Name: Osmótica Drug Delivery para hindlimbs isquêmicos e perfusão da vasculatura com Microfil para Micro-tomografia computadorizada (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Aprenda a inserção de bomba osmótica para liberação local de fármacos em membros posteriores isquêmicos de camundongos e a perfusão vascular com Microfil para microtomografia computadorizada.

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Os autores gostariam de agradecer Keith Michel do MD Anderson pequena instalação de imagem animal para a sua assistência técnica com micro-tomografia computadorizada, Edward TH Yeh, MD, para a assistência cirúrgica e Rebecca Bartow, PhD, para a assistência editorial. Este trabalho foi financiado em parte pela American Heart Association.

1. Priming da bomba osmótica <ol><li> Use técnicas estéreis (por exemplo, luvas, câmara de fluxo laminar) na preparação das bombas. Remover a bomba e regulador de fluxo a partir da embalagem. Pesar a bomba de vazio e anotar o peso (mg). </li><li> Encher a bomba, lentamente, para evitar a criação de bolhas de ar, utilizando-se uma pequena seringa de 1 cc 27G e o tubo de enchimento de ponta romba. Quando a solução atinge a parte superior da bomba, parar o enchimento. </li><li> Limpar o excesso de solução e peso da bomba cheia. Para a maioria das soluções aquosas, o peso em mg é o mesmo que o volume em ul. A diferença no peso vazio contra cheia deve ser mais do que 90% do volume de enchimento significativo especificado. Se não, evacuar a bomba de seringa e com a recarga. Se tiver dificuldade técnica, por favor consulte a seção de solução de problemas das instruções de bomba em http://www.alzet.com/products/guide_to_use/filling.html </li><li> Use uma pinça para quebrar o branco flange do moderat fluxoou, tenha cuidado para não dobrar ou esmagar o tubo. Anexar um cateter P50 para cada extremidade do moderador, cobrindo cerca de 3-4 mm. Usando uma seringa para encher o cateter e anexado moderador e deixar a seringa fixada à parte distai do cateter. </li><li> Inserir o regulador de fluxo para dentro da bomba até que o cateter esteja nivelada com a superfície da bomba. Em seguida, remover a seringa a partir da extremidade distal do cateter. Coloque a bomba numa solução salina estéril a 0,9% ou em solução de PBS a 37 ° C incubadora durante um mínimo de 6 horas (de preferência S / N) para accionar a bomba, antes da implantação em que o rato. A taxa de entrega da bomba varia com o número do modelo (por exemplo, Modelo 1002 = 0,25 ul / h durante 14 dias). </li></ol> 2. Criação de isquemia dos membros posteriores Unilateral no Rato <ol><li> Anestesiar ratos com o conjunto entre 2-4% de isoflurano em 100% de O 2 a uma taxa de fluxo de 0,4 L / min e remover o cabelo (de preferência um dia antes da cirurgia) sobre a área do membro posterior e para trás com um depilatocreme ry. </li><li> Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos antes da cirurgia. Posicione o mouse na câmara de indução anestésica. Use as mesmas configurações de anestesia descritos na Seção 2.1. </li><li> Espere até que o mouse não é sensível a estímulos externos e, em seguida, colocá-lo na posição de bruços em cima da mesa de operação com um cone de nariz equipada que fornece um fluxo contínuo de isoflurano (1,5-2,0%). </li><li> Injectar a dose recomendada de anestésico (bupivacaína, 0,25% (&lt;1 mL / kg)) no local da incisão, tratar a pele com uma solução de iodo-povidona seguido por 70% de etanol. Adicione uma incisão de 4-6 mm na parte de trás (para o lado da coluna vertebral, na região escapular). Separe a membrana subcutâneo com uma pinça fina, em seguida, vire o mouse para a posição supina tratar a pele com uma solução de iodo-povidona seguido por 70% de etanol e fazer 0,8-1 cm incisão com tesoura micro-cirúrgicos acima do joelho em direção à coxa medial, seguindo o caminho da artéria femoral. </li><li> Tunnel até olado do torso com a pequena tubagem de revestimento (6-French) a partir da coxa medial a incisão nas costas. </li><li> Posicione o mouse na posição prona. Remover a bomba osmótica ferrado / cateter a partir da solução de PBS e guiar o cateter, através do tubo de revestimento, para a coxa. </li><li> Colocar a bomba dentro da parte traseira e fechar a incisão traseira com sutura prolene 6-0 (tratar a pele com uma solução de iodo-povidona seguido por 70% de etanol). Coloque a parte traseira do rato na posição supina; remover o tubo de revestimento, deixando o cateter exposto através da incisão na coxa. Fixe a perna com fita cirúrgica. </li><li> Separou-se a gordura do tecido subcutâneo para revelar a vasculatura. Para melhor