Em tempo real, análises de Transporte Retinol pelo receptor de membrana da proteína de Retinol Binding

Este protocolo mostra a produção de proteína de ligação ao retinol plasmático de alta qualidade que é usada para estudar as atividades do receptor da proteína de ligação ao retinol em tempo real. Isso é conseguido primeiro expressando e purificando uma grande quantidade de proteína de ligação ao retinol das bactérias. A proteína de ligação ao retinol purificada é completamente desnaturada e lentamente redobrada na presença de seu ligante retinol.

Em seguida, a proteína de ligação ao retinol corretamente redobrada é purificada usando HPLC para remover proteínas dobradas incorretamente e contaminantes bacterianos. Uma vez obtida a proteína de ligação ao retinol de alta qualidade, ela pode ser usada para estudar as atividades de seu receptor de membrana na catalisação da liberação de retinol, carga de retinol ou transporte de retinol para a proteína de ligação ao retinol celular um. Em tempo real.

Hoje vou demonstrar nosso protocolo aprimorado para reformar e purificar as bactérias produtoras de proteínas de ligação à retina. Essa técnica pode produzir proteína de ligação retiniana de alta qualidade, essencial para ensaios funcionais. Demonstrarei as técnicas recém-desenvolvidas para estudar o receptor da proteína de ligação à retina.

A principal vantagem dessas técnicas sobre os métodos existentes, como técnicas baseadas em radioatividade ou HPRC, é que elas permitem monitorar o progresso de várias reações em tempo real. A parte mais difícil desse procedimento é a retenção de RVP, que pode determinar a qualidade e o rendimento do RVP. Se a proteína não for produzida corretamente, a preparação de RVP resultante não pode ser usada para ácidos funcionais.

Aqui apresentamos algumas melhorias que desenvolvemos ao longo dos anos que garantirão o sucesso. Comece este protocolo com os corpos de inclusão insolúveis de uma cultura de 40 mililitros de BL 21 e coli na qual a proteína RBP humana com uma etiqueta seis x his adiciona 10 mililitros de cloridrato de 7,5 molares aos corpos de inclusão e sonicate. Em seguida, adicione cinco mililitros de 25 milimolares triss pH nove e 75 microlitros de 10 milimolares DTT e gire durante a noite.

No dia seguinte, centrifugue a 18 G por 20 minutos a quatro graus Celsius para remover as proteínas insolúveis. Após a centrifugação, transfira o sobrenadante para um novo tubo e coloque-o no gelo. Em seguida, prepare o tampão de redobragem no gelo, conforme descrito no texto que acompanha.

Em seguida, apague as luzes da sala para trabalhar sob uma luz vermelha fraca enquanto mistura vigorosamente a solução de proteína em um béquer no gelo. Como alternativa, adicione 10 microlitros de solução de retinol para cada mililitro de tampão de redobramento para um total de 600 microlitros de solução de retinol e 60 mililitros de tampão de redobramento. Em seguida, continue mexendo por cinco horas no escuro após outra centrifugação.

Concentre o sobrenadante em cerca de 10 mililitros usando Anacon Ultra 15. Após concentração, diluir a amostra até 100 ml. Usando PBS frio.

É importante remover qualquer precipitado neste ponto. Em seguida, purificar o RBP redobrado em resina NTA de níquel eluir em ole de 100 milimolares em PBS. Concentrar o EIT utilizando um concentrador com um limite de 10 kilodalton de peso molecular para o volume de um quinto a um décimo do volume original.

Em seguida, diluir de cinco a 10 vezes com tris mais cloreto de sódio e repetir a etapa de concentração após concentrar a proteína. Transfira-o para um tubo de microcentrífuga de 1,5 milímetro imediatamente antes da execução da HPLC para limpar a centrífuga de amostras a 16.000 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, purificar a RBP oca em HPLC usando uma coluna de troca iônica por um gradiente de etapa de cloreto de sódio de 220 milimolares por 12 minutos.

360 milimolares por 15 minutos e 1000 milimolares por 15 minutos. Usando 25 milimolares triss pH 8,0 como fase móvel a um mililitro por minuto. À medida que a concentração de cloreto de sódio aumenta, o RBP de chiado oco é liberado.

Enquanto APO RBP e RBP mal dobrado permanecem vinculados à coluna. Se o RBP Refolding não for feito de maneira ideal, o RBP mal dobrado pode dominar toda a preparação. Monitore cuidadosamente o perfil de eluição de RBP sibilante corretamente dobrado e mal dobrado a 1000 milimolares de cloreto de sódio.

A maior parte do RBP sibilante mal dobrado deve ser liberada. Recuperar o RBP oco correctamente dobrado das fracções de pico a 360 milimolares de cloreto de sódio. Em seguida, agrupar as fracções contendo RBP num tubo cónico de 15 mililitros sobre gelo.

Em seguida, use o concentrador de corte de peso molecular de 10 kilodalton para concentrar depois que o volume for reduzido em cinco a 10 vezes. Adicione PBS para diluir a amostra e concentre novamente no dia seguinte. Use um espectrofotômetro para determinar o rendimento e a qualidade finais, conforme mostrado aqui.

O produto dobrado corretamente deve ter uma proporção de 330 nanômetros a 280 nanômetros. Perto de uma proteína dobrada incorretamente terá uma proporção menor que um para produzir A-O-R-B-P. Adicionar um volume igual de heptano ao RBP oco purificado e misturar suavemente, rodando durante a noite a quatro graus Celsius, centrifugar a 16 000 g durante 10 minutos a quatro graus Celsius.

