Name: 计算机辅助多电极膜片钳系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-18T18:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: 学习计算机辅助多电极膜片钳技术，实现同时对多达12个神经元进行全细胞记录，自动定位微电极并建立紧密封接，用于高分辨率解析小型神经环路网络特性。该方法显著提升电生理记录效率。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢Gilad Silberberg、Michele Pignatelli、Thomas K. Berger、Luca Gambazzi和Sonia Garcia在提高膜片钳技术自动化方面的宝贵建议。感谢Rajnish Ranjan在软件实现方面的宝贵建议和协助。本工作部分由欧盟Synapse项目&#160;以及人类前沿科学计划资助。

1. 仪器准备
<ol>
	<li>从计算机控制操纵器
	<ol>
		<li>通过串行端口（RS-232）将每个显微操作器控制器连接到计算机。</li>
		<li>通过串口发送用于定位、查询和调整设置的指令。鉴于速度和硬件兼容性问题，建议使用 C/C++ 作为编程语言。</li>
		<li>将操纵器的参考系统标准化，使零位为尽可能靠近电机的位置，正向移动方向为远离电机的方向。</li>
		<li>将显微镜置于其中心位置，即在样本焦平面以上2 mm处（坐标 [0, 0, 2000]）。</li>
		<li>为每个操作器存储局部坐标，以使移液管尖端位于显微镜视野中心可见。此坐标作为每个电极的初始参考点。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可视化电极位置。 在实验过程中能够追踪每个电极的位置非常有用。最直观的方法是采用图形化表示。为此，需要将每个电极的参考系统与显微镜的参考系统对齐。实现这一目标的一种简单方法是：
	<ol>
		<li>将电极尖端移至视野中心。</li>
		<li>储存操纵器各轴和显微镜各轴的位置。</li>
		<li>使用操纵器的x轴执行一次相对较大的移动（1 mm）。</li>
		<li>仅移动显微镜，再次定位尖端位置。</li>
		<li>计算显微镜自上次测量以来的位置变化。这些变化是电极轴运动在显微镜坐标轴上的投影。</li>
		<li>对电极操纵器的 Y 轴和 Z 轴重复步骤 2.3 至 2.5。这可以确定显微镜轴上的投影矩阵（图2也称为余弦矩阵： 
		<img alt="3D coordinate transformation matrix equation; diagram with linear algebra matrix multiplication." src="/files/ftp_upload/50630/50630eq1.jpg" data-altupdatedat="1762173717000" data-alt="Equation 1"></li>
		<li>将该矩阵求逆，以计算电极操纵器在三维空间中移动至显微镜坐标系内指定位置所需的动作： 
		<img alt="Matrix transformation equation; 3D coordinates transformation; mathematics; vector operations." src="/files/ftp_upload/50630/50630eq2.jpg" data-altupdatedat="1762173717000" data-alt="Equation 2"></li>
		<li>使用初始参考点和余弦矩阵确定每个电极在显微镜坐标系中的位置。</li>
		<li>根据显微镜坐标，以固定时间间隔图形化显示每个电极的位置。我们选择使用 C/C++ 绘图库（GDI+）每 40 毫秒绘制一次电极位置。</li>
		<li>每次改变操纵器角度或需要数毫米级别的位置调整时（例如更换电极类型），均需重复步骤 1.2.1 - 1.2.7。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>能够在显微镜坐标系中存储组织内相关特征的位置，例如细胞或解剖学参考点。</li>
	<li>采集视频并叠加相关信息。
	<ol>
		<li>将显微镜运动的x轴与显微镜相机的水平轴进行机械对齐。</li>
		<li>在计算机上安装具有实时视频和叠加功能的图像采集卡及软件开发工具包（SDK）。</li>
		<li>使用 SDK 实现实时视频显示操作。</li>
		<li>通过适当的平移和缩放，将显微镜坐标系转换为相机参考坐标系。</li>
		<li>以约40毫秒的时间间隔，在相机坐标系中绘制相关特征，并将生成的图像叠加到实时视频上图3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对照扩增子。
	<ol>
		<li>使用放大器软件通过界面控制放大器设置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>控制示波器。
	<ol>
		<li>使用串行端口将示波器连接到计算机。</li>
		<li>确定电压钳制模式下膜片钳实验各步骤的示波器量程、耦合方式和时间分辨率例如 浴液中电极、封接形成、全细胞构型）和电流钳</li>
		<li>每当从接口发出放大器指令时，发送相应的示波器设置命令。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>控制移液管压力。
	<ol>
		<li>根据以下步骤组装压力控制系统 图4.
		<ol>
			<li>使用12 V/5 V电源为每个电子元件提供适当的供电。</li>
			<li>将一个膜泵的输出端连接至正压缓冲容器（100 ml 容器）。</li>
			<li>将一个膜泵的输入端连接至负压缓冲容器（100 ml 容器）。</li>
			<li>将移液管支架管路连接至压力控制系统中的压力传感器，以及连接至主压力舱的气动阀。</li>
			<li>将每个压力缓冲器连接到与主压力舱室相连的阀门上。</li>
			<li>在主压力舱室与大气之间连接一个阀门。</li>
			<li>将压力传感器连接至主压力腔室。</li>
			<li>将压力传感器连接至每个缓冲液瓶。</li>
			<li>将压力控制系统连接到数据采集板。</li>
			<li>将每个压力传感器连接到一个模拟输入端口。</li>
			<li>将每个阀门连接到数字输出端。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过打开除连接膜泵以外的所有阀门，并减去测得的压力值，消除所有传感器的大气压偏移。</li>
		<li>实施压力控制
		<ol>
			<li>在界面中为每个移液器定义一个控件，用于启用或禁用正压控制。</li>
			<li>为移液器设定约70 mbar的最小正压。</li>
			<li>每隔0.5秒周期性检测处于主动压力控制下的移液管内压力是否低于设定阈值。</li>
			<li>当压力超过阈值时，将正压缓冲液短暂（20毫秒）接通至主压力舱，并将该舱与目标移液管连通，直至移液管内压力高于阈值。关闭所有其他阀门。</li>
			<li>当开始最终接近目标细胞时，关闭进一步的压力控制。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>施加负压以形成封接
		<ol>
