다중 Chemostat 배열의 설계 및 사용

안녕. 저는 워싱턴 대학교 효모 자원 센터(University of Washington Yeast Resource Center)의 교수인 Mitre a Dunham입니다. 우리는 게놈 진화를 연구하는 데 관심이 있습니다.

이 과정을 연구하기 위해 우리가 사용하는 도구 중 하나는 실험실에서 효모 배양을 진화시킨 다음 게놈이 어떻게 변화하는지 묻는 실험적 진화입니다. 이를 연구하기 위해 사용하는 장치 중 하나는 지혈제입니다. 지혈은 본질적으로 실험실에서 수백 세대 동안 효모 배양을 배양한 다음 세포가 어떻게 적응했는지 물어볼 수 있는 배양 용기입니다.

여기서 이 지혈제는 맞춤형 유리 흐름 지혈제이며, 상상할 수 있듯이 가격이 비싸고 공간을 많이 차지합니다. 그래서 최근에 제 연구실에서 미니 지혈제를 개발했습니다. 미니 지혈을 사용하면 큰 부피의 지혈기로 모든 일을 할 수 있지만 더 적은 돈과 더 적은 공간으로

제 대학원생인 Aaron Miller가 미니 지혈 어레이를 구축하고 사용하는 방법을 안내할 것입니다. 안녕하세요 여러분. 저는 던햄 연구소의 대학원생인 아론 밀러입니다.

이 비디오 시리즈에서는 미니 통계 배열을 만들고 사용하는 방법을 보여 드리겠습니다. 이 비디오에서 답변되지 않은 질문이 있는 경우 minis stat 설명서를 참조하십시오. 미니 스탯 챔버는 실리콘으로 고정된 50mil 유리관으로 구성됩니다.

코르크 공기는 긴 척추 탭 바늘을 통해 챔버로 전달되며, 이 바늘은 튜브 바닥까지 도달하여 강력한 공기 흐름을 제공합니다. 샘플링은 두 번째 바늘에 의해 제어되며, 이 바늘은 분석을 위해 배양물을 수집 챔버로 보냅니다. 이 바늘의 길이는 작업 배양 부피를 결정합니다.

훨씬 더 짧은 세 번째 바늘은 배양 챔버에 배지를 추가하는 데 사용됩니다. 이 활성은 희석 속도를 결정하고 세포 성장 속도를 직접 제어합니다. 20mil 배양 부피는 매우 멀티플렉스가 될 수 있을 만큼 충분히 작고 상대적으로 작은 공간에 여전히 적합하지만 생산된 샘플로 충분할 만큼 충분히 큽니다.

D-N-A-R-N-A 및 대사 산물 특성화를 위해 수족관 펌프에서 가스 세척 병으로 공기를 펌핑합니다. 이것은 기류를 작은 거품으로 분산시켜 공기를 수화시킨 다음 배양 챔버로 보냅니다. 이러한 기포는 매체를 폭기할 뿐만 아니라 세포를 부유 상태로 유지하고 뭉치는 것을 방지하기 위해 작용하며, 배지는 미디어 자동차와 미디어 전달 바늘을 연결하는 튜브에서 미니 스탯으로 전달됩니다.

minis stat에서 유속은 멀티플렉스 연동 펌프에 의해 제어되며, 이 펌프는 미디어 라인의 일부인 펌프 튜브를 통해 미디어를 마사지합니다. 배양 수준이 배양 샘플링 바늘에 도달하면 공기 흐름에 의해 생성된 양압은 배양을 폐수 트랙을 통해 배양 수집 챔버로 밀어냅니다. 내부 성장 챔버의 온도는 외부 열원(이 경우 열 블록)에 의해 조절되지만 수조 또는 인큐베이터도 작동합니다.

