Name: 액포와 세포질의 pH 측정 생체 내 효모 세포 현탁액의 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 55 s
Description: 배우세요 효모 세포의 액포와 세포질 pH 측정 방법을 BCECF-AM 및 pH 민감성 GFP를 사용하여. 이 기법은 생체 내 pH 역학을 연구하고 세포 반응 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

이 작품은 PM 케인에 NIH R01 GM50322에 의해 지원되었다. 저자는 우리의 실험실에 대한 이러한 프로토콜을 작업에 박사 Rajini 라오, 효모 pHluorin 플라스미드를 제공하고 비례 pH 측정에 대한 조언 존스 홉킨스 대학 박사 글로리아 A. 마르티네즈 무 노즈 감사합니다.

1. BCECF-AM을 사용하여 생체 내에서 액포의 pH 측정 <ol><li> 밤새 원하는 매체에 측정 할 효모 균주의 50 ML 액체 문화를 성장. 목표는 (OD600 (600 nm에서 흡광도) 서스펜션 약 0.8 측정) 중반 로그 단계에서 세포를 가지고있다. </li><li> 원심 분리하여 펠렛 효모 세포. 성장 매체 이전에 무게 된 microcentrifuge 관에 전송 0.6 ㎖에 펠렛을 resuspend을. 60 초 동안 2,000 XG에서의 microcentrifuge에 다시 펠렛은 세포. 가능한 완벽하게 뜨는을 제거하고 세포 펠렛을 무게. 0.5 g / ㎖ (W / V)의 최종 농도에 펠렛을 resuspend을,이 볼륨의 문화는 약 200 밀리그램의 세포 펠렛 및 버퍼 200 μl를 제공합니다 400 μL의 최종 볼륨을 제공하기 위해 추가됩니다. </li><li> DMSO에 준비 12 밀리미터 주식에서 50 mm의 최종 농도에서 세포 현탁액에 BCECF-AM 추가 할 수 있습니다. 후 잘 입고 혼합30 분 동안 30 ° C에서 세포를 ubate. 흔들 플랫폼 또는 롤러 드럼. </li><li> 세포가 배양되는 동안, 보정 버퍼를 준비합니다. 50 MM의 HEPES (4 - (2 - 히드 록시 에틸)-1-piperazineethanesulfonic 산), 50 mM의 KCl을 50 mM의 NaCl을 0.2 M 암모늄 아세테이트, - 보정 버퍼는 50 mM의 MES를 ((N-모르) 에탄 산 2) 포함 10 MM 나트륨 아 지드, 10 MM 2-deoxyglucose 및 산도로 조절은 수산화 나트륨이나 염산의 보정 범위에 해당하는 값입니다. (주의 : 아 지드 화 나트륨은 매우 독성 및 취급에주의해야합니다.) 야생 형 세포에서의 pH 측정을 위해, 우리는 (6.5,하지만 더 많은 알칼리성 액포 산도가 예상 돌연변이에 대한 pH가 5.5에 여러 보정 혼합물을 준비 할 VMA 돌연변이), 우리는 추가, 높은 산도 버퍼를 준비합니다. </li><li> 나누어지는 2 15 ML 원뿔 튜브에 각각의 산도에 대한 보정 버퍼의 ML, 최종 110 μM의 모 넨신의 농도가 15 μM nigericin, R을 제공하는 모 넨신 (15 밀리미터 주)와 nigericin (2 MM의 주식을)를 추가espectively. 와류 믹서에 잘 섞는다. (주의 : 모 넨신 및 nigericin 모두가 독성 및주의하여 취급해야합니다.) </li><li> 의 microcentrifuge에서 2,000 XG에서 30 초 동안 원심 분리하여 BCECF-AM의 배양 시간이 완료되면 펠렛 세포 현탁액. 세포를 resuspend을 위와 포도당과 원심 분리기 부족한 성장 매체 1 ML입니다. 일단이 세척 단계를 반복 한 다음 포도당없이 성장 배지 200 μL에 펠렛을 resuspend을. 얼음에 위치. </li><li> 위의 준비 각 pH 보정 튜브에 세포 현탁액의 20 μl를 추가합니다. 30-60 분 동안 30 ° C에서 알을 품다. 롤러 드럼. </li><li> 교대 여기 파장 450 nm의 490 nm의 535 nm의에서 방출 파장에서 모두 측정 할 수 fluorimeter을 설정합니다. 30 ° C.