			<li>关闭所有阀门，按住按钮以保持所需时长，打开通向主压力室的负压缓冲阀，以及主压力室通向相关移液管的阀门。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将指令集中到人机交互设备上。
	<ol>
		<li>将市售的无线游戏手柄连接到计算机。</li>
		<li>实现对操纵杆状态的读取。例如，使用 C/C++ 的 DirectX 库每 5 毫秒执行一次读取操作。</li>
		<li>将当前状态与之前状态进行比较，以检测自上次时间步长以来哪些按钮被按下、释放或持续按住。</li>
		<li>为游戏手柄上的每个按钮分配功能。此映射的一个示例如下所示 图5.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 膜片钳技术操作步骤
<ol>
	<li>准备目标区域的脑片。</li>
	<li>将感兴趣的脑片放置于显微镜位移范围的中心位置，确保目标区域位于中央。</li>
	<li>细胞选择
	<ol>
		<li>通过显微镜浏览识别感兴趣的细胞。在实时视频显示中，用鼠标右键点击目标细胞上方，根据显微镜坐标系统记录细胞位置。</li>
		<li>图形界面将显示所选细胞以及微电极的全局概览，软件会在图像上叠加标记以标示细胞位置。此外，系统会保存该细胞的图像，用于后续参考，文件名为“Cell#.jpg”。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞分配至微电极
	<ol>
		<li>在选定感兴趣的细胞后，指定每个细胞由哪根微电极进行记录。图形界面提供分配控件，需进行相应设置。通过勾选“显示最终位置”复选框，可预览最终配置。</li>
		<li>选择需要预览最终位置的每根微电极，或勾选“全选”复选框。如有需要，可关闭当前位置显示以获得更清晰的视觉效果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备微电极
	<ol>
		<li>用细胞内液填充微电极（若使用多根电极，通常以6–8 MΩ为佳），并将电极装入电极夹持器中。将前置放大器头stage放入固定装置，但暂不向前滑动，以避免电极尖端接触浴液。</li>
		<li>启用正压控制，并选择所有微电极，以确保电极尖端保持清洁。轻柔地将每个头stage滑入到位。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定位微电极尖端
	<ol>
		<li>按住按钮“A”并按下按钮“R2”，将显微镜定位至中心位置，并将焦距调整至脑片上方3 mm处。若需调用上一次实验中保存的各操纵器对应位置，可按住按钮“A”并按下按钮“L2”。 
		注意：此时视野中应能清晰看到微电极的阴影，或沿电极轴向轻微移动即可观察到电极。微电极形状的微小差异需手动补偿。</li>
		<li>将微电极尖端调至焦点。将尖端置于视频显示的红色中心点上，期间不得移动显微镜（显微镜应仍处于[0, 0, 2000]位置）。</li>
		<li>按住按钮“C”并按下按钮“Z”，通知软件电极已位于显示中心。每根微电极尖端定位完成后，按住按钮“A”并按下按钮“L1”，将该电极向后移动，以便定位下一根电极。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接近细胞
	<ol>
		<li>在所有微电极尖端精确定位且每根电极均已分配至对应细胞后，自动将电极移至各自细胞附近。只需在细胞群中心处单击鼠标右键，然后在弹出菜单中选择“Cluster”选项。在出现的簇选项窗口中，选择本次需要定位的所有微电极，然后点击“Go with all checked pipettes”。对每个感兴趣的细胞簇重复此操作。</li>
		<li>手动完成最后的接近操作。电极相对于细胞的位置可自定义，但通常设定为沿电极轴向距离细胞200 µm，垂直方向高于细胞200 µm，此距离足以使电极尖端保持在组织之外。等待电极定位完成后，按住按钮“C”并按下按钮“R1”，将显微镜移向某根电极。</li>
		<li>将显微镜聚焦于电极尖端（可在视频显示任意位置），按住按钮“C”并按下按钮“B”，重新校准每根电极的位置。此时应短暂出现一个方格，标示识别出的电极位置。若位置不正确，将电极尖端移至视频显示的中心点，然后按住按钮“C”并按下按钮“Z”。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>建立细胞贴附式记录构型
	<ol>
		<li>确认当前微电极对应的目标细胞已正确标记。否则，移动显微镜使目标细胞与红色中心点对齐。按住按钮“C”并按下按钮“Y”以标记细胞。按住按钮“C”并按下按钮“L2”，将微电极移至距离其分配细胞200 µm处，显微镜将自动移动至相应位置。</li>
		<li>调整微电极位置，使其与红色中心点对齐。按住按钮“X”并按下按钮“R1”，调整微电极的偏移量。</li>
		<li>按住按钮“X”并按下按钮“L1”，激活测试脉冲。缓慢将微电极移向其对应的细胞。</li>
		<li>当观察到细胞膜表面形成凹陷时，按住按钮“Z”并按下按钮“Y”，施加短暂的负压脉冲，使压力作用于细胞。此时应通过按住按钮“X”并按下按钮“L2”，建立约-65 mV的保持电位。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>全细胞记录构型
	<ol>
		<li>每根电极均形成吉欧封接（Giga-seal）后，通过施加负压开始破裂细胞膜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行记录
	<ol>
		<li>使用刺激/采集系统进行记录。每次对单个细胞施加脉冲或脉冲串，并观察其余细胞的反应，以绘制记录细胞之间的连接图谱。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>撤回微电极
	<ol>
		<li>记录完成后，通过右键点击“Table”单选按钮，选择“Recede-&gt;Pipettes 500 µm”，使微电极沿其轴向缓慢撤回一段短距离。观察细胞电位的漂移情况（施加少量正压以清理电极尖端可能有助于稳定信号）。</li>
		<li>若需将微电极完全撤回，先将定位速度设为“Fast”，重复上述操作但选择“All”选项。随后轻柔地滑出头stage，并从夹持器中旋下已使用的微电极。操作中应避免在插座中扭转夹持器，以免严重影响微电极尖端的位置。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Perin, R., Berger, T. K., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synaptic+organizing+principle+for+cortical+neuronal+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A synaptic organizing principle for cortical neuronal groups.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5419-5424 (2011).</li>
<li>Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+Bursts+Self-Inhibit+and+Correlate+the+Pyramidal+Network%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Brief Bursts Self-Inhibit and Correlate the Pyramidal Network.</a> PLoS Biol. 8, e1000473(2010).</li>
