Name: Uma linha de células Tetraciclina-regulado Produz Vetores Lentivirus alta titulação que visam especificamente as células dendríticas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 4 s
Description: Aprenda a gerar linhas produtoras estáveis para vetores lentivirais de alta titulação direcionados a células dendríticas. Este método utiliza transdução retroviral e transfecção de DNA concatomérico para imunoterapia.

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Os autores gostariam de agradecer Michael Chou, Bingbing Dai, e Liang Xiao para contribuir com dados para este manuscrito. Também reconhecemos Dr. John Gray para os generosos presentes de reagentes utilizados neste estudo. PB é apoiado por uma bolsa de pós-doutorado do Centro Nacional do Câncer. Esta pesquisa foi suportada por concessões do National Institute of Health (R01AI68978, P01CA132681 e RCA170820A), uma bolsa da Fundação Bill e Melinda Gates, uma bolsa de aceleração translacional do Centro Conjunto de Medicina Translacional e uma bolsa da Califórnia HIV / AIDS Programa de Pesquisa.

Células produtoras estáveis ​​DC-LV são construídos com base na GPR embalagens da linha 11 célula que contém o necessário lentiviral componentes gagpol, rev e do sistema tet-off. Em primeiro lugar, a transdução retroviral, é utilizado para gerar uma linha celular de empacotamento GPRS, que codifica uma glicoproteína SVGmu tet-dependente. Em seguida, concatemer transfecção matriz é utilizado para transfectar a linha celular com um transgene GPRS vetor lentiviral como GFP. Esta linha celular estável produtora, designado como LV-mGFP, pode ser testado in vitro e in vivo pela sua capacidade para produzir uma vacina contra DC-LV GFP. 1. Geração de uma linhagem de células dependente de SVGmu Tet O plasmídeo PRX-SVGmu é uma construção na qual a glicoproteína específica SVGmu-DC é clonado a jusante do promotor tTA avançado de plasmídeo retroviral pRetroX-Tet-off 1 (Figura 1C). Culturas de células 293T em D10 (meio de Eagle modificado por Dulbecco com10% de soro fetal bovino, 2 mM de L-glutamina). Cultura GPR linha celular de empacotamento em D10 com doxiciclina (1 ng / ml) e puromicina (2 ug / ml). Todas as células são cultivadas num humidif 37 ° C incubadora com 5% de CO 2. <ol><li> 16-18 h antes da transfecção transiente, placa de 2 x 10 6 células 293T em 4 ml de D10 em um prato de cultura de tecidos de 6 cm de tal modo que as células se aproximam de 90% de confluência no momento da transfecção. </li><li> Transfecção de plasmídeos retrovirais: misture 100 mL de 1,25 M de CaCl2 solução estéril de água Milli-Q e os seguintes plasmídeos: 5 mg PRX-SVGmu, 2,5 mg pGag-Pol, 2,5 mg pVSV-G. O volume final é de 500 uL. Para um tubo de poliestireno ml de fundo redondo de 5, adicionar 500 ul de 2X HBS (HEPES 50 mM, KCl 10 mM, dextrose 12 mM, NaCl 280 mM, 1,5 mM Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, pH 7,05). Adicionar gota a gota, a mistura de plasmídeo em tampão HBS a 2X do tampão enquanto se faz borbulhar vigorosamente com uma pipeta Pasteur de vidro. Depois de adicionar o mixture, continuam borbulhando por mais 30 segundos. Em seguida, adicione a mistura total sobre as células 293T em placas de cultura de 6 cm, e incubar a 37 ° C. </li><li> 4 h após a transfecção, substitua cuidadosamente o meio em placas de cultura