에 샘플 챔버의 온도를 설정 큐벳의 혼합물의 연속 교반 모든 측정을 수행합니다. </li><li> 1 mM의 MES의 1.96 ML을 (세포의 성장 배지의 pH에​​ 따라 pH가 5 ~ 7로 조정 추가차 실험 설계). 큐벳에 세포 현탁액의 20 μl를 추가합니다. 형광 측정을 시작합니다. 우리는 지속적인 운동과 다른 실험 시간 포인트 데이터를 모두 수집합니다. 지속적인 운동 데이터의 경우, 우리는 5 분 동안 매 6 초 측정을 수행 한 후 50 mm의 최종 포도당 농도 포도당을 추가하고 5-10 분 동안 측정을 계속합니다. 단일 시간 지점 측정을 위해, 우리는 일반적으로 1에서 측정을 수행하고 5 분. 큐벳에 세포의 추가 후, 운동 측정에서와 같이 포도당을 추가하고 다른 측정 5 분 소요. 포도당 첨가 한 후. 이러한 추가는 변경 될 수 있으며, 추가 구성 요소 (억제제 등)도 추가 할 수 있습니다. </li><li> 실험 측정이 완료된 후, 30 ° C 배양에서 교정 튜브를 제거하고 fluorimeter 큐벳에 각각 전체 2 ㎖ 볼륨을 전송할 수 있습니다. 매 5 초마다 각 샘플에 대한 30 초 총에 (1.8 참조) 동일한 설정에서 형광을 측정합니다. </li><li>Microsoft Excel로 형광 데이터를 내보낼 수 있습니다. (우리 fluorimeter 들어,이 엑셀에 탭으로 구분 된 양식 가져 오기 텍스트와 같은 데이터의 수출이 필요합니다.) 각 교정 혼합물을 450 nm의 490 nm에서 형광의 비율을 계산하여 보정 곡선을 얻습니다. 형광 비율은 다음 보정 곡선을 얻을 수 산도 대 그려집니다. </li><li> 형광 비율을 실험 데이터를 변환하고 표준 곡선을 사용하여 pH를 계산합니다. 액포 pH는 다음 시간 (pH 변화의 역학)에 대한 플롯이나 다양한 조건 (그림 1)에서 또는 다른 돌연변이 균주에 비해 수 있습니다. </li></ol> 2. 효모 pHluorin을 사용하여 VIVO에서 세포질의 pH 측정 <ol><li> 표준 프로토콜에 의해 플라스미드 효모 pHluorin하여 원하는 효모 균주를 변환 및 보충 최소 배지 부족 우라실 (SC-우라실)에 형질 전환을위한 선택합니다. </li><li> 중반 로그 단계 (OD에 SC-유라의 변형 세포의 50 ML 액체 문화를 성장 <suB&gt; 600 = 0.8 이하). </li><li> 액포 산도하지만, 세포질 pH 측정, 일반적으로 pH를 6-8 적합한 pH 범위에 버퍼에 설명 된대로 교정 표준을 준비합니다. 보정 버퍼 나누어지는 2 ㎖는 몇 15 ML 원뿔 튜브에 원하는 산도를 조정했습니다. (1.4) 위에서 설명한대로 모 넨신 및 nigericin를 추가하고 잘 섞는다. </li><li> 위에서 설명한대로 원심 분리하여 세포를 수확하고, 성장 배지 600 μL에 펠렛을 resuspend을. 30 초 동안 5,000 rpm으로 원심 분리하여 무게 microcentrifuge 관 및 펠렛 세포에 전송합니다. 다시 포도당 (SC-우라실, 포도당), 펠렛 세포없이 성장 매체 1 ML에서 펠렛을 resuspend을 반복하십시오. 최종 원심 분리 한 후, 같은 철저 가능한 상층 액을 제거하고 세포 펠렛을 무게. 아니 포도당과 SC-우라실 0.5 g / ML의 최종 농도로 세포를 resuspend을. </li><li> 보정 버퍼의 각 튜브에 세포 현탁액의 20 μl를 추가하고 와류 믹서에 잘 섞는다. 3 품다0 ° ~ 60 분 동안 회전하는 드럼 로터 C. </li><li> 파장 405 및 485 nm의 여기 및 508 ㎚의 발광 파장에 대한 fluorimeter을 설정합니다. BCECF 측정을 위해 위에서 설명한대로 하나의 시점이나 운동 측정 및 혈당의 추가로 진행합니다. </li><li> 보정 샘플의 형광을 측정하고 BCECF (1.10-1.11 참조)로 보정 곡선을 생성합니다. 형광 비율 대 산도의 줄거리는 대부분의 세포질 pH 측정 (pH가 6.0-8.0) 9의 범위에서 선형이기 때문에, 실험 형광 비율 측정은 쉽게 산도로 변환됩니다. </li></ol>

