糖尿病研究におけるβ細胞の質量分布のアセスメント用の赤外線光学投影断層近く

この手順の全体的な目標は、げっ歯類、膵臓、またはアイレット移植片を抱く組織におけるベータ細胞の質量分布の光学投影断層撮影に基づく評価を実行することです。これにより、近赤外スペクトルを使用して、より大きな標本の研究を可能にし、相互作用する細胞タイプまたは隣接する細胞タイプを同時に視覚化することができます。これは、機器、近赤外線感度カメラを備えたOPTスキャナー、高出力光源、および適切なフィルターセットによって実現されます。

検体はまず単離され、固定され、ホルモン免疫染色されてから、arosに埋め込まれ、光学的にクリアされます。その後、カスタムメイドのサンプルホルダーに取り付けられます。半自動ポジショニングツールを利用して、スキャン後のスキャナーの正しいセンタリングを確保します。

投影画像は、必要に応じて機械的なセットアップによって導入されたアーティファクトを補正するための後処理です。イコライゼーションアルゴリズムは、低強度の物体の検出を改善するために利用されます。最後に、セグメンテーション、視覚化、および定量化は、画像処理ソフトウェアを使用して実行されます。

インスリン産生ベータ細胞は、血糖止血を維持する上で極めて重要な役割を果たします。したがって、膵臓ベータ細胞の質量分布の空間的および定量的評価は、糖尿病研究の多くの分野で重要です。このビデオプロトコルでは、近赤外範囲でのイメージングを可能にし、それによって膵臓組織のより大きな体をイメージングする可能性を可能にする光反応断層撮影法またはOPTの適応について説明します。

また、1つの標本でより幅広い種類の細胞を研究することができます。さらに、一般的な膵臓イメージング、およびB細胞量の評価に最適化されたOPTを開発した計算ツールの編集を紹介します。特に、近赤外線スペクトルは、組織内の光浸透率にとって最も好ましい窓です。

O PTイメージングのスペクトルのこの部分にアクセスするために、ベータ細胞質量の単一SH評価のために、シャープな同僚によって記述された元のOPTスキャナーにいくつかの変更が加えられました。マウスの膵臓では、Omic 3001スキャンを日常的に使用しています。励起光は、約650ナノメートルの波長で水銀アークランプよりも高い励起エネルギーを提供する金属ハアランプによって印加されます。

光は、励起フィルターを通過する前に、液体ライトガイドを介して伝達されます。このプロトコールで使用したフィルターを、チャネル分離抗体を評価するためにこの表に示します。異なるAlexaフロア染料と結合し、タンパク質ビーズに固定化し、アグロスファントムの別々の平面に埋め込みました。

この画像は、異なるチャネル間でブリードスルーがないことを示しています。放出された光は、近赤外スペクトルで高い量子効率を持つ裏面照射型CCDカメラで検出されます。より大きなサンプルのイメージングを容易にするために、より大きなリフレクターミラーとveteをスキャナーに組み込むことで視野が広がります。

veteの上に見えるセットアップは、スキャン中にサンプルを回転させるステッピングモーターです。ラボUベースのプログラムは、スキャン中にカメラとステッピングモーターを制御し、膵臓と氷冷PBSを収穫してプロトン性の劣化を防ぎます。染色やスキャンの手順を妨げる可能性のある周囲の脂肪や膜を慎重に取り除きます。

サンプルを摂氏4度の4%PFAに2〜3時間固定します。膵臓が折りたたまれた形で安定するのを避けるために、全マウント免疫染色の前に固定中にペトリ皿にスプレーし、過剰なPBSで膵臓を洗浄します。染色手順は、ベータ細胞の質量分布の評価のために以前に説明されています。

私たちは、腎臓ブタ、抗インスリン、一次抗体、および染色のAlexa Fluor標識二次抗体の組み合わせに日常的に依存しています。3つの主要な膵臓葉を分離します。これにより、ローブの比較評価が容易になり、より高い倍率でのスキャンが可能になります。

膵臓を水ですすぎ、アグロスに浸します。気泡を取り除きます。膵臓を1.5%の低融点、アグロスに埋め込み、落ち着くまで目を保ちます。

アグロスブロッキングをカットし、膵臓を閉じます。サンプルとアグロの基部との間に約1センチメートルのスペーサーを空けてください。スペーサーは、試料をサンプルホルダーに固定するために必要です。

Bクリアリング溶液(Maurice.Clearとも呼ばれる)で光学クリアリングを行う前に、膵臓を100%メタノールで脱水します。サンプルが透明になるまでクリアします。Bはほとんどのプラスチックをisolので、ガラス瓶をお勧めします。

B溶液を数回交換して、メタノールの痕跡をすべて取り除きます。これで、サンプルをスキャンする準備が整いました。スキャン中、サンプルはステッププロモーターに取り付けられた磁石によって運ばれます。

これにより、サンプルをそのX軸と設定軸に沿ってスライドさせることができ、スキャン前のサンプルの位置合わせが容易になります。ほとんどのOPTプロトコルでは、ROブロックはサンプルホルダーに接着されますが、ほとんどの手がかりはバルブを溶解するため、サンプルが望ましくない動きをする可能性があります。そこで、ビューの使用を省略したホルダーが設計されました。

透明なサンプルをホルダーに置き、ホルダーフランジのプレドリル穴にガイドされた2本の針をそっと挿入してサンプルを固定します。サンプルをスキャナーに入れ、BAB溶液に浸します。ここに示されているのは、カメラの露光時間、ステッププロモーターを制御し、倍率などのログファイルパラメータに実験パラメータを入力するために使用されるラボビューベースのソフトウェアのグラフィカルユーザーインターフェースです。