com 4 ml D10 pré-aquecido. </li><li> Girar infecção: 48 h após a transfecção, a colheita SVGmu codifica partículas retrovirais no sobrenadante por passagem do sobrenadante através de um filtro de 0,45 mícrons. Placa de células de empacotamento de GPR em um prato de 24 poços a 2 x 4 10 células / poço. Adicionar sobrenadante filtrado para células de empacotamento GPR no prato (2 ml / poço) e as células de centrifugação durante 90 min a 1050 xg e 25 ° C. Mudar médio em D10 fresco com doxiciclina (1 ng / ml) após spin-infecção (2 mL / poço). </li><li> 72 horas após a transfecção, a expansão da cultura de células de empacotamento transduzidas com doxiciclina em D10 (1 ng / ml) e puromicina (2 ng / ml). </li><li> Para confirmar a expressão da SVGmu, a cultura das células sem doxiciclina durante 48 h. Meça ex superfíciepressão de SVGmu com a citometria de fluxo, utilizando soro anti-Sindbis. Estas células são designadas como GPRS linha celular de empacotamento. </li></ol> 2. Construir DC-LV células produtoras de matriz Concatemer transfecção Lentivirus plasmídeo de transferência TL20-GFP é uma auto-inactivação lentiviral vector de transferência de plasmídeo baseado em pCL20c-MSCV-GFP com um sistema de Dox regulável genoma de ARN viral e expressão substituição do citomegalovírus (CMV) com o intensificador de operadores tet 7 (Figura 1C) 11 , 12,15. O plasmídeo PGK-vel é resistente (ble) cassete bleomicina conduzido por um promotor PGK fraco 2. <ol><li> Digest 20 ug de plasmídeo TL20-GFP com a enzima de restrição Sfil, a 50 ° C. Digest 20 ug de plasmídeo PGK-vel com PflMI a 37 ° C. </li><li> Purifica-se os fragmentos de ADN (a cassete PGK-vel é 1011 pb e o vector TL20-GFP é 6861 pb) por electroforese em gel de agarose. </li><li> Ligar o vector TL20-GFP e PGK-cassete vel a uma razão molar de 25:1 (NEB ligase do DNA de T4). Incubar durante a noite à temperatura ambiente. </li><li> Após a ligação durante a noite, purificar DNA a partir da mistura de ligação (Qiagen DNeasy Blood and Tissue kit). Assegurar a quantidade de ADN purificado é de cerca de 5 jig. </li><li> 16-18 horas antes da transfecção, as células da placa de embalagem de GPRS em um prato de cultura de tecidos de 6 cm de tal modo que a confluência será de cerca de 90% no momento da transfecção. </li><li> Usar o método de transfecção com fosfato de cálcio descrito na etapa 1.2 para transfectar 5 ug do ADN concatemeric purificada em células de empacotamento do GPRS 6 cm de prato de cultura de tecidos. 4 h após a transfecção, o meio cuidadosamente remover e substituir com 4 ml D10 pré-aquecida com doxiciclina (1 ng / mL). </li><li> 48 horas após a transfecção, mudar o meio em D10 com doxiciclina (1 ng / ml) e puromicina (2 ug / ml). Escolha de clones transfectados adicionando zeocina (50 ug / ml) no meio de cultura. Cultura de células para cerca de 2 semanas até pilha colonizaçãoes pode ser visto, na parte inferior dos pratos. </li><li> Rotular as colônias de células na parte inferior dos pratos. Aqui pratos de cultura de tecidos de 24 poços, o número de cavidades e adicionar a cada poço 2 ml de D10 contendo zeocina (50 ug / ml) e doxiciclina (1 ng / ml) e puromicina (2 ug / ml). Aspirar o meio das células transduzidas, em seguida, adicionar uma gota de tripsina em cada uma das colónias durante menos de um minuto. Em