<li>Fino, E., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dense+inhibitory+connectivity+in+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dense inhibitory connectivity in neocortex.</a> Neuron. 69, 1188-1203 (2011).</li>
<li>Packer, A. M., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dense%2C+Unspecific+Connectivity+of+Neocortical+Parvalbumin-Positive+Interneurons%3A+A+Canonical+Microcircuit+for+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dense, Unspecific Connectivity of Neocortical Parvalbumin-Positive Interneurons: A Canonical Microcircuit for Inhibition.</a> J. Neurosci. 31, 13260-13271 (2011).</li>
<li>Berger, T. K., Perin, R., Silberberg, G., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency-dependent+disynaptic+inhibition+in+the+pyramidal+network%3A+a+ubiquitous+pathway+in+the+developing+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Frequency-dependent disynaptic inhibition in the pyramidal network: a ubiquitous pathway in the developing rat neocortex.</a> J. Physiol. 587, 5411-5425 (2009).</li>
<li>Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+whole-cell+patch-clamp+electrophysiology+of+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo.</a> Nat. Methods. 9, 585-587 (2012).</li>
<li>Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephaptic+coupling+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ephaptic coupling of cortical neurons.</a> Nat. Neurosci. 14, 217-223 (2011).</li>
<li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+optogenetic+toolbox+for+fast+inhibition%2C+excitation+and+bistable+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation.</a> Nat. Methods. 9, 1171-1179 (2012).</li>
<li>Papagiakoumou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanless+two-photon+excitation+of+channelrhodopsin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Scanless two-photon excitation of channelrhodopsin-2.</a> Nat Methods. 7, 848-854 (2010).</li>
<li>Ko, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+specificity+of+local+synaptic+connections+in+neocortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional specificity of local synaptic connections in neocortical networks.</a> Nature. 473, 87-91 (2011).</li>
<li>Wickersham, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+Restriction+of+Transsynaptic+Tracing+from+Single%2C+Genetically+Targeted+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic Restriction of Transsynaptic Tracing from Single, Genetically Targeted Neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Liang, C. W., Mohammadi, M., Santos, M. D., Tang, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+Photostimulation+with+Digital+Micromirror+Devices+to+Investigate+Dendritic+Integration+Across+Branch+Points%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points.</a> J. Vis. Exp. (49), e2003(2011).</li>
<li>Nikolenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLM+Microscopy%3A+Scanless+Two-Photon+Imaging+and+Photostimulation+with+Spatial+Light+Modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">SLM Microscopy: Scanless Two-Photon Imaging and Photostimulation with Spatial Light Modulators.</a> Front Neural Circuits. 2, (2008).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