<ol><li>Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensors+and+regulators+of+intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sensors and regulators of intracellular pH.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 50-61 (2010).</li>
<li>Orij, R., Brul, S., Smits, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+pH+is+a+tightly+controlled+signal+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Intracellular pH is a tightly controlled signal in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1810, 933-944 (2011).</li>
<li>Diakov, T. T., Kane, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+vacuolar+proton-translocating+ATPase+activity+and+assembly+by+extracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of vacuolar proton-translocating ATPase activity and assembly by extracellular pH.</a> J. Biol. Chem. 285, 23771-23778 (2010).</li>
<li>Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vacuolar+and+plasma+membrane+proton+pumps+collaborate+to+achieve+cytosolic+pH+homeostasis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Vacuolar and plasma membrane proton pumps collaborate to achieve cytosolic pH homeostasis in yeast.</a> J. Biol. Chem. 283, 20309-20319 (2008).</li>
<li>Tarsio, M., Zheng, H., Smardon, A. M., Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+loss+of+Vph1+protein-containing+vacuolar+ATPases+%28V-ATPases%29+for+overall+cellular+pH+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Consequences of loss of Vph1 protein-containing vacuolar ATPases (V-ATPases) for overall cellular pH homeostasis.</a> J. Biol. Chem. 286, 28089-28096 (2011).</li>
<li>Plant, P. J., Manolson, M. F., Grinstein, S., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+mechanisms+of+vacuolar+acidification+in+H%28%2B%29-ATPase-deficient+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Alternative mechanisms of vacuolar acidification in H(+)-ATPase-deficient yeast.</a> J. Biol. Chem. 274, 37270-37279 (1999).</li>
<li>Ali, R., Brett, C. L., Mukherjee, S., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+sodium%2Fproton+exchange+by+a+Rab-GTPase-activating+protein+regulates+endosomal+traffic+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Inhibition of sodium/proton exchange by a Rab-GTPase-activating protein regulates endosomal traffic in yeast.</a> J. Biol. Chem. 279, 4498-4506 (2004).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li>
<li>Brett, C. L., Tukaye, D. N., Mukherjee, S., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+endosomal+Na%2BK%2B%2FH%2B+exchanger+Nhx1+regulates+cellular+pH+to+control+vesicle+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The yeast endosomal Na+K+/H+ exchanger Nhx1 regulates cellular pH to control vesicle trafficking.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 1396-1405 (2005).</li>
<li>Owen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+spectrum-shifting+intracellular+pH+probes+5%27%28and+6%27%29-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro%5B7H-benzo%5Bc%5Dxanthene-7%2C+1%27%283%27H%29-isobenzofuran%5D-3%27-one+and+2%27%2C7%27-biscarboxyethyl-5%28and+6%29-carboxyfluorescein%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of spectrum-shifting intracellular pH probes 5'(and 6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7, 1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one and 2',7'-biscarboxyethyl-5(and 6)-carboxyfluorescein.</a> Anal. Biochem. 204, 65-71 (1992).</li>
<li>Dechant, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+pH+is+a+second+messenger+for+glucose+and+regulates+the+PKA+pathway+through+V-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Cytosolic pH is a second messenger for glucose and regulates the PKA pathway through V-ATPase.</a> Embo J. 29, 2515-2526 (2010).</li>