seguida, adicionar uma ou mais gotas de D10 no mesmo colónias. Pegar colónias, um por um, com uma pipeta, e transferi-los para diferentes poços da placa de cultura de tecidos de 24 cavidades. </li><li> Cultura e expandir em todos os clones de células D10 contendo zeocina (50 ug / ml) e doxiciclina (1 ng / ml) e puromicina (2 ug / ml) para a avaliação da capacidade de produção viral. </li></ol> 3. Avaliar a produção viral de cada clone celular <ol><li> Tripsinizar as células produtoras e prato em torno de 4x10 6 células em 6 cm de prato de cultura de tecido em D10 sem doxiciclina tal que a confluênciasuperior a 90%. Substituir o meio fresco com D10 pré-aquecido diariamente e recolher o meio para o ensaio de titulação de 72 horas após a remoção dox. </li><li> Colheita do sobrenadante virai por filtragem por meio de um filtro de 0,45 ^ m. </li><li> As células alvo placa que expressa o receptor DC-SIGN (por exemplo 293T.hDC-SIGN ou na medula óssea do rato derivadas de células dendríticas, 16) e 293T como um controlo negativo em pratos de cultura de 96 poços, 1 x 4 10 células / poço. Adicionar duas diluições em série do sobrenadante viral aos poços (100 ul / poço). Geralmente, 6-8 diluições são suficientes para atingir a gama em que as células transduzidas GFP positivas estão em uma relação linear com a quantidade de vírus adicionado. </li><li> Centrifugar as células e substituir o meio, tal como descrito na etapa 1.4. BMDCs devem ser cultivadas em meio RPMI com 10% de FBS e GM-CSF (1:20 J558L meio condicionado). </li><li> Medir a expressão da GFP em células transduzidas por citometria de fluxo de 4-6 dias pós-transdução. A vecto lentiviralr título é calculado na gama de diluição vector quando a percentagem de células GFP positivas e quantidade do vetor estão em uma relação linear. Escolha o clone celular com a maior produção viral para aplicações subseqüentes. </li></ol> 4. Produzir e concentrado Vetores Lentivirus <ol><li> Culturas da linha de célula produtora (LV-mGFP) em 15 cm de pratos de cultura de tecidos. </li><li> Tripsinizar as células produtoras e de células em pratos de placas de cultura de tecidos de 15 cm a mais do que 90% de confluência em D10 fresco sem doxiciclina. Alterar médio com frescos, D10 pré-aquecido por dia. </li><li> No momento da produção de pico viral (conforme determinado pelo utilizador), a colheita do sobrenadante viral e filtrá-la utilizando um filtro de 0,45 mícrons. Carrega-se o sobrenadante filtrado para 32,5 ml de tubos de parede grossa ultracentrífuga, selar com parafilme e centrifugar a 50.000 xg, a 4 ° C durante 90 min. Ressuspender cuidadosamente o sedimento em 50 mL ou um volume adequado de PBS ou HBSS, dependendo da aplicação. &lt;/ Li&gt; </ol> 5. Imunização de camundongos in vivo e análise da resposta imune antígeno-específica <ol><li> Produzir vírus de alto título, conforme descrito na seção 4. </li><li> Injectar ratinhos BALB / c (6-8 semanas de idade, fêmea) através de uma via da almofada da pata com a suspensão do vetor (25 ul por pata). </li><li> 2 semanas após a imunização, o baço e isolar os esplenócitos de colheita. Culturas esplenócitos com GFP epitopos peptídeos e análise da presença da GFP específica de células T CD8 +, utilizando a coloração de citocinas intracelulares, conforme descrito anteriormente 17 (Figura 3B). </li></ol>

