tecido, mas também para evitar o ruído de fundo elevado. </li><li> Recolher cada imagem fluorescente série de dados. Se necessário, para evitar a sobreposição de sinais, executar linha de lasers seqüencialmente. </li></ol> Nota: Se estiver disponível, ajustar o software para salvar automaticamente os dados para o disco rígido durante a coleta. <ol start="7"><li> Altere as configurações de software para coletar o &quot;reflexão&quot; e &quot;transmitância&quot; de dados, e usar um mais longo, comprimento de onda mais penetração (por exemplo, 633 nm) para captar esses canais. Determinar a potência do laser apropriado e sensibilidade do detector de &quot;reflectância&quot; e &quot;transmitância&quot; recolha e repetir a mesma série recolha em torno do dispositivo implantado. </li><li> Exportar os dados para posterior processamento, quantificação e análise. </li></ol>

<ol><li>Schwartz, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+Neural+Prosthetics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cortical Neural Prosthetics.</a> Annual Review of Neuroscience. 27, 487-507 (2004).</li>
<li>Normann, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technology+Insight%3A+future+neuroprosthetic+therapies+for+disorders+of+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Clinical+Practice+Neurology%22%5BJournal%5D)">Technology Insight: future neuroprosthetic therapies for disorders of the nervous system.</a> Nature Clinical Practice Neurology. 3, 444-452 (2007).</li>
<li>Rousche, P., Normann, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+recording+capability+of+the+Utah+Intracortical+Electrode+Array+in+cat+sensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Chronic recording capability of the Utah Intracortical Electrode Array in cat sensory cortex.</a> Journal of Neuroscience Methods. 82, 1-15 (1998).</li>
<li>Koivuniemi, A., Wilks, S. J., Woolley, A. J., Otto, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal%2C+longitudinal+assessment+of+intracortical+microstimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Multimodal, longitudinal assessment of intracortical microstimulation.</a> Prog. Brain Res. 194, 131-144 (2011).</li>
<li>Otto, K. J., Rousche, P. J., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstimulation+in+auditory+cortex+provides+a+substrate+for+detailed+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Microstimulation in auditory cortex provides a substrate for detailed behaviors.</a> Hearing Research. 210, 112-117 (2005).</li>
<li>Drake, K., Wise, K., Farraye, J., Anderson, D., BeMent, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+planar+multisite+microprobes+in+recordingextracellular+single-unit+intracortical+activity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Performance of planar multisite microprobes in recordingextracellular single-unit intracortical activity.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 35, 719-732 (1988).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+the+interface+between+neural+tissue+and+chronically+implanted+intracortical+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Rehab.+Eng%22%5BJournal%5D)">Stability of the interface between neural tissue and chronically implanted intracortical microelectrodes.</a> IEEE Trans. Rehab. Eng. 7, 315-326 (1999).</li>
<li>Williams, J. C., Hippensteel, J. A., Dilgen, J., Shain, W., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+impedance+spectroscopy+for+monitoring+tissue+responses+to+inserted+neural+implants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Complex impedance spectroscopy for monitoring tissue responses to inserted neural implants.</a> J. Neural Eng. 4, 410-423 (2007).</li>
<li>Polikov, V., Tresco, P., Reichert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+brain+tissue+to+chronically+implanted+neural+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes.</a> Journal of Neuroscience Methods. 148, 1-18 (2005).</li>