人们通常会立即提出一个问题：我们所描述的实验方法成功率如何？高成功率的关键在于充分的准备工作。移液管的尖端开口必须适合所记录的细胞。为避免移液管堵塞，对细胞内溶液进行过滤也非常重要。此外，移液管必须极为洁净且为 freshly pulled（新鲜拉制）。二项分布是可用于理解上述因素如何影响最终产量的最简单模型。对于具备经验并拥有合适设备的研究人员而言，在视觉反馈条件下记录单个神经元的成功率有望达到80%或更高。初学者的成功率通常要低得多，特别是当忽略了关键的准备步骤时。这些成功率在每次实验中所能记录到的细胞数量上的具体体现，可参见图10。未来若要进一步增加同时进行膜片钳记录的神经元数量，可能需要对操纵器进行微型化改进，并提高实验操作的可靠性；这反过来要求对实验细节给予充分关注，但这些目标完全是可行的。
本文所展示系统的多功能性仍在不断探索中，已频繁发现新的应用，特别是在研究细胞外信号与单个神经元活动之间关系方面7。当记录细胞之间的距离增大时，解剖学因素变得更为重要。然而，只要切片操作后神经连接保持完整，该系统无疑可用于研究长距...

以微米级精度记录和刺激多个位点的能力，对于实验上更深入理解神经元系统极为有用。为此已开发出多种技术，但唯有膜片钳技术能够实现亚毫伏级分辨率，这对于研究阈下活动和单个突触后电位至关重要。本文介绍了旨在同时记录和刺激大量单个细胞、并具备足够精度以研究神经元连接性的十二电极计算机辅助膜片钳系统的开发。尽管该系统还可用于许多其他应用，但尤其适用于突触连接性的研究，因为一组神经元内部可能存在的连接数量与神经元数量的平方成正比。因此，三电极系统最多可检测六种连接，通常仅能记录到一种连接，而十二电极系统则可检测多达132种连接，并经常能观察到十余种连接（图1）。同时观察数十种连接使得分析小型神经网络的组织结构成为可能，并可推断出无法通过其他方法探测的网络结构的统计特性1。此外，对多个细胞进行精确刺激还可量化突触后细胞的募集情况2。