<li>Gustavsson, M., Barmark, G., Larsson, J., Muren, E., Ronne, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics+of+monensin+sensitivity+in+yeast%3A+implications+for+post-Golgi+traffic+and+vacuolar+H%2B-ATPase+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Genet.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Functional genomics of monensin sensitivity in yeast: implications for post-Golgi traffic and vacuolar H+-ATPase function.</a> Mol. Genet. Genomics. 280, 233-248 (2008).</li>
<li>Kovac, L., Bohmerova, E., Butko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionophores+and+intact+cells.+I.+Valinomycin+and+nigericin+act+preferentially+on+mitochondria+and+not+on+the+plasma+membrane+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Ionophores and intact cells. I. Valinomycin and nigericin act preferentially on mitochondria and not on the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae.</a> Biochim. Biophys. Acta. 721, 341-348 (1982).</li>
<li>Braun, N. A., Morgan, B., Dick, T. P., Schwappach, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+CLC+protein+counteracts+vesicular+acidification+during+iron+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The yeast CLC protein counteracts vesicular acidification during iron starvation.</a> J. Cell Sci. 123, 2342-2350 (2010).</li>
<li>Orij, R., Postmus, J., Beek, T. er, Brul, A., S,, Smits, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+cytosolic+and+mitochondrial+pH+using+a+pH-sensitive+GFP+derivative+in+Saccharomyces+cerevisiae+reveals+a+relation+between+intracellular+pH+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of cytosolic and mitochondrial pH using a pH-sensitive GFP derivative in Saccharomyces cerevisiae reveals a relation between intracellular pH and growth.</a> Microbiology. 155, 268-278 (2009).</li>
<li>Zhang, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+ergosterol+in+V-ATPase+function+underlies+antifungal+activity+of+azole+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Requirement for ergosterol in V-ATPase function underlies antifungal activity of azole drugs.</a> PLoS Pathog. 6, e1000939(2010).</li>
<li>Brett, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+reveals+the+vacuolar+pH-stat+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis reveals the vacuolar pH-stat of Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS One. 6, e17619(2011).</li>
<li>Roberts, C. J., Raymond, C. K., Yamashiro, C. T., Stevens, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+the+yeast+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Methods for studying the yeast vacuole.</a> Methods Enzymol. 194, 644-661 (1991).</li>
<li>Chan, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+V-ATPase+proton+transport+reveal+uncoupling+functions+of+tether+linking+cytosolic+and+membrane+domains+of+V0+subunit+a+%28Vph1p%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of V-ATPase proton transport reveal uncoupling functions of tether linking cytosolic and membrane domains of V0 subunit a (Vph1p).</a> J. Biol. Chem. 287, 10236-10250 (2012).</li>
<li>Johnson, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+inhibitors+of+vacuolar+proton-translocating+ATPase+pumps+in+yeast+by+high-throughput+screening+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Identification of inhibitors of vacuolar proton-translocating ATPase pumps in yeast by high-throughput screening flow cytometry.</a> Anal. Biochem. 398, 203-211 (2010).</li>
</ol>