<li>Szarowski, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+responses+to+micro-machined+silicon+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Brain responses to micro-machined silicon devices.</a> Brain Research. 983, 23-35 (2003).</li>
<li>McConnell, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implanted+neural+electrodes+cause+chronic%2C+local+inflammation+that+is+correlated+with+local+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Implanted neural electrodes cause chronic, local inflammation that is correlated with local neurodegeneration.</a> J. Neural Eng. 6, 056003(2009).</li>
<li>Holecko, M. M., Williams, J. C., Massia, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+intact+interface+between+neural+tissue+and+implanted+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Visualization of the intact interface between neural tissue and implanted microelectrode arrays.</a> J. Neural Eng. 2, 97-102 (2005).</li>
<li>Pierce, A. L., Sommakia, S., Rickus, J. L., Otto, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-film+silica+sol-gel+coatings+for+neural+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Thin-film silica sol-gel coatings for neural microelectrodes.</a> J. Neurosci. Methods. 180, 106-110 (2009).</li>
<li>Wilks, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%283%2C4-ethylene+dioxythiophene%29+%28PEDOT%29+as+a+micro-neural+interface+material+for+electrostimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroengineering%22%5BJournal%5D)">Poly(3,4-ethylene dioxythiophene) (PEDOT) as a micro-neural interface material for electrostimulation.</a> Frontiers in Neuroengineering. 2, (2009).</li>
<li>Johnson, M. D., Otto, K. J., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+voltage+biasing+improves+unit+recordings+by+reducing+resistive+tissue+impedances%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Neural+Syst.+Rehabil.+Eng%22%5BJournal%5D)">Repeated voltage biasing improves unit recordings by reducing resistive tissue impedances.</a> IEEE Trans Neural Syst. Rehabil. Eng. 13, 160-165 (2005).</li>
<li>Otto, K. J., Johnson, M. D., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+pulses+change+neural+interface+properties+and+improve+unit+recordings+with+chronically+implanted+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Voltage pulses change neural interface properties and improve unit recordings with chronically implanted microelectrodes.</a> IEEE Trans. Biomed. Eng. 53, 333-340 (2006).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 14, 1481-1488 (2011).</li>
<li>Woolley, A. J., Desai, H. A., Steckbeck, M. A., Patel, N. K., Otto, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+characterization+of+the+brain-microdevice+interface+using+Device+Capture+Histology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">In situ characterization of the brain-microdevice interface using Device Capture Histology.</a> Journal of Neuroscience Methods. 201, 67-77 (2011).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nature Protocols. 3, 1703-1708 (2008).</li>
<li>Clendenon, S. G., Young, P. A., Ferkowicz, M., Phillips, C., Dunn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+Tissue+Fluorescent+Imaging+in+Scattering+Specimens+Using+Confocal+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Deep Tissue Fluorescent Imaging in Scattering Specimens Using Confocal Microscopy.</a> Microscopy and Microanalysis. 17, 614-617 (2011).</li>
<li>Wilks, S. J., Richner, T. J., Brodnick, S. K., Kipke, D. R., Williams, J. C., Otto, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+Biasing%2C+Cyclic+Voltammetry%2C+%26+Electrical+Impedance+Spectroscopy+for+Neural+Interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Voltage Biasing, Cyclic Voltammetry, & Electrical Impedance Spectroscopy for Neural Interfaces.</a> J. Vis. Exp. (60), e3566(2012).</li>
</ol>

