Lapso de tempo de imagem de pré-neoplásicas primárias células epiteliais mamárias derivados de modelos de rato geneticamente modificado do cancro da mama

O objetivo geral do experimento a seguir é determinar se as lesões genéticas predispostas ao câncer de mama alteram o comportamento das células de memória plástica pineal em cultura primária. Isso é conseguido isolando células epiteliais mamárias primárias de camundongos geneticamente modificados. Como segunda etapa, a imagem de lapso de tempo de células vivas é realizada ao longo de cinco a sete dias, criando um filme para analisar o comportamento celular.

Em seguida, um programa de software que rastreia células individuais é utilizado para quantificar e comparar o comportamento de células isoladas de diferentes modelos de câncer de mama em camundongos geneticamente modificados. Os resultados mostram que lesões genéticas específicas induzem diferentes comportamentos na memória pré-neoplásica. Células epiteliais baseadas em análises comportamentais quantitativas realizadas usando rastreamento de célula única.

Embora este método possa fornecer informações sobre como diferentes lesões genéticas alteram o comportamento das células epiteliais mamárias pré-neoplásicas. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como pré-neoplásicos, células de outros órgãos, células cancerígenas de qualquer órgão, incluindo o estudo de possíveis alterações comportamentais induzidas pela terapia, bem como comparações do comportamento das células estromais de tecidos normais e cancerosos demonstrando o procedimento. Hoje estarão a Dra. Priscilla Firth, autora sênior desta publicação, e Pete Johnson, gerente do Centro de Recursos Compartilhados de Microscopia e Imagem do Centro de Pesquisa do Câncer Lombardi da Universidade de Georgetown.

Eutanásia de um camundongo e prossiga imediatamente com a necropsia. Coloque o camundongo em decúbito dorsal em uma plataforma de necropsia de isopor e prenda todos os quatro membros para que a pele ventral fique esticada. Sature a pele ventral e o cabelo, incluindo a pele dos membros com etanol a 70%.

Exponha as glândulas mamárias número dois e três e número quatro e cinco com uma incisão na linha média através da pele. Estenda a incisão com duas incisões em Y através da pele medial dos quatro membros. Tenha cuidado para não entrar no peritônio usando uma dissecção romba.

Separe a pele do peritônio subjacente. Puxe para trás em ambos os lados da pele até que esteja esticada e prenda-a na plataforma começando pelo lado externo. Use a tesoura para fazer uma dissecção romba que isola as glândulas mamárias inal e/ou torácica intactas do tecido conjuntivo e do músculo subjacentes.

Coloque uma ou duas glândulas mamárias em uma placa de Petri de 10 centímetros e passe para uma capa de cultura de tecidos. Agora, examine as glândulas em busca de gânglios linfáticos mamários. Nódulos pequenos e bem circunscritos com cor amarelada.

Usando um bisturi e uma pinça, remova-os da glândula circundante. Pique o tecido mamário em cubos milimétricos usando dois bisturis. Colocar o tecido mamário picado num tubo cónico de 50 mililitros com cinco mililitros de meios de dissociação.

Misture com tação suave e incube durante a noite. Mantenha a tampa solta no dia seguinte. Isole e cultive as células epiteliais primárias.

Imediatamente após o revestimento das células. Posicione a placa de seis poços com segurança em um microscópio stage dentro de uma câmara de incubação. Deixe a placa equilibrar por no mínimo 15 minutos.

Ajuste o condensador para iluminação Kohler e centralize os anéis de fase. Abra o software de aquisição de imagens, como o Velocity, crie e nomeie uma biblioteca para as imagens com lapso de tempo e salve em um local com espaço suficiente para arquivos grandes. Abaixe as lentes para evitar interferência da lente de palco.

Sob o título do estágio, selecione calibrar estágio readquira o conjunto de plano focal Z igual a zero na guia X, Y, Z. E marque os pontos de imagem selecionando adicionar ponto sob o palco. Heading coloca pontos de imagem no meio de cada poço.

A imagem de contraste de fase pode ser distorcida perto da periferia dos poços de plástico. Organize os pontos em um quadrado em quatro por quatro campos, cada um com uma sobreposição de aproximadamente 5%. Salve os pontos selecionados no estágio.

Em estágio, selecione criar mapa de foco e siga o prompt para definir o foco de cada ponto. Em seguida, defina o tempo de aquisição da imagem para capturar o número certo de fotos por hora. Agora salve o mapa de foco no palco.

Prossiga clicando com o botão direito do mouse na barra de ferramentas do lado direito. Em seguida, salve as configurações de imagem. Pressione o botão de gravação para iniciar o processo de imagem após uma hora, verifique o foco das imagens para ver se algum ajuste é necessário.