visualizar a vasculatura, use um afastador para abrir a incisão. </li><li> Pierce a bainha femoral membranoso delicadamente usando uma pinça fina pontas para acessar o feixe vascular. Dissecar e separar a artéria femoral da veia femoral e nervo perto da virilha, tomando cuidado para não causar exsangramento sivo. </li><li> Colocar duas suturas adjacentes prolene 8-0 para interromper a artéria femoral de 2-3 mm proximal à bifurcação femoral (a origem da femoral profunda e epigastrica artérias). </li><li> Corte o cateter para o comprimento adequado e coloque a ponta para a região ântero-lateral da coxa, prendendo-o com um 6-0 prolene sutura da fáscia superficial para garantir a entrega alvo da substância. Fechar a incisão perna com um 6-0 sutura. Administrar um final de injecção subcutânea de analgésico (buprenorfina, 0,1 mg / kg), tratar a pele com uma solução de iodo-povidona seguido por 70% de etanol e devolver o rato para o compartimento. Use uma lâmpada de aquecimento durante a recuperação. </li><li> Depois de um período de recuperação de 30 minutos, prepare o mouse para Doppler laser para confirmar a criação da isquemia dos membros posteriores. </li><li> Monitorizar os animais duas vezes por dia, durante 5 dias após a cirurgia. A mobilidade do animal será observada a ocorrência de dor, os resíduos na gaiola servirá como uma indiator de comer. Além disso, durante o período de monitor de determinar se o animal está sentindo dor ou desconforto e dar uma injeção subcutânea de buprenorfina (0,1 mg) duas vezes ao dia. </li></ol> 3. Imagem Preparação de Amostras <ol><li> Anestesiar o mouse como indicado na Seção 2.1. Transferir o mouse em cima da mesa de operação na posição supina. Injectar 1000 UI de heparina por via subcutânea para prevenir a coagulação na vasculatura. Enquanto o rato é ligado ao cone de protecção, efectuar uma incisão grande o suficiente para expor a cavidade torácica e o abdómen inferior. Mover os órgãos abdominais para o lado esquerdo do animal, para expor a aorta abdominal infra-renal (IAA). Separar cuidadosamente a aorta a partir da veia cava inferior. </li><li> Ligar o IAA proximal para reduzir o sangramento durante a inserção do cateter. Então, faça uma pequena incisão no IAA. Insira um 27 ½ G brusco da agulha (ligada a um cateter P10) no IAA e prenda-o com um 6-0. </li><li> Encha dois20cc seringas com solução salina heparinizada e 10% de formalina neutra tamponada (NBF). Encha uma seringa 5cc com um composto de borracha de silicone radiopaco contraste. Misture os três ingredientes do MV-composto: MV-diluente: MV agente de cura em relações de trabalho dos 1:1.25:0.5. Uma vez que a mistura (Microfil) tem apenas um tempo de trabalho de 20 minutos antes do agente de polimeriza, não é recomendado para adicionar o agente de cura até MV direita antes da injecção na vasculatura. </li><li> Fazer um corte no átrio direito e administrar uma dose excessiva de isoflurano para induzir a eutanásia e para permitir a drenagem do excesso de fluido. Fixe a seringa cheia de soro fisiológico para a ponta da agulha e começar a limpar a vasculatura por 5 min. Certifique-se de todo o sangue é liberado para fora dos vasos, desligue o isoflurano e desconecte o nosecone uma vez que a descarga começa. Em seguida, juntar a seringa cheia de formalina, o cateter descrito acima (3.2) e da pressão para perfundir um adicional de 5 min. Finalmente, o último perfundir seringa, com o contrasteagente, lentamente no ratinho durante 5 min. </li><li> Opcional: Fotografia do Microfil na vasculatura com uma câmara para garantir que apenas a estrutura arterial é perfundido. </li><li> Posicione o mouse em um recipiente com 10% de NBF e armazenar a 4 ° CO / N para a polimerização do agente de contraste. Após 24 horas, remover a pele na parte inferior do tronco (distai para a ligação da aorta abdominal inferior), utilizando ferramentas de dissecação, atualizar a NBF a 10%, e coloca o rato volta para o recipiente durante mais 4 dias à TA. </li><li> Dissecar os membros posteriores contralateral e isquêmico, e colocar as amostras em uma solução de ácido fórmico (Cal-Ex II) por 48 horas para facilitar a descalcificação do osso. Em seguida, lave as peças em água corrente por 1 hora e voltar para 10% NBF e prosseguir com Faxitron (sistema de raio-x usado para garantir o osso é descalcificado) e micro-tomografia computadorizada. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não há conflito de interesse. Todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com as Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC) da Universidade do Texas Health Science Center em Houston.