<ol><li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272, 263-267 (1996).</li>
<li>Kootstra, N. A., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+with+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pharmacol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Gene therapy with viral vectors.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 413-439 (2003).</li>
<li>Montini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+gene+transfer+in+a+tumor-prone+mouse+model+uncovers+low+genotoxicity+of+lentiviral+vector+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration.</a> Nat. Biotechnol. 24, 687-696 (2006).</li>
<li>Montini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genotoxic+potential+of+retroviral+vectors+is+strongly+modulated+by+vector+design+and+integration+site+selection+in+a+mouse+model+of+HSC+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy.</a> J. Clin. Invest. 119, 964-975 (1172).</li>
<li>Hu, B., Tai, A., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+delivered+by+lentiviral+vectors+for+cancer+and+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Immunization delivered by lentiviral vectors for cancer and infectious diseases.</a> Immunological Reviews. 239, 45-61 (2011).</li>
<li>Broussau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+packaging+cells+for+large-scale+production+of+lentiviral+vectors+in+serum-free+suspension+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture.</a> Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 500-507 (2008).</li>
<li>Cockrell, A. S., Ma, H., Fu, K., McCown, T. J., Kafri, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+trans-lentiviral+packaging+cell+line+for+high-titer+conditional+self-inactivating+HIV-1+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">A trans-lentiviral packaging cell line for high-titer conditional self-inactivating HIV-1 vectors.</a> Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 14, 276-284 (2006).</li>
<li>Ikeda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+high-titer+HIV-1+vector+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Continuous high-titer HIV-1 vector production.</a> Nature Biotechnology. 21, 569-572 (2003).</li>
<li>Kafri, T., van Praag, H., Ouyang, L., Gage, F. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+packaging+cell+line+for+lentivirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A packaging cell line for lentivirus vectors.</a> Journal of Virology. 73, 576-584 (1999).</li>
<li>Strang, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+vectors+with+alphavirus+envelope+glycoproteins+produced+from+stable+packaging+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 vectors with alphavirus envelope glycoproteins produced from stable packaging cells.</a> Journal of Virology. 79, 1765-1771 (2005).</li>
<li>Throm, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+construction+of+producer+cell+lines+for+a+SIN+lentiviral+vector+for+SCID-X1+gene+therapy+by+concatemeric+array+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient construction of producer cell lines for a SIN lentiviral vector for SCID-X1 gene therapy by concatemeric array transfection.</a> Blood. 113, 5104-5110 (2009).</li>
<li>Lee, C. L., Chou, M., Dai, B., Xiao, L., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+stable+producer+cells+to+make+high-titer+lentiviral+vectors+for+dendritic+cell-based+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Construction of stable producer cells to make high-titer lentiviral vectors for dendritic cell-based vaccination.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 1551-1560 (2012).</li>
<li>Steinman, R. M., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+dendritic+cells+into+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Taking dendritic cells into medicine.</a> Nature. 449, 419-426 (2007).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+lentivector+targeting+of+dendritic+cells+for+in+vivo+immunization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineered lentivector targeting of dendritic cells for in vivo immunization.</a> Nature Biotechnology. 26, 326-334 (2008).</li>
<li>Hanawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+rhesus+repopulating+hematopoietic+stem+cells+using+a+simian+immunodeficiency+virus-based+lentiviral+vector+system%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into rhesus repopulating hematopoietic stem cells using a simian immunodeficiency virus-based lentiviral vector system.</a> Blood. 103, 4062-4069 (2004).</li>
<li>Yang, L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+provision+of+antigen-specific+T+cell+immunity+by+programming+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4518-4523 (2005).</li>
<li>Dai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Gag-specific+immunity+induced+by+a+lentivector-based+vaccine+directed+to+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Gag-specific immunity induced by a lentivector-based vaccine directed to dendritic cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20382-20387 (2009).</li>
<li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J. Vis. Exp. (63), e4031(2012).</li>
<li>Kochan, G., Escors, D., Stephenson, H., Breckpot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Grade+Lentiviral+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Lentiviral+Vectors+and+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Clinical Grade Lentiviral Vectors.</a> Lentiviral Vectors and Gene Therapy. , 69-85 (2012).</li>
<li>Loew, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+PG13-based+packaging+cell+line+for+stable+production+of+clinical-grade+self-inactivating+gamma-retroviral+vectors+using+targeted+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">A new PG13-based packaging cell line for stable production of clinical-grade self-inactivating gamma-retroviral vectors using targeted integration.</a> Gene Ther. 17, 272-280 (2010).</li>
<li>Gaspar, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+of+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+by+use+of+a+pseudotyped+gammaretroviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Gene therapy of X-linked severe combined immunodeficiency by use of a pseudotyped gammaretroviral vector.</a> Lancet. 364, 2181-2187 (2004).</li>
<li>Cornetta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-competent+lentivirus+analysis+of+clinical+grade+vector+products%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Replication-competent lentivirus analysis of clinical grade vector products.</a> Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 557-566 (2011).</li>
<li>Stewart, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+producer+cell+line+for+the+manufacture+of+a+lentiviral+vector+for+gene+therapy+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">A stable producer cell line for the manufacture of a lentiviral vector for gene therapy of Parkinson's disease.</a> Human Gene Therapy. 22, 357-369 (2011).</li>
<li>Biosafety Considerations for Research with Lentiviral Vectors [Internet]. , National Institute of Health Recombinant DNA Advisory Committee. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidance/LentiVirus_Containment/pdf/Lenti_Containment_Guidance.pdf">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidance/LentiVirus_Containment/pdf/Lenti_Containment_Guidance.pdf</a> (2006).</li>
<li>Coroadinha, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrovirus+producer+cell+line+metabolism%3A+implications+on+viral+productivity%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Retrovirus producer cell line metabolism: implications on viral productivity.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, 1125-1135 (2006).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.</p