Os autores não têm divulgações relevantes para declarar, financeira ou outra.

O &quot;dispositivo de captura-Histologia&quot; método (DCHist) demonstraram aqui permite a avaliação histológica perto de interações morfologia preservada entre o tecido cerebral e implantes de tecidos. Recolha de tecidos DCHist requer a separação cuidadosa dos componentes montados no crânio do dispositivo a partir de componentes implantados no cérebro. DCHist também exige a coleta de uma fatia de tecido grosso histológico (&gt; 250 mm). Estes cortes de tecido, uma vez rotulado, limpo, montado, e com imagens, pode fornecer informações novas para a implantação ou lesão resposta crônica após a dispositivos de longa permanência. Usando ferramentas avançadas de microscopia, a interface entre o tecido e o dispositivo pode ser trabalhada e analisada em grande detalhe, como mostrado nas Figuras 3-5. As técnicas apresentadas na sua forma actual contam com a capacidade de, lentamente, embora a escavar headcap feita a partir de duas partes de cimento dentário e Kwik-Sil para baixo para o ponto de implantação do dispositivo.Utilizando cimento dental que pode ser gravado ou de outro modo removida para longe e um elastómero de silicone transparente através da qual pequenas tesouras pode ser guiado visualmente auxiliar muito sucesso em separar o dispositivo implantado a partir dos seus componentes montados no crânio. A tentativa de cortar o dispositivo sob o crânio acima do cérebro e, a fim de recolher lo in situ não é recomendado, porque o implante crânio montado irá ser puxado para fora do cérebro, de uma quantidade significativa. Embora mais finos, implantes menores, tais como AAM haste individuais de NeuroNexus, são mais passíveis de DCHist, os princípios não estão restritos a hastes de dispositivos individuais ou matrizes de microeletrodos. Recolha e estratégias de imagem são amplamente aplicáveis ​​a haste multi-dispositivos e implantes maiores, tais como cânulas, com os requisitos é que eles devem ser separados a partir de qualquer montagem do crânio e recolhido dentro de uma secção de tecido de espessura. Embora os autores estão focados na análise do tecidocircundantes implantes corticais, dispositivos movidos mais fundo no cérebro também pode ser recolhida e trabalhada. A profundidade de inserção do implante não deve afectar a captura do implante de uma fatia, desde que o dispositivo não se desviar muito de o ângulo de inserção conhecidas. Existem limitações à aplicação útil do método DCHist. Seções de tecido cerebral são difíceis de imagem através de centenas de micrômetros, especialmente nas áreas de substância branca, embora as soluções de compensação óptica pode melhorar muito profundezas de imagem em vários tecidos 21. Para melhorar ainda mais a profundidade de imagem, de dois fotões microscopia de excitação podem ser empregues juntamente com a limpeza óptica descrita. Outra limitação potencial do método descrito podem ser os métodos específicos e anticorpos imuno fluorescentes utilizados pelos investigadores. Difusão passiva normalmente dirige a incorporação destes marcadores através de tecido fixadoe em sites de ligação a antígenos. As concentrações finais de anticorpo de trabalho deve ser determinada por investigadores numa base caso a caso para maximizar a penetração da etiqueta, evitando níveis elevados de etiquetagem de fundo. Rotulagem de anticorpos não deve ser variável entre fatias que são processados ​​de forma idêntica, mas de diferentes anticorpos podem variar consideravelmente na sua capacidade de penetrar e marcar o seu antigénio, com alguns anticorpos facilmente etiquetar antigénios muitas centenas de micrómetros de profundidade e de outros antigénios de etiquetagem apenas dezenas de micrómetros de profundidade. Descrevemos melhorar esta difusão por aplicação de etiquetas de anticorpos em concentrações superiores típicos, com vários dias de aplicação, e de uma solução contendo detergente diluído e bloqueio de soro. Periodicamente lançando as fatias também promove ainda rotulagem. Passos de recuperação de antigénio e os processos de fixação adicionais (por exemplo glutaraldeído microondas, etc) pode ser adequado para antigénios específicos. Anticorpo secundário fluoroch-conjugados roma pode também variar no seu desempenho rotulagem de espessura, embora isto não tenha sido observado pelos autores usando rótulos de Alexa Fluor da Invitrogen. Alternativamente, os indivíduos animais transgénicos que expressam proteínas fluorescentes em tipos de células de interesse pode ser utilizada para evitar problemas com a penetração etiqueta de anticorpo, tal como muitas proteínas fluorescentes, tais como eGFP, conservam a sua fluorescência após tratamento com formaldeído, e pode ser imediatamente visualizado em secções de tecido. DCHist é um poderoso conjunto de técnicas para capturar e analisar o impacto de microdispositivos implantados no tecido cerebral. Acoplamento este protocolo histológico com in vivo de avaliação de qualidade e de eletrofisiologia de dados de eletrodos de impedância 22 poderia melhorar muito a nossa compreensão das fontes biológicas de variabilidade fisiologia e degradação. O campo de dispositivos implantados protéticos neurais em particular, podem beneficiar com a detalhada DCHist imaging da interface de dispositivo / tecido intacto para informar um maior desenvolvimento de dispositivos biologicamente neutros MEA.