저자는 공개 할 관심 없음 충돌이 없습니다.

우리의 pH 항상성 측면의 숫자를 해결하기 위해이 프로토콜을 이용했다. 예를 들어, 우리는 4,5 야생 형과 V-ATPase의 결핍 돌연변이 세포의 세포질과 산도 반응을 비교했다. 우리는 또한 포도당 3 액포의 pH 응답에 변경된 성장 조건, 특히 세포 산도의 효과를 조사했다. 중요한 것은, 우리가 관찰 응답은 양적 pH 측정의 다른 방법과와 양성자 펌프의 변경된 활동을 설명하는 생화 학적 데이터와 일치합니다. 생체 pH 측정에서의 형의 두 가지 가장 중요한 기능은 여기에 설명 된 형광의 현지화 및 신호의 레벨은, 이들 중 하나의 문제는 특정 응용 프로그램 또는 돌연변이에 대한 방법의 수정이 필요합니다. BCECF의 액포 현지화 6 다소 뜻밖이지만, 다른 돌연변이의 숫자에 보존, 등액포 가수 분해 효소의 수준을 감소 VMA의 돌연변이 4. 효모 액포는 Nomarski...

의 pH 항상성은 모든 생물 1,2 역동적이고 고도로 통제 프로세스입니다. 생화학 적 과정은 밀접하게 산도에 의해 규제되고, 세포 환경은 주민 효소의 최적 활동을 할 수 있도록 좁은 산도 범위로 조정됩니다. 그러나 세포의 pH 항상성은 환경 산도, 대사 변화, 특정 신호 전달 경로의 급격한 변화에 도전 할 수 있습니다. 또한, 세포 내 pH는 중요한 신호로 자신을 제공 할 수 있습니다. 마지막으로, 많은 세포 소기관이 세포 소기관 특정 기능에 대한 주변의 세포질에서 독특하고 필수적인 lumenal의 pH 값을 유지합니다. 높은 진핵 생물 2의 pH 항상성 메커니즘의 효모 인 Saccharomyces cerevisiae의 주가는 숫자입니다. 리소좀 / endocytic 통로의 산성 세포 소기관으로, pH는 주로 많은 exchan와 협력하여 행동, 고도 보존 액포 양성​​자 translocating ATPase의 (V-ATPase의)에 의해 제어됩니다산도 기울기에 따라 제르. 모든 진핵 세포는 양성자 수출 메커니즘이 있습니다. 에 곰팡이와 식물, 플라즈마 막에서 두 번째, 독특한 프로톤 펌프, Pma1, 수출 신진 대사 양성자와는 세포질 pH와 세포막 전위의 주요 결정 요인이 될 것으로 생각됩니다. S.의 유전 적 유연성 cerevisiae의 및 상업적 중요성은, 그것의 pH 항상성이 공부를위한 매우 중요하고 흥미로운 모델을 만들었습니다. 세포 기관 산성화의 주요 드라이버 일뿐만 아니라, V-ATPases 매우 효소를 통제하고 우리의 실험실은 V-ATPase의 규제 메커니즘을 이해에 관심이 있습니다. 이 목표를 향해, 우리는 액포와 세포질의 pH 생체 pH 측정에 사용하고있다 : 1) 돌연변이의 효과 타협 V-ATPase의 활성을 조사하기 위해 포도당 박탈 및 readdition 2로 변경 세포 조건)에 대한 응답을 모니터링하는 데, 3) COOR를 탐험세포 소기관 및 플라즈마 막 양성자 펌프 3-5 조율 활동. 이러한 실험은 효모 세포에서 사용할 의무가 강력한 비례 산도 지표의 개발을 통해 가능하게되었다. . 포유 동물 세포의 세포질 산도를 측정하기 위해 널리 사용되었습니다, 효모 액포에 축적 - 플랜트 등 첫번째 BCECF ((6) carboxyfluorescein 2&#39;7&#39; - 비스 - (2 - 카복시 에틸) -5) 것으로 나타났다 대신 세포질 6. BCECF 현지화의 차이는 BCECF-AM (BCECF의 아세 톡시 메틸 에스테르) 및 액포 유지 6에서 아세 톡시 메틸 에스테르의 분열에 대한 가능성이 책임 액포에있는 많은 가수 분해 효소에 기인하고있다. 알리 등 7. 더 BCECF를 사용하여 액포의 pH 측정을 개발하고 형광 플레이트 리더 형식으로 이러한 측정을 적응. 브렛 등. 플라스미드 매개 R을 표현하여 효모의 세포질 산도를 측정하는 수단으로 효모 pHluorin 소개효모 특이 적 프로모터 9 통제 atiometric 산도에 민감한 GFP 8. BCECF 효모 pHluorin 모두의 여기 스펙트럼은 산도에 민감, 그래서 그들은 하나의 발광 파장에서 측정 된 두 여기 파장,에서 형광의 비율은 pH가 8,10의 측정을 제공하는 비례의 pH 지표로 사용됩니다. 이러한 효모 액포와 세포질 pH 센서는 모두 단일 셀 및 인구 기반 측정에 사용되었습니다. 단일 세포 측정은 6,11 형광 현미경 및 이미지 분석에 의해 수행됩니다. 두 파장에서의 액포 또는 세포질 형광 각 셀에 대해 측정됩니다. 인구 기반의 측정은 적절한 형광 기능을 갖춘 마이크로 플레이트 리더 중 하나 또는 fluorimeter에서 수행됩니다. 그것은 죄수 중에 이러한 포도당 같은 구성 요소의 추가에 대한 쉬운 접근을 제공하기 때문에 우리는 일반적으로 fluorimeter 우리의 측정을 수행 한tinuous 운동 측정. 액포와 세포질의 pH 측정을위한 우리의 현재 실험실 프로토콜은 아래에 나열되어 있습니다; 둘은 쉽게 마이크로의 분석에 적용됩니다.