이 비디오에서는 4개의 미니 통계 배열을 조합하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 4는 미니 통계의 기본 단위를 나타내며, 이 지침을 반복적으로 적용하면 주어진 펌프에서 최대 32개의 미니 통계를 실행하도록 이 접근 방식을 확장할 수 있습니다. 미니 통계 시리즈의 두 번째 비디오는 경쟁 기반 실험 연구 및 미니 통계에서 진화를 실행하기 위한 완전한 설계와 방법, 그리고 완료 후 정리하는 방법에 대한 지침을 제공합니다.

튜브를 청소하기 위해 배양실을 청소하고 조립하는 것으로 시작하겠습니다. 우리는 약 10mil의 90% 에탄올로 세척한 다음 10mil의 물로 세척합니다. 오염 물질을 물리적으로 제거하기 위해 Kim 물티슈 3개를 가져다가 튜브 내부를 문지릅니다.

그런 다음 Kim 물티슈가 남긴 보푸라기를 제거하기 위해 마지막으로 한 번 씻습니다. 배양 튜브는 일반적으로 사용하지 않을 때 거꾸로 보관됩니다. 다음으로, 원하는 배양 볼륨의 수준을 표시합니다.

우리는 20mils의 배양 부피를 사용합니다. 또한 21 및 19 mil 볼륨 표시를 표시하여 이상적인 시작에서 다양한 차이를 감지합니다. 각 튜브에 21mils를 채우고 각각에 대한 수위를 표시하십시오.

그런 다음 1mil을 제거하고 20mil 표시를 한 다음 19mil 표시에 대해 이 작업을 다시 수행합니다. 이 다음 부분을 수행하기 전에 보안경을 착용하고 노출된 바늘로 작업할 때는 항상 보안경을 착용하고 조심스럽게 움직입니다. 다음으로, 코르크를 뚫을 때 각 코르크를 고정하는 데 사용할 단일 배양 튜브를 따로 보관하십시오.

미니 스탯 디자인에 사용된 세 개의 바늘을 사용하면 이 튜브에 코르크 조각이 채워지므로 완전히 단단히 청소할 수 있을 때까지 실험에 사용하지 마십시오. 튜브에 코르크를 넣습니다. 가장 긴 바늘, 즉 분홍색 뒷면이 있는 바늘을 가져다가 다른 바늘을 위한 공간이 여전히 있도록 코르크 중심에서 약간 오프셋된 곳에 끝을 놓습니다.

코르크를 받침대를 끼우고 바늘이 유리 챔버의 측면과 거의 평행이 되도록 바늘을 밀어 넣습니다. 이 바늘과 함께 제공되는 인서트가 있습니다. 나중에 사용할 것이므로 저장하십시오.

다음으로, 뒷면이 노란색인 미디어 바늘을 가져다가 코르크 중심에서 비슷한 거리에 놓습니다. 코르크 둘레의 약 1/3 정도에서 코르크를 고정하고 바늘을 밀어 넣습니다. 마지막으로, 흰색 뒷면의 폐수 바늘을 가져 와서 바늘이 유리 배양실의 벽과 거의 평행이 되도록 나머지 공간의 코르크를 뚫습니다.

배양량을 설정하는 데 사용할 바늘이므로 바늘을 반만 밀어 넣고 분홍색 주머니 바늘에서 바늘 삽입물을 꺼내 공기와 폐수 바늘을 청소하는 데 사용합니다. 그런 다음 핀셋으로 들어가 코르크 아래쪽의 바늘에 붙어 있는 코르크 조각을 회수합니다. 마지막으로 어셈블리를 깨끗하고 표시된 배양 튜브에 넣습니다.

4개의 배양 튜브 모두에 대해 이 작업을 수행합니다. 이제 모든 비 오토클레이브 부품을 제작하고 정렬합니다. 배양실에 수분을 공급하는 것은 증발을 방지하는 데 중요합니다.

우리는 여러 가지 방법을 시도한 결과 10mil 토프를 통해 공기를 버블링하는 것만으로도 실험 시작 시 성장의 배치 단계에서 증발이 크게 감소한다는 것을 발견했습니다. 시작하려면 펜치를 사용하여 끝을 부러뜨립니다. 그런 다음 뒷면에서 면 플러그를 제거하고 단일 구멍 실리콘 스토퍼에 넣습니다.