Aqui, nós descrevemos um processo para a produção de grandes quantidades de vectores lentivirais que utilizam células 293T transduzidas estavelmente com todos os componentes sob a lentivirais tet off sistema regulador. Até à data, a maioria dos protocolos para a produção de vectores lentivirais dependem de fosfato de cálcio padrão de transfecção transiente (ver 18, por exemplo). Esta abordagem tem sido bem sucedida em escala clínica, mas pode sofrer de algumas limitações que não possam estar presentes em inte...

Muitos sistemas de vectores têm sido desenvolvidos para entrega de genes. Vetores baseados em lentivírus têm estado entre o sistema viral mais comumente estudada. Estes vetores são vantajosos porque podem eficientemente transdução tanto dividindo e não dividindo células 1, alcançar expressão a longo prazo, devido à integração no genoma do hospedeiro, apresentam baixa imunidade natural anti-vector na maioria das populações humanas 2, e têm um baixo potencial de genotoxicidade de mutagénese insercional 3,4. Produção de lentivírus sempre foi colorida por questões de segurança. Lentivirais são geralmente derivados de HIV-1, o agente etiológico da AIDS. Transfecção transiente de componentes individuais do lentivector (transferência, o envelope, e os plasmídeos de empacotamento) é um meio comum e flexível de fornecimento de material genético em laboratório. No entanto, a ampliação dos transfections transitórios para aplicações clínicas é pesado e may levar ao desenvolvimento de lentivírus replicação competente 5,6. Para ultrapassar estas dificuldades, várias embalagens estáveis ​​e linhas celulares produtoras foram desenvolvidos 6-11. Uma destas linhas, a linha de embalagem de GPR 11, tem a vantagem de ser atraente regulada por tetraciclina. Neste artigo, vamos demonstrar como adaptar este sistema para produzir auto-inativando lentivirais que são especificamente voltados para as células dendríticas (DC-VEs) 12. As células dendríticas (CDs) são o antigene mais robustas que apresentam as células do sistema imunitário. Eles têm sido objecto de grande interesse no desenvolvimento de vacinas contra o cancro, porque eles iniciam directamente, programa e regular as respostas imunológicas específicas do tumor 13. A incorporação de um protocolo de vacinação de incluir DCs tem o potencial para provocar uma resposta imune antitumoral mais forte do que as vacinas de ADN ou de péptidos. Recentemente, desenvolvemos um vetor lentivírus que specifically como alvo as células dendríticas através de uma glicoproteína do vírus Sindbis modificado, SVGmu 14. Estes vetores são os únicos que mostram alta especificidade para as células dendríticas e gerar respostas imunes mais fortes do que inespecíficos, vetores VSVG-pseudotipado. Aqui, apresentamos um método para a produção de grandes quantidades desses lentivirais DC-alvo. Nós demonstramos que estas DC-VEs podem infectar DC e gerar fortes de células T CD8 + respostas imunes. Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados de forma humana, sob a aprovação do USC Intitutional Animal Care e do Comitê Use. A fim de realizar experiências in vivo e clínica, que é crítico para criar uma linha de células que podem produzir o vírus a um título elevado. Executar as etapas de transdução e transfecção exatamente como descrito irá maximizar as chances de gerar um tal clone.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Mediatech Inc.</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Mediatech Inc.</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Doxiciclina</td><td>Clontech Laboratories, Inc.</td><td></td><td></td>631311</tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invitrogen</td><td>R250-01</td><td>Puromicina tóxica</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Sangue & Kit de lenços</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr></tbody></table>

uma linha de células tetraciclina-regulado produz vetores lentivirus alta titulação que visam especificamente as células dendríticas