<table><tbody><tr><td>분광 형광계</td><td>Horiba Jobin Yvon</td><td>모델 Fluoromax-4</td><td>온도 제어 및 교반 기능이 바람직합니다.</td></tr><tr><td>BCECF-AM</td><td>Invitrogen/Molecular Probes</td><td>B1150</td><td>건조 DMSO에서 12mM 스톡을 준비하고 -20°C에서 부분 표본으로 보관합니다. C </td></tr><tr><td>monensin</td><td>Sigma</td><td>M5273</td><td>독성. </td></tr><tr><td>니게리신</td><td>시그마</td><td>N7143</td><td>독성. </td></tr><tr><td>MES</td><td>시그마</td><td>M8250</td><td></td></tr></tbody></table>

액포와 세포질의 ph 측정<em&gt; 생체 내</em&gt; 효모 세포 현탁액의

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

액포와 산도 세포질이 높은 효모 세포의 조절과 전체의 pH 항상성에 중요한 역할을 차지한다. 우리는 공포 또는 세포질로 지역화 산도에 민감한 형광 물질을 사용하여 생체 내에서의 pH 비례 측정을위한 프로토콜을 설명합니다. 액포 pH는 그 아세 톡시 메틸 에스테르 형태로 세포에 도입하면 효모 공포에 지역화 BCECF를 사용하여 측정됩니다. 세포질 pH는 효모 발기인, 효모 pHluorin의 통제하에 표현 산도에 민감한 GFP로 측정됩니다. fluorimeter에서 효모 세포 현탁액의 형광 비율을 측정하는 방법이 설명되어 있습니다. 이러한 프로토콜을 통해 다른 조건 하에서, 또는 다른 효모 돌연변이의 pH 단일 시점의 측정이 비교되었고 시간이 지남에 따라 산도의 변화를 모니터링하고 있습니다. 이 방법은 높은 처리량 실험 형광 플레이트 리더 형식에 맞게 조정되었습니다. 다른 AP에 비례 pH 측정의 장점현재 사용 가능한 실험 문제 및 해결하고, 이러한 기술의 향후 사용에 대한 전망의 접근 방법도 설명합니다.

50 밀리미터 MES pH를 5로 버퍼링 된, 그림 1은 다양한 매체에서 자란 야생 형 효모 세포 (YEPD 효모 추출물 - 펩톤 - 덱스 트란)에서 얻은 액포의 pH 데이터를 제공합니다. 배지의 pH는 특히 최소 배지 하룻밤 성장하는 동안 매우 극적으로 변화 할 수 있기 때문에 우리는 종종 버퍼 매체에 세포를 성장하고, 우리는 성장 배지의 pH가 액포의 pH 응답하기 3에 영향을 미칠 수있는 것으로 나타났습니다. 많은 실험 버퍼링 매체에 세포의 성장을 위해 그러나 또한 허용 해이다. 그림 1A는 위의 프로토콜에 의해 BCECF 암으로 배양 세포에 대한 보정 곡선을 보여줍니다. BCECF 형광 비율과 액포 산도 사이의 관계가 넓은 pH 범위 이상 7 비선형 있지만, 이러한 실험 측정 관련 범위 내에서 거의 선형 및 선형 추세선이 표시와 실험의 pH 값을 계산하는 데 사용됩니다. GL의 결과 액포의 pH 변화포도당 박탈 세포 uc...

액포와 세포질 pH는 라이브 효모 측정 할 수있다 (<em&gt; S. cerevisiae의</em&gt;) 특정 세포 구획에 국한 비례 형광 염료를 사용하여 세포. 우리는 효모의 공포에 지역화 BCECF-AM, 그리고 세포질 비례 산도에 민감한 GFP (효모 pHluorin)와 세포질 산도와 액포 산도를 측정하기위한 절차를 설명합니다.