이것을 1리터 필터 플라스크 위에 놓습니다. 그런 다음 어댑터를 놓고 4cm 길이의 큰 튜브 조각을 만들고 이것을 상단에 부착합니다. 그런 다음 약 10cm 길이의 다른 큰 튜브 조각에 커넥터를 놓고 필터 플라스크 측면의 노즐에 놓습니다.

수화실에서 공기를 가습한 후. 4개의 포트 매니폴드를 사용하여 4개의 미니 스탯으로 분할됩니다. 4개의 4cm 크기의 큰 튜브 조각을 가져다가 매니폴드의 각 포트에 놓습니다.

다음으로, 매니폴드의 왼쪽에 긴 튜브 조각을 부착하고 이 튜브의 다른 쪽을 수화 챔버에 부착합니다. 여기에 표시된 설정의 경우 이 튜빙 조각의 길이는 45cm입니다. 중요한 것은 이 튜브가 공기 흐름에 동력을 공급하기 위해 매니폴드와 수화 챔버 사이의 거리를 확장할 수 있을 만큼 충분히 길다는 것입니다.

우리는 분당 300mil 이상의 여과 및 가습 공기를 각 챔버로 펌핑하는 수족관 펌프를 사용합니다. 펌프에서 가습실 상단의 어댑터까지 도달할 수 있는 충분한 길이의 작은 튜브 조각을 부착합니다. 합리적인 범위 내에서 이 튜브 길이를 변경하는 것은 챔버로의 유속에 영향을 미치지 않는 것 같습니다.

다음으로 연동 펌프를 설정합니다. 우리의 실험을 위해. 효모에서는 시간당 0.17 볼륨의 매체 유속을 사용하며, 이는 펌프의 펌프 속도 7.5 RPM과 대략 상관 관계가 있습니다.

미세 조정 및 유량은 펌프 카세트의 왼쪽에 있는 폐색 노즐을 사용하여 개별적으로 조정할 수 있습니다. 어떤 펌프 속도가 실험에 이상적인 희석 속도를 제공하는지 미리 결정하는 것이 중요합니다. 마찬가지로, 열 블록의 방향이 원하는 온도와 관련이 있는지 파악하는 것이 중요합니다.

우리는 주어진 문화가 경험하는 환경을 재현하기 위해 섭씨 30도를 사용합니다. 우리는 일반적으로 각 챔버 내의 온도를 가장 잘 반영하기 위해 물로 채워진 챔버에 공기를 거품으로 만듭니다. 이제 공기와 매체를 배양실 안팎으로 운반하는 세 가지 유형의 튜브를 조립해 보겠습니다.

에어 튜빙은 4개의 포트 매니폴드를 각 미니 스탯 챔버에 연결합니다. 이 작업을 수행할 수 있을 만큼 튜브가 충분히 길게 절단되어 있는지 확인하십시오. 이 데모에서는 길이가 45cm인 튜브를 사용합니다.

한쪽 끝에는 공기 필터를 배치하는데, 이 필터는 공기가 각 배양 챔버의 바닥으로 전달되기 전에 제균 장벽 필터 가습 공기 역할을 합니다. 다른 쪽 끝에는 이 튜브를 분홍색 뒤쪽 바늘에 부착하기 위해 루어 커넥터를 배치합니다. 폐수 튜브는 각 배양 챔버를 각각의 100mil 샘플링 병에 연결합니다.

튜브가 그렇게 하기에 충분한 길이인지 확인하십시오. 이 데모에서 튜브의 길이는 48cm입니다. 한쪽에 루어 커넥터를 추가하기만 하면 바로 사용할 수 있습니다.