A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

Lentivirais (VEs) são um poderoso meio de entrega de material genético para muitos tipos de células. Devido a questões de segurança associadas a esses HIV-1 vetores derivados, produzindo grandes quantidades de VEs é um desafio. Neste artigo, apresentamos um método para a produção de altos títulos de LVs auto-inativação. Nós retroviralmente transduzir o produtor estável tet-off linha celular de GPR para gerar uma linha celular, GPRS, que pode expressar todos os componentes virais, incluindo uma glicoproteína específica de células dendríticas, SVGmu. Então, usamos concatemeric transfecção de ADN para transfectar o LV transferência plasmídeo que codifica um gene repórter GFP, em combinação com um marcador seleccionável. Vários dos clones resultantes podem produzir LV com um título de 10 vezes maior do que aquilo que conseguir com transfecção transitória. Além disso, estes vírus eficiente transduzir células dendríticas in vitro e geração de uma forte resposta imunitária das células T ao antigénio a repórter. Este método pode ser uma boa opção for produção de vacinas fortes baseados em LV para os estudos clínicos de câncer ou doenças infecciosas.

A linha celular estável descrito no presente método pode produzir grandes quantidades de vectores lentivirais que são especificamente orientadas para as células dendríticas. Como mostrado na Figura 1B, o isolamento de clones individuais proporcionou linhas de qualidade variável 12 celulares estáveis. Dos 26 clones testados, 8 produzida partículas lentivirais com um título superior a 10 6 unidades de transdução por ml (TU / ml), que é um ponto de referência comum para lentivirais SV...

Aqui, nós utilizamos a transdução retroviral e transfecção concatemeric para criar uma linha celular que possa expressar os componentes de um vector lentiviral (LV) na ausência de tetraciclina. Este LV codifica GFP e é pseudotipado com glicoproteína, SVGmu, que é específico para um receptor em células dendríticas.

Uma linha de células Tetraciclina-regulado Produz Vetores Lentivirus alta titulação que visam especificamente as células dendríticas

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar uma linhagem celular capaz de produzir altas concentrações de vetores lentivirais que tenham como alvo as células dendríticas. Isso é realizado primeiramente transduzindo uma linhagem empacotadora gag pol rev com a glicoproteína viral cbis específica para células dendríticas, criando assim a linhagem empacotadora A-G-P-R-S. O segundo passo consiste em construir um DNA cônemero que codifique o gene de interesse, bem como um marcador de seleção, e, em seguida, transfectar as células empacotadoras GPRS com o DNA cônemero.Após a seleção de clones transfectados, clones individuais são isolados e testados quanto à sua capacidade de produção. O passo final é avaliar a qualidade dos vetores lentivirais produzidos em um modelo murino. Em última análise, esses vetores lentivirais são utilizados para gerar respostas imunes altamente específicas contra antígenos em modelos murinos de câncer ou doenças infecciosas.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a transfeção transitória, é que ela pode produzir grandes quantidades de vetores lentivirais de maneira reprodutível e segura. As implicações desta técnica estendem-se

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Nós apresentamos um protocolo para a produção de antígenos específicos do mouse células T usando transdução...

Transdução retroviral de receptor de células T no rato células T

Um protocolo rápido, simples e de baixo custo para a geração de doador-derivado multivirus específico CTLs (rctl) para infusão de células-tronco hematopoéticas alogênico transplante (TCTH) destinatários em risco de desenvolver infecções CMV, EBV ou Adv. Este processo de fabricação é compatível com GMP e deve garantir a mais ampla implementação de T-cell imunoterapia além de centros especializados.