O campo de pesquisa tem como objetivo neuroprótese para ajudar as pessoas que sofrem de várias deficiências e transtornos ignorando estruturas doentes ou danificadas no corpo através de interface SNC 1,2 dispositivos. Microdispositivos Brain-implantados, tais como matrizes de microeletrodos (MEA), pode ser utilizado para gravar ou estimular as estruturas cerebrais e, assim, permitir o estabelecimento de longo prazo interfaces entre electrónica e tecido do SNC 3-5. MEAs penetrantes, os dispositivos que são conduzidos para o tecido cerebral, em particular como uma promessa bidireccionais interfaces devido à proximidade em que se apresentam os eléctrodos a um conjunto relativamente pequeno de neurônios próximos 6. No entanto, as respostas complexo tecido resultam da implantação a longo prazo de MEAs penetrantes, muitas vezes resultando em variáveis ​​e gradualmente degradar electrofisiológicas sinal-para-ruído mais dias ou meses, e um aumento na impedância eléctricadade entre os sites de eletrodos e terra 7,8. As origens putativas destas alterações incluem a activação de microglia, astrocitose reactiva ao longo dos microdispositivos, e uma perda ou migração de neurónios a partir do tecido circundante para dispositivos implantados 9-11. Um grande desafio para a compreensão dessas alterações no tecido em torno crônicas AAM, a penetração é a dificuldade na captação de dados histológicos da interface tecido circundante intacto dispositivos cronicamente implantados 12. A análise histológica do tecido com a interface do dispositivo / tecido ainda presente seria melhorar os atuais dispositivo de remoção de protocolos histológicas. Com um dispositivo sem perturbações restante no tecido, o impacto biológico das interacções relativamente subtis, tais como a utilização de revestimentos biocompatíveis 13,14 ou a compensação eléctrica da superfície do eléctrodo, 15,16 podem ser visualizados e analisados ​​em relação ao implante. Here que demonstrar um método para coletar, processar e imagem da interface microdispositivo intacta por análise de microscopia baseada detalhada do tecido cerebral circundante. Neste método, o dispositivo e o tecido cerebral circundante são recolhidos dentro de uma secção de tecido espesso (&gt; 250 um), utilizando um vibratome. Para melhorar a penetração do rótulo histológica para estas rodelas grossas, etiquetas fluorescentes histoquímicos e imuno-histoquímicos são aplicados em concentrações elevadas em soluções contendo soro de bloqueio e um detergente para vários dias. Uma solução de limpeza óptico é utilizado para melhorar a profundidade de imagem de microscopia, eo tecido é montado em dois lados para câmaras de laser subsequente por microscopia confocal 17. Para capturar a interface completa histológica, uma fase controlada por computador é utilizado durante a translação de imagem para recolher z-stack panoramas ao longo do comprimento dos implantes. Além de imagens aplicadas etiquetas de tecido, a coleta de reflexão laser de volta a partir de implantese transmissão de luz através do tecido ajuda ambos localizar a interface do dispositivo em relação ao tecido circundante. Tecidos preparados com este &quot;dispositivo de captura-Histologia&quot; (DCHist) protocolo fornece acesso às imagens morfologia preservada tecido / dispositivo de interações e, assim, melhora a anteriores dispositivo de remoção de protocolos histológicos 18.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagentes </td></tr><tr><td> Hoechst 33342 </td><td> Invitrogen </td><td> 14533 </td><td> DNA marcador </td></tr><tr><td> Coelho anti-Iba1 </td><td> Wako (Japão) </td><td> 019-19741 </td><td> Anticorpo monócitos </td></tr><tr><td> Acrílico dental </td><td> Lang Dental (vários distribuidores) </td><td> Jet Pó Reparação Prótese e líquido </td><td> Headcap construção </td></tr><tr><td> Kwik-Sil </td><td> Instrumentos de Precisão mundo </td><td> KWIK-SIL </td><td> Cobrindo expostos implantes cranianos </td></tr><tr><td> Soro normal de cabra </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 005-000-121 </td><td> Processamento de tecidos </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X100-500ml </td><td> Processamento de tecidos </td></tr><tr><td> Uréia </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U4883 </td><td> Limpando solução </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G20225 </td><td> Limpando solução </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Curvas micro-tesoura </td><td> Instrumentos de Precisão mundo </td><td> 14208 </td><td> Corte implante antes de remover cérebro </td></tr><tr><td> Giletes </td><td> Ted Pella </td><td> (Vários tamanhos) </td><td> Para utilização com o bloco Cérebro </td></tr><tr><td> Acrílico Cérebro Matrice </td><td> Ted Pella </td><td> 15054 </td><td> Bloco cérebro para criar plano inicial no tecido </td></tr><tr><td> Lâminas de plástico </td><td> Ted Pella </td><td> 260225 </td><td> Tecido de montagem </td></tr><tr><td> Tampa de vidro </td><td> Ted Pella </td><td> (Vários tamanhos) </td><td> Tecido de montagem </td></tr><tr><td> Matrizes de eletrodos </td><td> NeuroNexus </td><td> (Vários modelos) </td><td> AAM exemplo </td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Leica </td><td> VT1000 S </td><td> Sistema específico usado no método apresentado </td></tr><tr><td> Lâminas Vibratome </td><td> (Vários fornecedores) </td><td></td><td> Coletar fatias </td></tr><tr><td> Placas de 24 poços </td><td> (Vários fornecedores) </td><td></td><td> Armazenamento e processamento de fatias de tecido </td></tr><tr><td> Microscópio confocal com estágio motorizado XY-varredura </td><td> Carl Zeiss Microscopy </td><td> Software Zeiss LSM 710 e &#39;2010 Zen&#39; </td><td> Sistema específico usado no método apresentado </td></tr><tr><td> Ferro de solda </td><td> (Vários fornecedores) </td><td></td><td> Escavação headcap </td></tr></tbody></table>