Aqui apresentamos um método para a droga / substância entrega osmótica em um modelo do rato de isquemia dos membros posteriores. Além disso, descrevemos uma técnica de fundição em que temos usado Microfil para produzir uma reconstrução 3D para análise da rede vascular. O grau ou a gravidade da isquemia varia de acordo com a qual a ligadura / excisão arterial é feita. Criamos uma ligação dupla na artéria femoral comum proximal à origem da femoral profunda e epigastrica artérias, esta abordage...

A doença arterial periférica (DAP) é uma doença que provoca aterosclerótica fornecimento insuficiente de sangue nas pernas 4. Ela afeta 8-12.000.000 americanos e tratamentos médicos atuais oferecem apenas um alívio limitado 5,6. Novos agentes terapêuticos que melhoram a circulação do sangue nas pernas não só restringir a progressão da doença, mas também melhorar a qualidade de vida. A incidência de PAD é maior em pessoas com idade superior a 50 anos, a terapia farmacológica para local é uma modalidade de tratamento mais desejável, porque a redução da função renal e hepática frequentemente observada em pacientes mais velhos podem diminuir o metabolismo de drogas e aumentar os efeitos colaterais com a administração sistêmica. Assim, criamos um modelo de mouse PAD para examinar se os agentes administrados localmente aliviar a isquemia dos membros posteriores, promovendo a angiogênese ea remodelação microvascular. Especificamente, utilizou-se uma bomba osmótica cateterizada para fornecer continuamente o agente terapêutico para oisquêmico músculo da coxa de ratos. Usando o nosso sistema de entrega, fomos capazes de manter as concentrações ideais da droga no ambiente local; esta abordagem permite a bioatividade de drogas adequado, evita possíveis efeitos colaterais sistêmicos, e supera a desvantagem de acesso local da droga limitado associados com a administração sistêmica. Adicionalmente, para avaliar se os agentes localmente administrados promover revascularização, usamos fundição avançada e técnicas de imagem de alta definição que permitem a quantificação de alterações na microcirculação. Colectivamente, a combinação das metodologias utilizadas neste artigo de vídeo é útil em estudos pré-clínicos para auxiliar na compreensão revascularização farmacologicamente induzida em pacientes com DAP 7-9.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagente/Material&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Ferramentas cirúrgicas</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>Tipo: Ferramenta</td></tr><tr><td>Swabs de algodão estéreis Puritan</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-029-499</td><td>Tipo: Ferramenta</td></tr><tr><td>Betadine (povidona-iodo)</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-065534</td><td>Tipo: Reagente</td></tr><tr><td>Compressas de álcool 70%</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9926371</td><td>Tipo: Reagente</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td>Tipo: Reagente</td></tr><tr><td>Sutura prolene 6-0</td><td>Cardinal Health</td><td>8709</td><td>Tipo: Ferramenta</td></tr><tr><td>Sutura prolene 8-0</td><td>Cardinal Health</td><td>2775</td><td>Tipo: Ferramenta</td></tr><tr><td>Creme depilatório</td><td>Nair</td><td></td><td>Tipo: Ferramenta</td></tr><tr><td>Bomba osmótica</td><td><a href="http://www.alzet.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ALZET</a></td><td>1002</td><td>Tipo: Ferramenta, liberação de 14 dias</td></tr><tr><td>Cateter de vinil</td><td><a href="http://www.alzet.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ALZET</a></td><td>7760</td><td>Tipo: Ferramenta</td></tr><tr><td>Soro fisiológico heparinizado (0,9%)</td><td>Baxter</td><td>2B0944</td><td>Tipo: Reagente</td></tr><tr><td>Formalina neutra tamponada</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>5705</td><td>Tipo: Reagente</td></tr><tr><td>Microfil (agente de contraste de borracha de silicone)</td><td>Flowtech</td><td>MV-112</td><td>Tipo: Reagente, Microfil Branco</td></tr><tr><td>Cal-Ex II (solução de ácido fórmico)</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS511-1D</td><td>Tipo: Reagente</td></tr><tr><td>Buprenex</td><td>CIII</td><td>7571</td><td>Tipo: Analgésico</td></tr><tr><td>Bupivacaína</td><td>Hospira, Inc.</td><td>381</td><td>Tipo: Analgésico</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipamento&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Microscópio estereoscópico</td><td>Carl Zeiss Microimaging</td><td>Zeiss Stemi 2000-C</td><td>Tipo: Equipamento</td></tr><tr><td>Imager de perfusão por laser Doppler</td><td>Perimed Inc.</td><td>Periscan PIM3</td><td>Tipo: Equipamento</td></tr><tr><td>Sistema de imagem por micro-TC</td><td>GE Healthcare</td><td>Explore Locus SP</td><td>Tipo: Equipamento</td></tr></tbody></table>