액포와 세포질의 pH 측정<em&gt; 생체 내</em&gt; 효모 세포 현탁액의

Vacuolar and  cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in  overall pH homeostasis. We describe  protocols for ...

다음 실험의 전반적인 목표는 살아있는 효모 세포의 액포 및 세포질 pH를 측정하고, 세포 외 조건의 변화에 따라 pH가 어떻게 변하는지 관찰하는 것입니다. 이는 효모 세포의 액포와 세포질에 pH 민감성 형광 프로브를 도입함으로써 달성됩니다. 액포 pH를 측정하기 위해 B-C-E-C-F-A-M 염료를 세포에 도입하며, 세포질 pH를 측정하기 위해 pH 민감성 GFP인 Florin을 플라스미드로부터 세포 내에서 발현시킵니다.두 번째 단계로, 형광 표지된 세포를 세척하고 포도당이 없는 성장 배지에서 고밀도로 재부유시킵니다. 검량선을 작성하기 위해 이 현탁액의 일부를 서로 다른 pH의 검정 버퍼에 분배합니다.다음으로, 현탁액의 다른 부분을 약한 완충액으로 희석하고, 포도당 또는 기타 첨가물을 넣기 전후의 현탁액 형광을 형광계로 지속적으로 모니터링합니다. in vivo에서의 액포 또는 세포질 pH 반응을 결정하기 위해, 교정 시료로부터 보정된 비례 형광비(ratio metric fluorescence ratios)를 기반으로 실험 시료의 시간 및 조건에 따른 pH 상태를 나타내는 결과를 얻습니다. 저는 SUNY Upstate Medical University의 생화학 및 분자생물학 교수인 Patty Kane 박사입니다.이 방법은 세포가 환경 변화에 어떻게 반응하는지, 그리고 다양한 펌프와 수송체가 세포질 및 소기관의 pH 조절에 어느 정도 기여하는지와 같이 pH 조절 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 원하는 배지에서 야생형 효모 세포의 50 milliliter 액체 배양액을 성장시키십시오. 이 경우에는 50 millimolar MES로 pH 5로 완충된 YEPD 배지를 사용하여 하룻밤 동안 배양합니다.흡광도가 0.8에 도달하면, 3000 ×g에서 5분간 원심분리하여 효모 세포를 펠렛화합니다. 그런 다음 배지를 제거하고 0.6 mL의 신선한 성장 배지에 펠렛을 재부유시킵니다. 이어서, 미리 무게를 측정해 둔 마이크로 원심분리 튜브에 현탁액을 옮기고 2000 ×g에서 60초간 다시 펠렛화합니다.상층액을 가능한 한 완전히 제거한 후 세포 펠릿의 무게를 잽니다. 배양 배지를 사용하여 펠릿을 0.5 g/mL의 최종 밀도로 재현탁합니다. 다음으로, DMSO로 준비된 12 mM 스톡 용액으로부터 B-C-E-C-F-M을 세포 현탁액에 최종 농도 50 µM이 되도록 첨가하고 잘 혼합한 후,

measurement-vacuolar-cytosolic-ph-vivo-yeast-cell

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

저하 및 재활용을위한 효모 공포의 산성 루멘에 organelles의 전달을 모니터링하는 강력한 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 유전자 인코딩 듀얼 발광 형광 산도 - 바이오 센서 및 형광 현미경을 사용하여 개별 세포의 시각화와 대상 organelles의 특정 상표에 의존합니다.

효모에서 모니터링 Mitophagy을위한 형광 현미경 분석 Saccharomyces cerevisiae

분열 효모의 양적 라이브 세포 형광 - 현미경 분석

우리는 endomembrane 파열을 추적하는 방법을 설명하면 세포 내 박테리아에 의해...

액포 파열의 단일 세포 측정은 세포 내 병원균에 의해 발생

현재 문서 곰팡이 독성 메커니즘에 대한 우리의 지식을 향상 할 수있는 유용한 도구가 될 것입니다 인간 대 식세포와 통성 세포 내 인간의 곰팡이 병원균 칸디다 글라 브라의 상호 작용을 연구하는 체외 세포 배양 모델 시스템을 구축 할 수있는 프로토콜을 설명합니다.