Geração de células T específicas Multivirus para Prevenir / tratar infecções virais após transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico

Apresentamos nosso protocolo nucleofection high-throughput otimizado como uma forma eficiente de transfecting humanos primários derivados de monócitos com células dendríticas ou DNA plasmídeo ou siRNA sem causar maturação das células. Nós ainda fornecer provas para silenciar siRNA sucesso do gene alvo RIG-I em ambos os mRNA e os níveis de proteína.

Protocolo otimizado para transfecção eficiente de células dendríticas, sem maturação das células

Neste protocolo descrevemos produção, purificação e titulação de lentivirais. Nós fornecemos um exemplo de entrega do gene lentiviral vetor mediada em primárias neurônios cultivados e astrócitos. Nossos métodos podem também se aplicam a outros tipos de...

Produção de lentivirais para Células Transdução do Sistema Nervoso Central

Fonte: Kubala, M. H. &amp; DeClerck, Y. A. Silenciamento Condicional da Expressão Gênica em Linhagens de Células Cancerígenas para Estudar o Recrutamento de Monócitos/Macrófagos para o Microambiente Tumoral. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra a geração de linhagens celulares tumorais com silenciamento condicional usando um sistema de shRNA lentiviral induzível por Tet. Ele descreve os passos para transdução viral, seleção com antibiótico e silenciamento gênico induzido por doxiciclina.

Geração de Células com Knockdown Condicional Utilizando um Sistema de Expressão Lentiviral de shRNA Responsivo à Tetraciclina

Uma maneira rápida e simples para gerar linhas de células humanas com sobre-expressão de cDNA induzido e reversível ou shRNA mediada knock-down do gene de interesse. Este método permite aos investigadores linhas celulares de modo fiável e altamente reprodutível manipular que são difíceis de alterar pelos métodos de transfecção transiente ou convencionais knockdown / knockout estratégias.

A geração de linhas de células humanas estáveis ​​com tetraciclina induzível (Tet-on) ou shRNA Expression cDNA

Aqui, demonstramos como os monócitos são isolados por separação de esferas magnéticas de células mononucleares do sangue periférico após centrifugação por gradiente de densidade de sangue anticoagulado humano. Após a incubação por 5 dias, os monócitos humanos são diferenciados em células dendríticas imaturas e estão prontos para procedimentos experimentais em um ambiente não clínico.

Geração de células dendríticas derivadas de monócitos humanos a partir de sangue inteiro

Neste artigo, nós fornecemos que um protocolo detalhado para a expressão de proteínas da fusão fluorescente em murino medula óssea derivada de macrófagos e células dendríticas. O método é baseado na transdução da medula óssea progenitores com construções retrovirais seguidas por diferenciação em macrófagos e dendríticas células em vitro.

Expressão de proteínas da fusão fluorescente em murino derivadas da medula óssea as células dendríticas e macrófagos

Demonstramos um protocolo passo a passo para a investigação da função gênica em macrófagos residentes no tecido peritoneal in vivo, usando vetores lentivirais.

Preparação de vetor lentiviral para modulação eficiente de genes e microRNAs de macrófagos residentes no tecido da cavidade peritoneal in vivo em camundongos

Este protocolo descreve a reprogramação in vivo de células cancerígenas de camundongo em células dendríticas tipo 1 dentro do microambiente tumoral por meio da expressão forçada dos fatores de transcrição PU.1, IRF8 e BATF3.

Reprogramação In Vivo Tratável de Células Tumorais para Células Dendríticas Convencionais Tipo 1

Aprenda a gerar linhas produtoras estáveis para vetores lentivirais de alta titulação direcionados a células dendríticas. Este método utiliza transdução retroviral e transfecção de DNA concatomérico para imunoterapia.

Uma linha de células Tetraciclina-regulado Produz Vetores Lentivirus alta titulação que visam especificamente as células dendríticas (Vídeo) | JoVE Journal

Uma linha de células Tetraciclina-regulado Produz Vetores Lentivirus alta titulação que visam especificamente as células dendríticas

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