osmótica drug delivery para hindlimbs isquêmicos e perfusão da vasculatura com microfil para micro-tomografia computadorizada

Osmotic Drug Delivery to Ischemic Hindlimbs and Perfusion of Vasculature with Microfil for Micro-Computed Tomography Imaging

A investigação pré-clínica em modelos animais de doença arterial periférica desempenha um papel vital em testar a eficácia de agentes terapêuticos destinados a estimular a microcirculação. A escolha do método de entrega destes agentes é importante, porque a via de administração afecta profundamente a bioactividade e a eficácia destes agentes de 1,2. Neste artigo, vamos demonstrar como administrar localmente uma substância hindlimbs isquêmicos usando uma bomba osmótica cateterização. Esta bomba pode fornecer um volume fixo de solução aquosa continuamente durante um período de tempo atribuído. Nós também apresentamos o nosso modelo do rato de isquemia dos membros posteriores unilateral induzida por ligadura da artéria femoral comum proximal à origem da femoral profunda e epigastrica artérias do membro posterior esquerdo. Por fim, descreve-se a punção em vivo e ligadura da aorta abdominal infra-renal e perfusão da vasculatura hindlimb com Microfil, um agente de elenco radiopaque silicone. Microfil pode perfundir e encher todo o leito vascular (arterial e venosa), e porque já ligado a principal conduta vascular para a saída, o agente pode ser retida na vasculatura para futura imagiologia ex vivo com a utilização de pequenas amostras de micro-CT 3 .

A animação demonstra a inserção de bomba osmótica e cirurgia da isquemia dos membros posteriores detalhados no protocolo. Figura 1 mostra imagens laser Doppler de perfusão do membro posterior, o que confirma a isquemia. Após o vazamento vascular com Microfil, uma imagem da rede microvascular-CT 3D mostra que Microfil pode preencher efectivamente os vasos (Figura 2A), mas que as descontinuidades podem ocorrer (Figura 2B), devido a vários factores processuais (por exe...

Mostramos aqui a<em&gt; In vivo</em&gt; Inserção de uma bomba osmótica para a entrega local de drogas constante e a criação de isquemia dos membros posteriores em modelo de ratinho. Além disso, a vasculatura do membro posterior é perfundido com Microfil, um agente radiopaco de silicone, para preparar micro-tomografia computadorizada (micro-CT).

Osmótica Drug Delivery para hindlimbs isquêmicos e perfusão da vasculatura com Microfil para Micro-tomografia computadorizada

Preclinical research in animal models of peripheral arterial disease plays a vital role in testing the efficacy of therapeutic agents designed to ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a inserção in vivo de uma bomba osmótica para entrega local de substâncias às patas traseiras isquêmicas de camundongos e a subsequente perfusão da vasculatura das patas traseiras com microfill para imagem por tomografia computadorizada micro. Isso é realizado primeiramente fazendo uma incisão no ombro e na pata traseira do animal experimental para permitir a passagem de um tubo guia ao longo da parte interna das costas do animal. Na segunda etapa, uma bomba osmótica preenchida e preparada, juntamente com um cateter, são inseridos através do tubo guia e a bomba é suturada nas costas do animal.Em seguida, o tubo é removido. A artéria femoral é ligada duplamente proximal à bifurcação femoral, e a incisão é suturada. Posteriormente, a vasculatura do membro posterior é perfundida com microfill, um agente de imagem à base de silicone, através do cateter na aorta abdominal infrarrenal.No final, pode-se obter uma imagem tridimensional do molde vascular do membro posterior isquêmico de camundongo, tornada visível com microfill. Sou o Dr. Richard Dixon, chefe dos Laboratórios de Pesquisa em Cardiologia Molecular do Instituto do Coração do Tex