caracterização histológica intacta de microdevices brain-implantados e tecido circundante

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

A investigação sobre o design e utilização de micro-cérebro implantados, como matrizes de microeletrodos, visa produzir dispositivos clinicamente relevantes que interagem com o tecido circundante cronicamente cérebro. Tecido circundante destes implantes é pensado para reagir à presença dos dispositivos ao longo do tempo, o qual inclui a formação de um isolante &quot;cicatriz glial&quot; em volta dos dispositivos. No entanto, a análise histológica destas alterações do tecido é normalmente realizado após o explantar dispositivo, num processo que pode perturbar a morfologia do tecido de interesse. Aqui demonstramos um protocolo em que os dispositivos implantados-corticais são recolhidos em torno intacto tecido cerebral dos roedores. Descrevemos como, uma vez perfundidos com fixador, os cérebros são removidos e cortados de modo a evitar a dispositivos explantar. Nós delineamos rotulagem anticorpo fluorescente e métodos de compensação óptica úteis para a produção de um tecido, informativo ainda grossasecção. Finalmente, demonstramos a montagem e imagiologia destas secções de tecido, a fim de investigar a interface biológica em torno cerebrais implantados dispositivos.

MEAs Brain-implantados podem ser recolhidos em fatias de tecido, primeiro pela separação quaisquer componentes crânio montado a partir dos componentes do cérebro incorporados. Figura 2a mostra os resultados da remoção de um dos lados de um headcap cimento dentário e uma porção do Kwik-Sil em torno de um cabo de MEA num crânio de ratos. Um ferro de soldar foi utilizada para remover o cimento dental e Kwik-Sil numa hotte. A cablagem e quaisquer estruturas não-MEA foram implantados próximo cortado com micro-tesouras por escavação lentamente através do Kwik-Sil para baixo para a superfície do cérebro fixo. Após corte, etiquetagem e limpeza de tecidos, simples feitos por lâminas são úteis para a montagem das fatias de tecido de espessura (Figura 2b). Uma fatia de cérebro montado que contém um microdispositivo implantado é mostrado na Figura 2c. Imagiologia através de qualquer um dos lados da lâmina pode permitir-lhe avaliar a interface em torno de um dispositivo, tal como demonstrado na Figura 3 </strong&gt;, em que ao longo da microglia suporte de silício de um MEA são visíveis a partir de um lado (Figura 3a) e ao longo de microglia sítios de eléctrodos e vestígios visíveis do outro lado (Figura 3b). Uma vez montado, o tecido pode ser visualizado utilizando um estágio de translação XY. Sínteses das etiquetas fluorescentes através fatias de tecido inteiro pode ser gerado com a resolução desejada (Figura 4). A análise detalhada do interface tecido morfologicamente conservados em torno de microdispositivos implantados podem ser recolhidos sob a ampliação elevada para a análise da resposta do tecido local (Figura 5). <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50126/50126fig1highres.jpg"/> Figura 1. Visão geral de procedimento. (AC) do cérebro micro-implante cirurgias são finazados com uma camada de polímero Kwik-Sil que rodeia imediatamente o dispositivo, seguido de um revestimento acrílico. (D, e) Após a eutanásia, a camada acrílica é queimado, e crânio-montados componentes do dispositivo são separados dos componentes implantados por corte através do elastómero de silicone. (F, g) O cérebro é então removido a partir do crânio e é cortada e montada na fase vibratome. (Hk) fatias de tecido são recolhidos, incluindo uma fatia de tecido que contém o dispositivo. (L) tecido pode então ser processado e montado em câmaras personalizados para microscopia detalhada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50126/50126fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. (A) Limpar Kwik-Sil su elastômero de siliconerrounding um cabo de eletrodo array (seta) foi exposta através da queima de distância de uma janela na tampa de cimento dentário em uma cabeça roedor perfundido usando um ferro de soldar. (B) Para acomodar imagens em ambos os lados de uma fatia de tecido grosso, simples &quot;slide-câmaras&quot; pode ser feito cortando um slide de plástico e aderindo lamela de cada lado em torno do tecido e solução de montagem. (C) Um rato fatia de tecido cerebral com o implante intacto (seta vermelha) é mostrada após a montagem. Ambos os lados do tecido é rapidamente acessível a imagens de microscopia com esta configuração. Para a escala, painel (a) é de 25 mm de diâmetro, na parte inferior, enquanto que os painéis (b, c) é de 80 mm de diâmetro, na parte inferior. <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50126/50126fig3highres.jpg"/> Figura 3. Int Máximaensity z projecções de 40 um de espessura, pilhas de imagens recolhidas em torno da parte traseira (a) e frontal (b) de uma matriz de microeletrodos implantados. Microglia (marcado com anti-Iba1 e Alexa Fluor 633, branco) e laser de reflexão de luz (vermelho), recolhidas a partir da superfície do dispositivo, foram sequencialmente trabalhada a partir de ambos os lados de uma fatia de tecido 400 um de espessura. À medida que os implantes cerebrais são muitas vezes opacos, montagem com acesso óptico de ambos os lados permite uma visão clara de estruturas de tecido marcados &quot;por trás&quot; do implante em relação ao objectivo do microscópio. Barra de escala 50 mm. <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Uma fatia DCHist rotulado fotografada usando um estágio controlado por computador em um microscópio confocal a laser. (A) núcleo celular (corados com Hoechst 33342) e (b) os monócitos / microglia(Marcado com anti-Iba1) foram simultaneamente fotografada em canais separados. (C) A transmissão e reflectância de luz também foram recolhidos, mostrando a localização do implante de 4 semanas em relação a Hoechst e Iba1 dados. (D) sobreposição de todos os canais de transmissão, mas também é mostrada. A área do retângulo branco é ampliado em imagens que aparece à direita. Barra de escala de 1 mm. <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig5.jpg" alt="Figura 5" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50126/50126fig5highres.jpg"/> Figura 5. Usando um microscópio de fase controlada por computador e software apropriado, os dados de imagem panorâmica pode ser recolhido em torno do implante. Reflectância (a) e de transmitância (b) permitir a localização do dispositivo, enquanto que as etiquetas fluorescentes anticorpos ou químicas (c, anti-Iba1 rotulagem de microglia e macrophages) permitir imagens detalhadas dos componentes do tecido ao longo da interface do tecido intacto. Barra de escala de 200 um.

Aqui apresentamos um método histológico para captura, rotulagem, opticamente limpar e imagem da interface tecido intacto cérebro em torno de microdispositivos cronicamente implantados no tecido cerebral dos roedores. Os resultados das técnicas que compõem este método são úteis para a compreensão do impacto dos vários penetrantes cérebro-implantes em seu tecido circundante.