배지 튜브는 연동 펌프를 통해 멸균 배지 소스에서 각 챔버로 배지를 쥐로 보냅니다. 배지 소스에서 펌프까지, 펌프에서 배양 챔버까지 도달할 수 있는 충분한 길이의 튜브가 있는지 확인하십시오. 먼저 64cm 길이의 큰 튜브 조각을 암컷에게 부착합니다.

빠른 연결. 이 조각의 다른 쪽 끝에 큰 어댑터에서 작은 어댑터를 놓고 이것을 긴 작은 튜브 조각에 연결합니다. 다음으로, 하나의 소스에서 여러 챔버로 매체가 흐를 수 있도록 분기 시스템을 조립합니다.

이 경우 4, 작은 튜브를 꽂고 이 튜브 분기 세트에 빠르게 연결합니다. 다음으로, 각 연동 펌프 튜브를 가져 와서 어댑터 바늘을 추가하고 양쪽에 루어 잠금 장치와 수 나사를 조입니다. 그런 다음 이들 각각을 튜브의 분기 세트에 연결합니다.

그런 다음 펌프 튜브의 다른 쪽 끝은 이 데모에서 길이가 42cm인 마지막 튜브 세트에 연결됩니다. 이는 각 배양 챔버의 상단에 있는 노란색 뒷면의 배지 전달 바늘에 나사로 고정된 최종 lu 커넥터 세트로 이어집니다. 이제 폐수 샘플링 용기를 조립합니다.

지금까지 우리는 100 또는 125 mil 유리 스크류 탑 병을 샘플링 챔버로 사용해 왔으며 상단에 코르크를 추가하면 더 체계적이고 살균 된 상태로 유지된다는 것을 발견했습니다. 우리는 미디어를 병 안으로 전달하는 데 도움이 되는 무언가를 놓지 않는 한 코르크가 약간 지저분할 수 있다는 것을 발견했습니다. 이를 위해 저는 그림과 같이 절단된 200마이크로리터 팁을 사용하여 코르크 바닥에 있는 두 개의 구멍 중 하나에 넣었습니다.

다음으로 길이가 4cm인 두 개의 작은 튜브를 코르크 상단에 놓고 오토클레이브에서 가스를 교환하고 챔버를 무균 상태로 유지하는 공기 필터로 덮습니다. 그 후, 미니 통계 배열은 닫힌 시스템을 형성합니다. 우리는 이 시스템을 멸균하기 위해 고압멸균하고 필터와 알루미늄 호일 종이접기를 사용하여 고압증기멸균과 사용 시간 사이의 무균을 보장합니다.

작은 호일 조각을 가져다가 반으로 접습니다. 미디어 라인의 빠른 연결 위에서 평평하게 누르고 모서리의 뒷면을 접습니다. 이 접힘이 튜브에 단단히 고정되도록 하십시오.

이 끝을 생물학적 오염 물질로부터 밀봉하려면 호일을 다시 접고 꼬집어 닫으십시오. 이제 오토클레이브를 사용할 준비가 되었습니다. 이제 튜브를 각 배양실에 연결합니다.

미디어 라인의 분할된 끝을 잡고 코르크 어셈블리의 각 노란색 뒤쪽 바늘에 연결합니다. 미디어 튜브가 엉키지 않도록 순차적으로 수행하십시오. 다음으로, 4 개의 항공사를 코르크 어셈블리의 분홍색 등 긴 바늘에 연결하십시오.

그런 다음 여과된 끝을 큰 알루미늄 호일 조각으로 감쌉니다. 물이 들어가지 않을 정도로 단단히 조여지지만 고압증기멸균 중에 공기가 빠져나갈 수 없을 정도로 단단하지 않습니다. 다음으로, 폐수 라인을 가져 와서 각 라인의 끝에 필터를 놓습니다.

이들은 일시적인 멸균 장벽으로 작용합니다. 이 각 선의 반대쪽 끝을 코르크 어셈블리의 흰색 뒷면 중간 길이 바늘에 나사로 고정합니다. 이전과 마찬가지로 공기는 빠져나갈 수 있지만 물은 들어가지 않도록 여과된 끝 부분에 큰 호일 조각을 접습니다.