焦点の調整とフィルターセットの交換は、顕微鏡上で手動で行われます。倍率を選択して停止します。GFPフィルターを使用してサンプルを照らし、ラボ用ソフトウェアを使用してプレビュー画像を表示します。

一連の膵臓を比較するときは、標本を回転させて最も幅の広い部分を見つけます 注、すべての標本に同じ倍率を使用します。この係数は、シリーズ内の大きい方のサンプルに基づいて設定されます。次に、特定の信号を表示するフィルターセットに変更し、ピントを調整します。

露光時間は、試料のどの部分も飽和させることなく、可能な限り最高のS/N比で選択する必要があることに注意してください。膵臓ベータ細胞の質量の評価では、標本全体は通常、関心領域であるため、最適な結果を得るためには、サンプルの重心をその回転軸に正確に配置する必要があります。カンマアルゴリズムは、サンプルの重心を計算し、回転軸に重心を位置合わせするための参照画像を提供します。

X座標を計算するには、まずGFPチャネルの0度でのスナップショットを取得します。次に、フィルターを切り替えて、同じ位置にある特定の信号のスナップショットを取得します。次に、GFP画像に期待値最大化アルゴリズムを適用して、関心領域をしきい値にし、しきい値に重心計算を適用し、特定の信号の画像上で見つかった重心点を通る垂直線を重ね合わせます。

これらのステップは、90 度回転したサンプルに対して繰り返され、Z 座標が計算されます。最後に、重心点を描写する取得した画像を基準として使用して、視野の中心線がサンプルの見つかった重心点を通過するようにサンプルを移動しました。スキャンが完了すると、ポストアライメント値が投影に割り当てられ、再構築前に回転軸に沿った画像の位置が微調整されます。

しかし、カメラの光軸に対する角度のわずかな収差は、再構築時に幾何学的な歪みを引き起こす可能性があります。このような歪みを避けるために、目立たない自由な変換ベースのアライメントでは、試料をスキャンした後にFDAが使用されます。データセットから 2 つの予測が取得され、FDA が計算されます。

これらの投影は、F は 0 度の特定の信号、G は 180 度の特定の信号です。DFT機能を使用して、2つの投影から画像全体に8ピクセルの高さブロックを登録し、測定値をX軸に沿ってシフトして必要な回転角度を計算し、同じパラメータを再利用して同じスキャンで取得したすべてのチャネルを修正します。アルゴリズムCOMMARとFTAの基盤に関する詳細な洞察は、AL To facilitate iLetセグメンテーションにあります。

コントラスト制限された適応ヒストグラム均等化クローが投影画像に適用されます。このプロトコルでは、マットの組み込み関数である adapt hiss egg を使用し、デフォルトのクリップ制限 0.01 と 256 のライトで適用しました。ただし、最適なタイヤサイズは経験的にテストする必要があり、分析された検体によって異なる場合があり、アルゴリズムの詳細と例は家庭用血液と影で見つけることができます。

追加時。アライメント補正され、正規化されたデータは、断層切片に再構築できるようになりました。取得した仮想セクションのスタックを視覚化および定量化するには、Sやvelocityなどの適切な画像処理ソフトウェアを使用して3D ISOサーフェスを生成します。

この図は、Alexa Fluor 4 88、5 94、6 80、seven 50 などの蛍光色素標識二次抗体のカクテルを使用してインスリン用に染色された膵臓葉の 1 つの投影図を示しています。信号とNoの比率は、スペクトルの近赤外部分に近づくにつれて劇的に増加します。このグラフでは、スペクトルのより広範な部分にアクセスすることにより、各信号チャネルの平均信号対雑音比を示しています。

近傍OPTイメージングにより、1つの標本で分析できる細胞の種類の範囲が広がります。このビデオは、1型糖尿病の非肥満糖尿病モデルからの膵臓を示しています。ビデオでは、ランゲルハンスのインスリン産生坐骨は、血管を発現するアルファアクチンが赤く、CDの3つがTリンパ球に浸潤しているとラベル付けされています。

灰色の緑色テアクリン実質は、近赤外域の組織への生命浸透度の増加を利用して、内因性組織自家蛍光に基づいて再構築されます。O PTイメージングにより、以前よりもはるかに大きな標本のベータ細胞質量分布の評価が可能になります。この図は、ERI six 80を二次抗体として使用して、インスリンを標識したSER脂肪ラットの脾葉のアイレット分布のISO表面再構成を示しています。

正確な参照のために、マウスの脾臓の球体が示されています。これらの画像は、個々の膵臓球内のベータ細胞の質量分布の2つの異なる等値面再構成に対応しており、酸は爪処理なしで緑色で表示され、アルゴリズムが適用された場合は赤色で現れます。2つの再構成を重ね合わせることで、clawが低信号強度のアイレットでもセグメンテーションを容易にすることが実証されています。

これらは、オーバーレイ画像でのみ赤で表示されます。私たちはちょうどあなたに示しました どのように 取ります 抽出 ベータ細胞塊の空間的および定量的情報 ニューロン膵臓の体積全体 そして ランゲルハンスの個々のアイレットのレベルまで。これらのプロトコルは、ベータ細胞やほぼ障害のあるOPTの膵臓の評価に限定されず、提示された計算ツールは他の研究領域に変換できるはずです。

がんばって。あなたの実験に頑張ってください。