설립<em&gt; 체외</em&gt; 시스템의 세포 내 행동을 연구하는<em&gt; 칸디다 글라 브라</em&gt; 인간 THP-1 식세포에

유동 세포 계측법 및 현미경에 따라 두 개의 보완적인 방법은 효모에서 MAPK 경로의 활성화에 의해 유도되는 유전자 발현의 역학의 단일 세포 수준에서 정량을, 가능하게하는 표시됩니다.

단일 효모 세포에서 MAPK 유도 표현의 시간적 정량화

세포 내 pH를 측정하기 위해 여러 가지 방법을 사용할 수 있지만 이 중 세포질 및 소기관 pH를 동시에 측정할 수 있는 방법은 거의 없습니다. 여기에서는 살아있는 세포의 비율계량 이미징을 통해 세포질과 소포 pH를 동시에 측정하는 빠르고 정확한 방법론에 대해 자세히 설명합니다.

공 초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 세포 내 이입과 세포질 구획 동시 pH 측정

우리는 차등 디지토닌 투과화를 사용하여 골수 유래 대식세포에서 세포질 및 액포 Salmonella typhimurium의 정량화를 설명합니다.

공포 성 대 세포질의 정량화<em&gt; 살모넬라</em&gt; 차동 투과성으로하여 기본 대 식세포에서

Phosphoinositides는 상대적인 풍부 빠르게 다양한 자극에 대한 반응의 변화 지질 신호된다. 이 문서 추출 및 탈아 실화 다음 3 H-의 미오의 -inositol와 대사 라벨 세포에 의해 phosphoinositides의 풍부를 측정하는 방법을 설명합니다. 추출 글리세 inositides 후 고성능 액체 크로마토 그래피로 분리하고, 섬광 유동에 의해 정량화된다.

고성능 액체 크로마토 그래피 결합 흐름 섬광에 의한 방사성 표지 및 Phosphoinositides의 세포 수준의 정량화

소포 수송 이벤트의 정확한 정량화는 종종 특정 단백질의 역할과 돌연변이의 영향에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 본 논문은 정량적 형광 현미경 및 유세포 분석을 사용하여 살아있는 세포에서 세포내 이벤트를 정량화하기 위한 도구로 pH에 민감한 GFP 변이체인 초황도 pHluorin을 사용하는 방법을 제시합니다.

신진 효모의 세포 내 이입의 양적, 운동 및 높은 처리량 분석을위한 pHluorin의 응용 프로그램

내재적 무질서 영역(IDR)은 환경 변화에 대응하여 형태를 수정하는 유연한 단백질 도메인입니다. 앙상블 형광 공명 에너지 전달(FRET)은 다양한 조건에서 단백질 치수를 추정할 수 있습니다. 우리는 고삼투압 스트레스 하에서 살아있는 맥주효모균 세레비지애 세포의 IDR 구조적 민감도를 평가하기 위한 FRET 접근법을 제시합니다.

FRET를 사용한 살아있는 세포의 고삼투압 스트레스에 대한 반응으로 본질적으로 무질서한 영역의 구조적 민감도 추정

여기에서는 효모 샘플에서 스트레스 후 생존을 정량화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 원형질막 무결성을 정량화하기 위해 SYTO 9와 요오드화 프로피듐(PI)이라는 두 가지 형광 염료를 사용합니다. 유세포 분석을 사용하여 산화 후 스트레스 샘플에 대한 살아있는 세포, 죽은 세포 및 손상된 세포 분획에 대한 정량적이고 재현 가능한 추정치를 제공합니다.

효모 세포의 스트레스 후 생존을 정량화하기 위한 유세포 분석법과 결합된 최적화된 LIVE/DEAD 분석

배우세요 효모 세포의 액포와 세포질 pH 측정 방법을 BCECF-AM 및 pH 민감성 GFP를 사용하여. 이 기법은 생체 내 pH 역학을 연구하고 세포 반응 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다.

액포와 세포질의 pH 측정

더 많은 동영상 탐색