F LX 라인을 표시하여 공기 라인과 구별할 수 있으며, 각 샘플링 챔버에는 공기를 배출하고 물로부터 보호하기 위해 호일 포장재가 장착되어 있습니다. 오토 클레이브 자동차 준비 동안 미니 통계 설명서에서 길게 다루고 있으며, 10 리터 또는 5 리터 자동차를 조립하고 호일로 만들어 오토 클레이브를 준비합니다. 이제 자동차를 포함한 모든 것을 하나 이상의 항목에 넣으십시오.

오토클레이브 빈은 20분 살균 시간으로 액체 주기로 이를 고압증기멸배합니다. 이 작업은 일반적으로 완료하는 데 한 시간 반 정도 걸립니다. 미니 통계 시리즈의 두 번째 비디오에서는 경쟁 기반 연구 및 미니 통계에서 진화를 위한 실험을 실행하는 방법과 완료 후 정리하는 방법을 배웁니다.

실험을 실행하기 전에 비디오 1에서 설명한 것처럼 어레이의 모든 구성 요소를 오토클레이브를 조립해야 합니다. 또한 minis stat manual에 설명된 대로 배지를 만들고 필터링해야 하며 적절한 지혈 배지에서 성장한 하룻밤 배양을 준비해야 합니다. 각 수화 챔버를 700mil의 DD H2O로 채웁니다.

미니 stat array를 가져와서 가열 블록에 넣습니다. 항공사를 4개의 포트 매니폴드에 넣고 수족관 펌프를 켭니다. 에어 필터를 제거하고 배양 샘플링 라인을 오토클레이브 멸균 100mil 샘플링 병에 넣고 호일을 빠르고 빠르게 만듭니다.

미디어를 차량에 일렬로 연결합니다. 그런 다음 라인에서 공기 마사지 클립을 해제합니다. 펌프를 켭니다.

펌프를 사용하는 사람이 없는 경우 최대 90RPM까지 크랭크할 수 있으며 챔버는 30분 이내에 가득 차야 합니다. 실험이 이미 실행 중이라면 하룻밤 사이에 배양실을 배지로 채웁니다. 배양액이 약 35mil로 채워지면 미디어 펌프를 끕니다.

추가 배지는 접종 중 오염을 방지하기 위해 성장의 배치 단계 동안 증발 효과에 대해 완충합니다. 각 미니 스탯 배양 코르크 어셈블리에 70%에탄올을 넉넉히 뿌리고 1분 동안 그대로 두십시오. 원하는 경우 측면을 두드려 과도한 에탄올을 제거할 수 있습니다.

보안경을 착용하고 22게이지 바늘과 1밀 주사기를 사용하여 미니 스탯에 100마이크로리터의 하룻밤 배양을 접종합니다. 접종물을 미니 스탯 챔버 벽뿐만 아니라 미디어에 주입해야 합니다. 그런 다음 30시간 동안 배양이 자라도록 합니다.

이 성장 배치 단계는 실험 시작 시 주요 제한 영양소가 고갈되는 포화 배양을 확립하는 데 사용되는 일반적인 전술입니다. 30시간 후, 이를 위해 배양 부피를 20mils로 설정하고, 흰색 등받이 폐수 바늘의 높이를 줄이고, 버블링이 꺼졌을 때 20mils의 배양 볼륨에 도달할 때까지 배양물로 거품이 나는 공기를 차례로 꺼야 합니다. 또는 배양량이 너무 낮으면 펌프를 다시 켜고 공기 흐름이 없을 때 20mil 표시까지 채워질 때까지 기다립니다.

이제 배양 부피가 20mils로 설정되었으므로 펌프를 다시 7.5RPM으로 돌리거나 펌프 샘플에서 시간당 0.17 부피와 관련된 설정을 하루에 한두 번 얼음 위의 깨끗한 배양 튜브에 넣습니다. 실험에 따라 샘플링 코르크를 얼음 위의 수집 튜브에 넣는 데 따라 저는 보통 2시간 동안 샘플링하여 6.8mil의 배양을 제공합니다. 펌프가 올바르게 설정되었다면 펌프를 켜고 시간 제로 측정을 시작한 시간, 측정 기간 및 수집된 양을 기록하고 싶을 것입니다.