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Contraste de imagem aprimorada navio usando MicroCT

Visualização dos vasos coronários é fundamental para avançar na compreensão das doenças cardiovasculares. Descrevemos aqui um método para a perfusão vasculatura coronária murino com uma borracha de silicone radiopaco (Microfil), em preparação para imagiologia Tomografia micro-computadorizada (μCT).

Perfusão retrógrada e enchimento da vasculatura coronariana do rato como preparação para Micro tomografia computadorizada

Monitorização da perfusão cerebral foi demonstrada para melhorar a precisão em modelos de isquemia AVC. Dificuldades técnicas, muitas vezes limitam o uso desta ferramenta essencial para a pesquisa vascular cerebral. Neste vídeo, um sistema optimizado é mostrado para obter um controlo único ou multi-local hemodinâmicas durante a oclusão da artéria cerebral média intraluminal em ratos.

Sistema otimizado para Monitorização de perfusão cerebral no modelo do rato do curso de oclusão da artéria cerebral média intraluminal

A técnica de Landis modificada permite a medição pareada da condutividade hidráulica de microvasos individuais no mesentério de ratos normais e geneticamente modificados sob condições de controle e teste usando técnicas de microperfusão. Ele fornece um método conveniente para avaliar os mecanismos que regulam a permeabilidade dos microvasos e a troca transvascular em condições fisiológicas.

Microperf Técnica para Investigar Regulamento de microvasos Permeabilidade de Rat Mesentery

Este artigo descreve uma metodologia detalhada de usando uma borracha de silicone radiopaco à base de chumbo para perfundir vasculatura murino para quantificação do diâmetro da aorta em um modelo do rato de aneurisma da aorta e dissecação.

Análise quantitativa de Micro-CT de Aortopathy em um modelo do rato de β-aminopropionitrile-induzida de aneurisma da aorta e dissecação

Aqui, é apresentado um modelo experimental de isquemia do membro posterior crítico, seguido de uma bateria de testes funcionais, histológicos e moleculares para avaliar a efetividade das terapias angiogênicas.

Avaliando a angiogênese terapêutica em um modelo murino de isquemia Retromembro

Aqui, apresentamos um protocolo que demonstra a técnica e os controles necessários para a imagem de perfusão do Doppler laser para medir o fluxo sanguíneo na linha traseira do rato.

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A microcirculação da medula espinhal desempenha um papel fundamental na lesão medular. A maioria dos métodos não permite a avaliação em tempo real da microcirculação da medula espinhal, essencial para o desenvolvimento de terapias voltadas à microcirculação. Aqui, propomos um protocolo usando sondas Laser-Doppler-Flow Needle em um grande modelo animal de isquemia/reperfusão.

Avaliação em tempo real da microperfusão da medula espinhal em um modelo suíno de isquemia/reperfusão

Aqui, descrevemos um método de visualização e quantificação para vasos de membros traseiros murinos usando tomografia computadorizada de micro-raios-X.

Preparação amostral para visualização tridimensional baseada em tomografia computadorizada de vasos de membros traseiros murinos

O presente protocolo descreve um modelo único e clinicamente relevante de doença arterial periférica que combina artéria femoral e eletrocoagulação venosa com a administração de um inibidor de sinthase de óxido nítrico para induzir gangrena de copulxina em camundongos FVB. A perfusão II intracardiac é então usada para imagens tridimensionais de alta resolução da vasculatura do footpad.

Imagem tridimensional de alta resolução da Vasculatura do Footpad em um Modelo de Gangrena Hindlimb Murine

Este protocolo contém uma descrição detalhada de uma abordagem passo a passo para um modelo de camundongo crônico de janela craniana e embolia microvascular, otimizado para imagens in vivo por microscopia de dois fótons usando microsferas fluorescentes de poliestireno.

Modelo de camundongo com embolia microvascular para microscopia in vivo de dois fótons usando microesferas fluorescentes de poliestireno

Aprenda a inserção de bomba osmótica para liberação local de fármacos em membros posteriores isquêmicos de camundongos e a perfusão vascular com Microfil para microtomografia computadorizada.

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