Após a centrifugação, a fase orgânica superior e a fase aquosa inferior são separadas por uma camada branca. A camada branca é desnaturada APO RBP. Para recuperar a fase aquosa, traga a ponta de uma agulha de seringa de 500 microlitros até o fundo do tubo e aspire cuidadosamente a solução.

Evite o material branco na interface e transfira a solução para um novo tubo. Adicione heptano novamente e repita o processo de extração três vezes com uma rotação de três horas a quatro graus Celsius para cada após a última extração, verifique a absorção em um espectrofotômetro NanoDrop para certificar-se de que o pico de 330 nanômetros diminuiu para o nível de fundo. STR RRA seis catalisado.

A liberação de retinol e a carga de retinol podem ser monitoradas em tempo real monitorando a fluorescência do retinol quando o retinol está ligado, há um aumento na fluorescência a 460 nanômetros quando o retinol é liberado. Há uma diminuição na fluorescência a ser realizada Este ensaio começa adicionando 200 microlitros de caseína bloqueadora a cada poço de uma placa preta de 96 poços micro Fluor duas incubadas durante a noite a quatro graus Celsius para evitar a aderência não específica de RBP oco ao plástico. No dia seguinte, lave os poços revestidos da microflora duas placas uma vez com 200 microlitros de PBS.

Então, depois de aspirar, o PBS resfria a placa no gelo. Adicione 100 microlitros de PBS às membranas recém-preparadas de um a 5 milhões de células que expressam T RRA seis ou células de controle e passe as membranas por uma seringa Hamilton do tipo gás número 1710 seis vezes para produzir uma suspensão uniforme. Em seguida, dilua a suspensão da membrana para um mililitro usando PBS.

Adicione 50 microlitros da suspensão de membrana a cada poço e, em seguida, coloque a placa de volta no gelo. Aqui. O monitoramento em tempo real da fluorescência do retinol é medido usando a óptica de fluorescência da estrela polar ômega. Configure o instrumento conforme descrito no texto que acompanha com um filtro de excitação de 320 e o filtro de emissão de 460 traço 10.

Usando este instrumento, execute um ensaio de liberação de retinol no qual, após uma leitura de fundo, o RBP oco é adicionado e as leituras são feitas a cada 10 minutos por uma a três horas. Em seguida, execute um ensaio de carga de retinol no qual todo o retinol trans é adicionado à placa. Sob luz vermelha fraca, a placa é lida uma vez e, em seguida, A-O-R-B-P é adicionado.

A reação é então monitorada continuamente a cada cinco a 10 minutos por uma a três horas após todas as medições terem sido feitas. Os dados brutos serão mostrados no software de análise de dados Omega. Transfira os dados brutos para o Microsoft Excel.

Para análise de dados, o retinol EGFP é uma transferência de ressonância de fluorescência ou par de trastes em que o retinol serve como doador e o EGFP serve como aceptor. O transporte de retinol catalisado por S stra six do R BP oco para o EEG FP crbp um é monitorado em tempo real medindo o traste do retinol EEG FP antes de realizar o monitoramento em tempo real do EEG FP crbp uma proteína de fusão com seis x hiss tag E GFP crbp um é produzido em células de mamíferos purificadas em resina NTA de níquel e armazenadas em PBS com inibidores de protease por um curto período a quatro graus Celsius ou a menos 80 graus Celsius por períodos mais longos. Prepare uma microflora bloqueada, duas placas e membranas, conforme descrito na seção anterior deste vídeo, e adicione 50 microlitros de suspensão de membrana.

Como antes. Defina a estrela polar ômega com as mesmas configurações de antes com um filtro de emissão adicional de 510 a 10 e óptica de fluorescência de emissão dupla simultânea neste ensaio. EG FP crbp uma a uma concentração final micromolar é adicionada a cada poço para iniciar a reação e uma leitura de fundo é feita.

Em seguida, um milimolar de RBP oco é adicionado e as medições são feitas a cada cinco a 10 minutos por uma a duas horas após todas as medições terem sido feitas. Baixe os dados brutos como antes. O traste do retinol EGFP é calculado pela mudança dinâmica na proporção entre os picos de emissão do aceptor e do doador.

A equação para calcular essa proporção é mostrada aqui, onde 510 T, 510 B, 460 T e 460 B representam emissões a 510 nanômetros após o início da reação a 510 nanômetros antes de um retinol ou RBP oco ser adicionado a 460 nanômetros após o início da reação adicionado 460 nanômetros antes de retinol ou RBP oco ser adicionado, respectivamente. Para estudar as atividades catalíticas do receptor RBP STRA seis, RBP de alta qualidade é produzido e purificado e, em seguida, usado para monitorar as reações catalisadas por stra seis em tempo real. Esta figura mostra um aumento dramático dependente do tempo da fluorescência do retinol nas reações contendo TA, seis retinol e A-O-R-B-P.

Há pouco aumento na fluorescência do retinol nas reações sem TA seis. Este experimento demonstra a carga de retinol catalisada por stra six em APO R bp quando o transporte de retinol catalisado por stra de R BP oco para EEG FP crbp um foi avaliado. Houve um aumento dependente do tempo no retinol EEG FP fret nas reações contendo TA seis.

Isso sugere que o stra six acelera muito o transporte de retinol do R BP oco para o EEG FP crbp um. Ao usar bactérias produzidas por IBP, é importante lembrar que a PIV de alta qualidade é essencial para o ácido funcional envolvido na PIB, e é importante confirmar o resultado obtido a partir de bactérias RBP usando RVP nativo do soro. Uma vez que o RVP de alta qualidade esteja disponível, ele pode ser usado para estudar a função do receptor RBP em tempo real usando a técnica que acabei de descrever.

Essas técnicas são complementares aos ensaios clássicos, realmente baseados em atividades ou HPRC.