배양 부피를 설정하여 100mil 샘플링 병에 수집된 폐수는 관심 대상이 아니므로 2시간이 지나면 이를 버릴 수 있습니다. 이제 비어있는 100mil 병에 샘플링 코르크를 다시 놓고 세포 수를 얻고 샘플에 대해 원하는 다른 분석을 수행할 수 있습니다. 맨날.

얼음 위에서 두 시간 동안 제 문화를 시음합니다. 그런 일이 일어나는 동안, 저는 마지막 샘플링 이후 수집된 폐수를 측정하여 희석률과 시간당 부피, 그리고 마지막 측정 이후의 세대 수를 계산합니다. 2시간 샘플링이 완료되면 샘플링 라인을 이제 비어 있는 100mil 폐수 수집 병에 다시 넣습니다.

샘플링된 배양액을 사용하여 mil 및 기타 관심 종말점을 정량화하고, 심층 분석 방법을 사용하여 유전자 마커를 사용하여 집단 구성을 특성화하고, DNA 및 RNA의 특성 분석은 mini stat manual에서 다룹니다. 또한 실험실에서 사용하는 템플릿 워크시트가 제공되어 데이터 수집을 구성하고 데이터 분석을 자동화하는 데 도움이 됩니다. 실험 실행을 마쳤을 때 같은 날의 모든 부품을 분해하고 처리하여 배지가 건조되어 튜빙 또는 기타 미니 스탯 부품을 오염시키지 않도록 하는 것이 중요합니다.

실험의 마지막 날에는 마지막 샘플링을 위해 미디어와 공기 펌프를 끕니다. 저는 종종 배양실에 부착된 모든 라인을 제거하고 모든 튜브와 별도의 오토클레이브 용기를 배치합니다. 그런 다음 배양실 자체를 얼음 위에 놓고 배양 부피, 마일당 세포 및 기타 관심 종점을 측정합니다.

다음으로, 각 유형의 튜브를 가져 와서 RO 물로 철저히 헹굽니다. 미디어 튜빙의 경우 다른 유형의 튜빙으로 최소 30초 동안 몇 분 동안 헹굽니다. 그런 다음 공기 펌프를 사용하여 각 튜브 조각에 남아 있는 물을 불어냅니다.

그런 다음 모든 튜브를 정리하고 걸어 나중에 실험에 사용할 수 있습니다. 또한 모든 퀵 커넥트는 물로 헹구고 들어 올려 건조시켜야 합니다. 코르크 어셈블리를 청소하려면 DDH two oh로 각 바늘을 철저히 세척하십시오.

화학 물티슈를 사용하십시오. 바늘 외부에 남아 있는 매체도 닦아내십시오. 그런 다음 바늘 삽입물을 사용하여 미디어와 유출 바늘에서 물을 흡인하고 분배합니다.

바늘의 외부를 한 번 더 닦으면 사용할 준비가 됩니다. 다음 실험에서는 물과 에탄올로 배양실을 세척하고 첫 번째 비디오에 설명된 대로 거꾸로 보관합니다. 또한 RO 물로 코르크 마개로 차를 세 번 철저히 헹구어야 합니다.

자동차 바닥에서 퀵 커넥트를 제거하고 스파우트를 통해 물을 흐르게 하십시오. 튜빙, 코르크 어셈블리 또는 배양실을 재사용하기 전에 일반적으로 RO 물로 다시 세척하고 공기 펌프로 튜브를 통해 공기를 불어 튜브에 남아 있는 물을 제거해야 합니다. 이 글이 유익했기를 바라며 실험에 행운을 빕니다.

미니 통계 설명서를 참조하십시오.