Caracterização histológica intacta de Microdevices Brain-implantados e tecido circundante

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

O objetivo deste procedimento é obter imagens da interface do tecido cerebral intacto em torno de microdispositivos cronicamente implantados no tecido cerebral de roedores. Isso é feito utilizando primeiro elastômero de silicone de célula rápida e um acrílico dental de duas partes para cobrir a craniotomia e formar uma calota craniana ao redor do dispositivo implantado no cérebro. Depois de perfundir o animal com fixador e processamento de tecido post-mortem, a parte implantada no cérebro do dispositivo é separada da tampa da cabeça queimando o acrílico dental e cortando a célula rápida.Em seguida, o cérebro é removido e fatiado com um vioma para capturar o implante em uma seção de tecido. A etapa final é preparar o tecido para imagens fluorescentes lavando a rotulagem e, em seguida, limpando a seção do tecido em solução de limpeza óptica. Em última análise, a microscopia confocal é usada para mostrar a resposta biológica intacta que o implante cerebral penetrante produz no tecido circundante na escala subcelular.A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como explicar, o dispositivo, é que a técnica evita romper o tecido ao redor e aderente ao dispositivo implantado, de modo que o tecido de interface possa ser examinado intacto. Este método baseia-se em técnicas avançadas de imuno-histoquímica e microscopia e resulta em dados de microscopia confocal que descrevem em detalhes a região ao redor de um dispositivo implantado cerebral. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neuroprótese, como o grau em que a morte celular local, a formação de cicatrizes gliais e a reorganização dos vasos sanguíneos realmente afetam a vida útil dos dispositivos de microeletrodos implantados no cérebro.Embora este método possa fornecer informações sobre a interface neural crônica de matrizes de microeletrodos implantados no cérebro. As técnicas envolvidas neste método também podem ser aplicadas a outras áreas de pesquisa em neurociência, incluindo cânulas implantadas ou fibra óptica Em uma capela de exaustão, inicie o procedimento removendo cuidadosamente a pele e outros tecidos ao redor da calota craniana de acrílico, usando uma pinça e uma tesoura pequena enquanto usa as luvas insensíveis ao calor. Use um ferro soldado para produzir uma janela no acrílico amassado e exponha uma área de vedação rápida subjacente.O dispositivo deve estar visível envolto na vedação rápida transparente. Em seguida, sob um microscópio cirúrgico, corte o elastômero de silicone com uma microtesoura curva. Em seguida, remova pequenos pedaços de vedação rápida com uma pinça e uma microtesoura até a posição em que o dispositivo entra no cérebro.Continue cortando ao longo da superfície da craniotomia para separar os componentes do dispositivo que se ligam ao polissilício e ao crânio dos componentes implantados no cérebro. Tenha cuidado ao cortar os componentes expostos do dispositivo. Evite empurrar ou arrastar os implantes no tecido fixo.Em seguida, remova o osso ao redor da tampa da cabeça com cuidado usando as shes cruas depois disso. Use uma espátula para separar o cérebro com o dispositivo implantado do crânio. Agora coloque o cérebro em uma placa de Petri de vidro cheia de HBHS.Use o bloqueio cerebral e as lâminas de barbear para seccionar o cérebro e criar um plano plano que corresponda ao ângulo dos dispositivos implantados. Depois disso, pressione duas lâminas de barbear através do tecido cerebral expondo a superfície plana que será montada no Vibram. Em seguida, coloque um pouco de gelo sob a plataforma Vibram.Em seguida, seque brevemente a superfície do tecido em uma toalha de papel. Depois disso, oriente a amostra de forma que a dimensão mais ampla seja paralela à direção do movimento da lâmina de tom vibratório para ajudar a evitar que a lâmina derrube o tecido imediatamente, cole o plano plano no palco com super cola. Depois que a cola endurece um PBS resfriado para o prato de vibrato ao redor do tecido.Agora corte as fatias de tecido entre 250 a 500 mícrons usando a taxa máxima de vibração e uma taxa de progressão lenta da lâmina com um ângulo de lâmina de 10 graus da horizontal. Em seguida, colete as fatias cuidadosamente com um pincel e uma espátula e armazene um HBHS em uma placa de 24 poços a quatro graus Celsius enquanto coleta as fatias, mantenha um registro da espessura e localização de cada fatia à medida que são removidas para a placa de 24 poços. Assim que o dispositivo Insitu estiver visível, colete uma fatia de tecido com cerca de 500 mícrons de espessura.Para capturar o dispositivo em uma única fatia de tecido para coletar uma seção de tecido mais fina, fatias de 100 mícrons podem ser cuidadosamente coletadas para se aproximar do dispositivo. Nesse ponto, uma fatia com menos de 500 mícrons de espessura pode ser coletada com o dispositivo dentro. Comece o processamento de tecidos lavando as fatias três vezes a cinco minutos por lavagem em HBHS.Em seguida, incube-os em hidreto de borah de sódio por 15 minutos. Cada lado da fatia vire lentamente a fatia usando um pincel pequeno e evite tocar em qualquer área ao redor do