Monitore e continue a imagem ao vivo por cinco dias quando as células se tornarem confluentes. É fundamental monitorar as imagens digitais adquiridas e ajustar o mapa de foco com frequência durante as primeiras 24 horas, pois as células serão conectadas à placa pelo menos duas vezes ao dia. Verifique se as células estão em foco e se as culturas não estão contaminadas.

Para determinar o mecanismo de formação inicial da colônia, comece com uma única pilha de imagens representando um local de imagem na placa. Nos quadros iniciais, as células serão flutuantes, as células epiteliais e de fibroblastos podem ser distinguidas pela morfologia celular. As células epiteliais têm uma forma cuboidal e formam colônias de células.

Os fibroblastos, um tipo de célula estromal, têm uma morfologia alongada. Siga as imagens seriais para determinar quando a primeira célula epitelial adere à placa. Nesta etapa, as células epiteliais podem ser identificadas e diferenciadas dos fibroblastos por sua morfologia mais cuboidal.

Acompanhe esta única célula epitelial através de imagens seriadas e acompanhe seu destino nas 24 horas subsequentes. Observe que, se a célula ficar cercada por células epiteliais adicionais, sofrer divisão celular ou apoptose Se cercada por células epiteliais, o mecanismo de formação de colônias pode ser determinado a partir da agregação do ambiente ou da divisão celular. Registre o número de colônias formadas por agregação celular versus divisão celular durante as primeiras 24 horas para determinar o número de células inicialmente aderentes que sofrem apoptose durante um período de tempo específico.

Siga as imagens seriadas para o aparecimento de características clássicas de apoptose que se desenvolvem em uma célula que tem sido aderente ao longo do tempo. As células epiteliais em cultura alteram sua morfologia de uma forma cuboidal inicial para uma aparência mais alongada. Consistente com EMT.

Siga as imagens seriais para determinar o dia e a hora após o revestimento Quando isso ocorrer, comece iniciando o programa TTT. Selecione as iniciais do usuário e clique em continuar. Pressione definir NAS, selecione a pasta de exportação TTT criada pelo usuário e clique em OK.

No navegador, selecione uma pasta de experimento. Selecione uma pasta de posição e pressione o botão de posição de carga. Envie o fator ocular para 10 vezes.

Carregue o número de imagens necessárias, que normalmente são todas as imagens. Ao usar esta análise. Pela primeira vez na janela do editor de células, selecione nova colônia no menu de arquivo na janela do filme.

Pressione o botão da célula de rastreamento ou pressione F dois. Para começar a rastrear uma célula. Identifique uma célula na janela do filme e coloque o cursor sobre a célula.

Um círculo com o número da célula deve aparecer depois que F dois for clicado. Use a tecla zero no teclado numérico para rastrear o posicionamento da célula e avançar para a próxima imagem. Mova o cursor para acompanhar o posicionamento de cada célula em cada quadro.

Para excluir uma trilha e retornar à imagem anterior, pressione delete no teclado numérico para avançar os quadros sem rastrear a célula, pressione três. E para retroceder sem rastrear, pressione um. Para marcar uma divisão celular na janela do filme, clique no botão de divisão para marcar a morte celular na janela do filme, clique em morte celular.

Uma vez que uma divisão tenha ocorrido, as células-filhas podem ser rastreadas no mesmo mapa de destino celular. Para fazer isso, vá para a janela do editor de células e clique com o botão direito do mouse no símbolo do círculo da célula dotter designada. Isso inicia o modo de rastreamento automaticamente, agora pressione F 10 para salvar a árvore.

Cada árvore será salva na pasta de saída designada. Para iniciar um novo mapa de sulfato na janela do editor de células, selecione o menu aberto, clique em arquivo e clique em. Novas células de colônia eram arredondadas e flutuantes no início da imagem.

As barras de tamanho equivalem a 200 mícrons Após a fixação na placa, elas se tornaram planas e demonstraram uma aparência do tipo cuboidal. Aos quatro dias de cultivo, a maioria das células epiteliais se alongou em uma morfologia semelhante à EMT. Essa mudança ocorreu com a mesma cronologia em todos os genótipos estudados, as células flutuantes se desenvolveram em colônias de células epiteliais individuais definidas.

24 horas após o plaqueamento, a análise de imagens seriadas revelou que essas colônias foram geradas por agregação celular e não por divisão celular. Embora a interrupção do BRCA por si só não altere o número de colônias formadas. A adição da insuficiência haplo TP 53 reduziu significativamente o número de colônias formadas.

Da mesma forma, a adição de ER alfa sobre a expressão aumentou significativamente o número de colônias formadas após este procedimento. Outros métodos que empregam o uso de imagens de lapso de tempo combinadas com rastreamento de célula única podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como abordagens terapêuticas específicas ou lesões genéticas adicionais alteram o comportamento celular e podem influenciar a resposta terapêutica ou a progressão do câncer.