형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석 제자리에서 하이브리드 사카 cerevisiae의

다음 실험의 전반적인 목표는 단일 효모 세포에서 단일 분자 특이성을 가진 mRNA 분자의 존재를 검출하는 것입니다. 먼저 lyase 함유 완충액을 사용하여 효모 세포와 포름알데히드를 고정합니다. 대부분의 세포가 위상적으로 밝아지지 않을 때까지 세포를 투과할 수 있습니다.

다음으로, 형광 태그가 지정된 단일 가닥 DNA 분자로 퍼메 세포를 배양한 다음 플라즈마 세척 커버 슬립에 세포를 장착합니다. 궁극적으로 형광 현미경 검사로 얻은 결과는 단일 세포에서 mRNA 분자의 존재 및 국소화를 자세히 설명할 수 있습니다. 유전자 발현, 마이크로어레이 및 북부 블롯과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 개별 mRNA를 단일 세포에서 시각화할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 전사 필드의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에는 집단의 세포당 arm RNA의 수를 정량화하는 것이 포함되며, 이는 promoter 수준에서 조절 모델을 알릴 수 있습니다. 또한 세포주기 동안 전사체의 국소화 및 반감기를 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

플라즈마 프리닝 진공 챔버 위치에서는 덮개가 슬라이드에서 미끄러집니다. 그런 다음 진공 챔버를 전자레인지에 넣고 밀봉되어 있는지 확인합니다. 펌프가 시작되면 펌프를 켜십시오.

진공 청소기를 켜고 이제 전자레인지의 전원을 켜고 플라즈마가 보이면 5초 후에 멈춥니다. 그런 다음 진공 청소기를 끈 다음 펌프를 끄십시오. 진공 챔버를 당겨 빼냅니다.

그런 다음 청소된 면이 위로 향하게 한 커버 슬립을 12로 옮깁니다. 웰 플레이트는 효모를 약 0.1에서 0.2의 A 600으로 성장시킵니다. 최소 배지에서 10mil의 세포는 약 10개의 혼성화에 충분한 수율을 제공합니다.

10분의 1 부피의 37%포름알데히드를 성장 배지에 직접 첨가하고 실온에서 45분 동안 배양합니다. 3000Gs에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 펠릿을 1ml의 버퍼 B에 다시 현탁시키고 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.

마이크로 원심분리기 튜브에 1ml의 얼음 냉각 완충액 B로 두 번 세척합니다. 13, 000 분당 회전수에서 1 분 동안 분리기. 다음으로, 1ml의 스페로 도금을 추가하고 완충한 다음 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다.

대부분의 세포가 검게 변할 때까지 몇 분마다 세포를 현미경으로 모니터링하십시오. 그런 다음 얼음 차가운 버퍼로 두 번 씻으십시오. B. 3, 500 RPM의 저속으로 회전합니다.

70% 에탄올 리서스 1밀리리터를 첨가하십시오. 펠릿을 부드럽게 매달아 섭씨 4도에서 밤새 두거나 영하 20도에서 무기한 보관하십시오. 혼성화 용액을 준비하려면 100마이크로리터의 혼성화 완충액에 1-3마이크로리터의 프로브를 추가합니다.

그런 다음 와류와 원심 분리기. 우리는 세 가지 다른 프로브 세트를 사용하여 세 가지 다른 유전자를 동시에 이미지화했습니다. 이제 원심 분리기, 고정 효모 샘플을 세척하고 세척 버퍼에서 흡입합니다.

혼성화 용액을 추가하고 다음날 섭씨 37도에서 밤새 부드럽게 흔들어 어둠 속에서 배양합니다. 150마이크로리터의 0.01% 폴리리신으로 깨끗한 커버 입술을 5분 동안 관리하십시오. 그런 다음 aspir와 공기 건조.

슬라이드는 디스 증류수로 세 번 세척하고 XSSC Resus로 한 번 세척 한 후 자연 건조하고 밀리리터당 0.1 마이크로 그램의 150 마이크로 리터에 세포를 현탁시킵니다. 갓 준비한 dappy 염색, 분취액, 세포 현탁액을 폴리리신 처리된 커버 슬립에 놓고 30분 동안 배양합니다. 다음으로, 연장된 금 장착 매체를 실온에서 해동합니다.

슬라이드에 3마이크로리터를 놓습니다. 그런 다음 커버 슬립에 약 0.5ml의 에탄올을 추가합니다. 12웰 플레이트에서 커버 슬립을 제거하고 핀셋으로 잡으면서 자연 건조합니다.

커버 슬립 셀 쪽을 아래로 향하게 하여 장착 매체에 놓고 몇 시간 또는 밤새 어둠 속에서 굳게 합니다. 매니큐어로 가장자리를 밀봉하고 이미징을 진행합니다. 총 거리가 5마이크로미터이고 크기가 0.2마이크로미터인 기준점 주변의 Zack을 가져옵니다.

각 프로브 세트에 해당하는 각 염료 채널에 대해 이미징을 반복합니다. 그런 다음 함께 제공되는 텍스트에 자세히 설명된 대로 진행하십시오. 유역 분할(watershed segmentation)을 통해 세포를 식별하려면 방사형 구배(radial gradient)를 사용하여 스폿을 식별하고 가우스 피팅(Gaussian fit)을 사용하여 스폿을 측정합니다.

일반적으로 히스토그램은 물고기 이미지에서 계산되며 단일 세포에 존재하는 mRNA의 수를 결정하는 데 사용됩니다. 현미경 기반 RNA 정량화의 중요한 장점은 전사체의 국소화에 대한 정보를 얻을 수 있다는 것입니다. 예를 들어, 이 물고기는 단일 프로브를 사용하여 유도성 CCB CBF 단일 대립유전자를 가진 단일 세포의 mRNA를 식별합니다.

많은 mRNA 분자가 전사 부위에 존재하기 때문에 핵 내 전사 부위의 존재와 위치를 쉽게 식별할 수 있습니다. 서로 다른 유전자의 mRNA를 라벨링하기 위해 서로 다른 염료를 사용하면 동일한 세포에서 여러 mRNA 종의 정량화를 용이하게 할 수 있습니다. 이 실험에서, 효모 세포는 알파 인자 및 소르비톨의 존재 하에서 배양되었습니다.Stelara 프로브와 함께 물고기를 사용하여 데이터는 하나의 세포가 빨간색 FUS 하나의 시작 부위로 표시된 페로몬에만 반응하는 것을 보여줍니다.

동시에 다른 세포는 주로 소르비톨에 반응하며, 여기서 S TL one 시작 부위는 녹색으로 표시됩니다. 이 비디오를 시청한 후에는 효모에서 단일 mRNA 분자를 라벨링하고 시각화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 이틀 안에 제대로 수행 할 수 있습니다.

세포가 충분히 조밀하게 집중되어 있어야 한다는 것을 기억하십시오. 희석된 샘플은 이미지화하고 저장하기 위해 더 많은 필드가 필요합니다.