dispositivo implantado. Uma micro colher de aço inoxidável ou revestida de Teflon também pode ser usada junto com o pincel pequeno.Agora lave as fatias três vezes a cinco minutos por lavagem em solução de lavagem em temperatura ambiente. Bloqueie-os em solução de lavagem por duas horas em temperatura ambiente enquanto vira as fatias. Após uma hora após duas horas, incubar as fatias em anticorpo primário durante cerca de 48 horas a quatro graus Celsius.Em seguida, execute seis lavagens rápidas de três minutos com solução de lavagem. Em seguida, execute seis lavagens de uma hora em solução de lavagem. Depois disso, incube-os em anticorpo secundário por aproximadamente 48 horas a quatro graus Celsius.Novamente, execute seis lavagens rápidas de três minutos, seguidas de seis lavagens de uma hora em solução de lavagem. Em seguida, remova a solução de lavagem e adicione a solução de limpeza de calcário U2 à base de glicerol. Cubra o prato com papel alumínio e guarde a quatro graus Celsius.Deixe as fatias grossas limparem aproximadamente uma semana ou seções de tecido muito grossas por duas a três semanas de quatro graus Celsius. Após a folga, monte as seções de tecido nas lâminas usando solução de limpeza como meio de montagem. Sele todas as lâminas com esmalte transparente e guarde-as a quatro graus Celsius de distância da luz, usando objetivas de microscópio de maior distância de trabalho.Comece a imagem com um microscópio confocal de varredura a laser ou um microscópio de dois fótons. Demonstraremos com um software de envio XS L SM seven 10 Carl Xi e um estágio de tradução XY controlado por computador para imagem Um panorama 3D ao redor de um implante para corrigir o índice de refração da solução de limpeza. Nesta demonstração, inserimos um valor de índice de refração de 1,4 no software do microscópio Leica Zen para a solução de limpeza U2.Essa configuração ajusta sutilmente os intervalos de passos Z para levar em conta a incompatibilidade do índice de refração no tecido próximo ao dispositivo. Avalie aproximadamente a janela do eixo Z apropriada e as configurações de coleta de dados na dimensão zdi para cada canal fluorescente usando baixa potência do laser, cerca de 0,5 a 5% e tamanhos de passo Z grandes. Em seguida, use o software de panorama Zen para definir a objetiva no centro XY do panorama eventual e para determinar o número de posições de coleta necessárias para os eixos x e y.Para cobrir sua região de interesse, reavalie e finalize a janela de coleta do eixo Z verificando rapidamente o primeiro e o último quadros da pilha. Em seguida, defina manualmente a sensibilidade do detector e a potência do laser para rampar adequadamente com o aumento da profundidade. O objetivo é normalmente manter aproximadamente a mesma intensidade de imagem, independentemente da profundidade da imagem na fatia de tecido, e também evitar alto ruído de fundo.Colete cada série de dados de imagem fluorescente, se necessário, para evitar sinais sobrepostos, execute linhas de laser sequencialmente. Altere as configurações do software para coletar os dados ou os dados de transmitância e use um laser de comprimento de onda mais penetrante e mais longo, como 6 a 33 nanômetros para capturar esses canais. Em seguida, determine a potência do laser apropriada e detecte uma sensibilidade para coleta de refletância e transmitância e repita a mesma série de coleta ao redor do dispositivo implantado.Por fim, exporte os dados para posterior quantificação e análise de processamento. A imagem através de ambos os lados da lâmina pode permitir que você avalie a interface em torno de um dispositivo, como mostrado aqui, onde a microglia ao longo do suporte de silício de um MEA é visível de um lado e a microglia ao longo dos locais dos eletrodos e traços são visíveis do outro lado. Uma vez que o tecido montado pode ser visualizado usando um estágio de tradução XY, as visões gerais dos rótulos fluorescentes em toda a fatia de tecido podem ser geradas na resolução desejada.Aqui, núcleos celulares corados com ganchos 3, 3, 3 4 2 e monócitos microglia marcados com 3 2 9. O Anti IBA foi fotografado simultaneamente em canais separados. A luz de transmissão e a refletância também foram coletadas mostrando a localização do implante de quatro semanas em relação aos ganchos e dados IVA um, a sobreposição de todos os canais, mas a transmissão é mostrada aqui.O exame detalhado da interface do tecido morfologicamente preservado em torno dos microdispositivos implantados pode ser coletado sob alta ampliação para análise da resposta local do tecido, a refletância e a transmitância permitem a localização do dispositivo, enquanto o anticorpo fluorescente ou os marcadores químicos permitem imagens detalhadas dos componentes do tecido ao longo da interface do tecido intacto. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de realmente dedicar um tempo à separação cuidadosa dos dispositivos implantados através da tampa da cabeça e planejar que essa etapa leve mais de 30 minutos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como coletar e processar fatias de cérebro contendo dispositivos implantados.Você também deve ser capaz de rotular e coletar dados histológicos que descrevem a neurobiologia em torno desses dispositivos.

intact-histological-characterization-brain-implanted-microdevices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Um método para implantar eletrodos no núcleo subtalâmico (STN) de ratos é descrito. A melhor localização do STN foi obtida usando um sistema de microregistro. Além disso, é apresentada uma configuração de estimulação caracterizada por conexões duradouras entre a cabeça do animal e o estimulador.

Microeletrodos guiada implantação de eletrodos no subtalâmica Núcleo de Ratos por longo prazo Estimulação Profunda do Cérebro

Mostramos que uma implantação de microeletrodos no córtex motor de ratos provoca déficits motor imediatos e duradouros. Os métodos propuseram neste documento contorno uma cirurgia de implante de microeletrodos e três roedores tarefas comportamentais para elucidar possíveis alterações na função motor fina ou bruta devido aos danos causados a implantação para o córtex motor.

Comportamentais de testes para avaliar déficits funcionais causados pela implantação de microeletrodos no córtex Motor rato roedor

Sondas de malha eletrônica perfeitamente integram e fornecem o nível estável, a longo prazo, single-neurônio gravação dentro do cérebro. Este protocolo usa malha eletrônica para na vivo experiências, envolvendo a fabricação de malha eletrônica, carregando em agulhas, injeção estereotáxica, interface de entrada/saída, experiências de gravação e histologia de tecido contendo malha sondas.

Malha de seringa injetável eletrônica para eletrofisiologia roedor crônica estável

Este artigo descreve um método simples para preparar pequenos cérebros de animais para a imagem latente de micro-CT, nas quais as lesões podem ser quantificadas e eletrodos localizados com elevada precisão no contexto do cérebro inteiro.

Um método de Micro-CT-baseado para caracterizar as lesões e localização de eletrodos nos cérebros de animais pequenos

Este protocolo demonstra as metodologias para um modelo do rato do ferimento de cérebro traumático do abrir-crânio e a transplantação de pilhas células-derivadas pluripotentes induzidas humanas cultivadas no local da lesão. Os testes comportamentais e histologic dos resultados destes procedimentos são descritos igualmente em breve.

Modelo de impacto cortical controlado da lesão cerebral do rato com transplantação terapêutica de células neurais pluripotentes induzidas humanas da pilha de haste

Mostramos que a gravura da nanoarquitetura em dispositivos de microeletrodo intracortical pode reduzir a resposta inflamatória e tem o potencial de melhorar as gravações eletrofisiológicas. Os métodos descritos aqui descrevem uma abordagem para gravar nano-arquiteturas na superfície de microeletrodos intracortical de silício de haste única não funcionais e funcionais.

Litografia de feixe de íons focada para etch nano-arquiteturas em microeletrodos

O presente protocolo descreve ferramentas para o manuseio de microeletroletos intracorticais planar de silício durante os tratamentos para modificação superficial via deposição de gás e reações de soluções aquosas. A montagem dos componentes utilizados para manusear os dispositivos durante todo o procedimento é explicada detalhadamente.

Ferramentas para tratamento superficial de microeletroletos intracorticais planar de silício

Este trabalho descreve o desenvolvimento de eletrodos interdigitalizados flexíveis para implementação em modelos de tumores cerebrais 3D, a saber, cultura in vitro , modelo in ovo e modelo murino in vivo. O método proposto pode ser utilizado para avaliar os efeitos de campos elétricos pulsados em tumores em diferentes níveis de complexidade.

Dispositivos eletrônicos orgânicos flexíveis para terapia de campo elétrico pulsado de glioblastoma

Este trabalho descreve um método para observação crônica in vivo da microglia em repouso no CA1 do hipocampo de camundongos usando cirurgia precisamente controlada e microscopia de dois fótons.

In vivo Imagem crônica de dois fótons da microglia no hipocampo de camundongos

Aqui, apresentamos um método para avaliação de desempenho e segurança a longo prazo de arranjos de eletrodos subdurais moles em um modelo minipig, descrevendo método cirúrgico e ferramentas, ressonância magnética pós-operatória, eletrofisiologia do córtex auditivo, propriedades eletroquímicas do implante e imunoquímica post-mortem.

Implante de arranjo de eletrocorticografia mole subdural (ECoG) e registro cortical de longa duração em miniporcos

Aqui, apresentamos um sistema de implante de sonda leve e econômico para eletrofisiologia crônica em roedores otimizado para facilidade de uso, recuperação de sonda, versatilidade experimental e compatibilidade com o comportamento.

O implante DREAM: um sistema de implante leve, modular e econômico para eletrofisiologia crônica em camundongos com cabeça fixa e comportamento livre

Aprenda a caracterizar histologicamente microdispositivos implantados no cérebro de roedores preservando o tecido circundante intacto. Esta técnica avançada utiliza imunohistoquímica e microscopia confocal para analisar respostas biológicas em nível subcelular.

Caracterização histológica intacta de Microdevices Brain-implantados e tecido circundante

Explorar mais vídeos