<table><tbody><tr><td>显微镜</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>40X 浸液物镜</td></tr><tr><td>操纵器</td><td>Luigs & Neumann</td><td>SM-5</td><td>使用串行协议</td></tr><tr><td>放大器</td><td>Axon Instruments</td><td>MultiClamp 700B</td><td>使用 SDK</td></tr><tr><td>相机</td><td>Till Photonics</td><td>VS 55</td><td>BNC 模拟输出</td></tr><tr><td>图像采集卡</td><td>Data Translation</td><td>DT3120</td><td>使用 SDK</td></tr><tr><td>示波器</td><td>Tektronix</td><td>TDS 2014</td><td>串行通信</td></tr><tr><td>数据采集</td><td>InstruTECH</td><td>ITC 1600</td><td></td></tr><tr><td>数据采集</td><td>National Instruments</td><td>PCI-6221</td><td>使用库文件 (.dll)</td></tr><tr><td>压力阀</td><td>SMC</td><td>SMC070C-6BG-32</td><td></td></tr><tr><td>压力传感器</td><td>Honeywell</td><td>24PCDFA6G</td><td></td></tr><tr><td>膜片泵</td><td>Schego</td><td>Optimal</td><td></td></tr></tbody></table>

一种计算机辅助的多电极膜片钳系统

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

膜片钳技术是目前记录单个神经元或其亚细胞区室电活动最成熟的方法。然而，即使是对单个细胞进行记录，获得稳定的记录仍然是一项相当复杂且耗时的过程。通过自动化多个步骤并结合高效的信息显示，可极大地帮助实验人员在更短时间内以更高的可靠性完成更多记录。为了实现大规模记录，我们认为最有效的策略并非完全自动化整个过程，而是简化实验步骤，降低人为错误的发生概率，同时有效整合实验者的经验与视觉反馈。基于上述目标，我们开发了一套计算机辅助系统，将多电极膜片钳实验所需的所有控制功能集中于一个商业化的无线游戏手柄这一单一操作界面上，同时在计算机屏幕上显示与实验相关的信息和操作提示。本文将介绍该系统的各个组成部分，这些组件使我们能够显著缩短达到记录状态所需的时间，并大幅提高同时成功记录大量神经元的可能性。

根据上述方法，我们成功实现了对多达十二个神经元的全细胞记录，同时进行膜片钳的神经元数量几乎达到此前报道的最高数量的两倍。图中展示了在大鼠体感皮层第五层记录到的锥体神经元之间直接突触连接的网络示例。 图6.
对于特定细胞类型，以胞体间距离为函数测定连接概率分布是多电极膜片钳系统可高效完成的一项典型测量1。近年来，光刺激技术开始被用于获取此类数据，并展现出更高的效率3,4。然而重要的是，多电极膜片钳系统所获取的数据使研究者能够更全面地绘制所研究神经网络的连接图谱，并实现通过细胞内扩散染料进行的高分辨率染色。在多电极膜片钳实验中，每一个细胞均可被记录和刺激，而其他技术（如光刺激或钙成像）通常难以做到这一点。该特性使研究者能够追踪连接性中的偏差，例如双向连接的高发性，而此类偏差无法通过其他方法测量。通过对所有被研究神经元进行刺激和记录，我们发现神经元不仅倾向于形成双向连接，而且还会聚集成簇。我们的记录尺度还使我们观察到，在具有共同邻近神经元的神经元对之间，连接概率更高，即在采样网络中同时与其他单个神经元相连接的神...

多电极膜片钳记录是一项复杂的技术。本文展示了如何通过自动化许多实验步骤，加快实验进程，从而在性能和记录数量上实现质的提升。

膜片钳技术是目前记录单个神经元或其亚细胞结构电活动最成熟的方法。

本实验的总体目标是以全细胞模式对多达12个细胞进行膜片钳记录。首先标记每个目标细胞的位置，并为每个细胞分配一根移液管。第二步是定位每根移液管的尖端，并自动将移液管移动至其对应分配的细胞附近。接下来，每次使用一支移液管接近每个细胞。为了与细胞膜形成紧密的封接，最后一步是破裂细胞膜并进行全细胞记录。最终，通过计算机辅助的多电极膜片钳记录技术，以高分辨率揭示小型神经环路的网络特性。与现有的手动膜片钳等方法相比，该技术的主要优势在于，可观察到的神经网络连接数量随记录神经元数量的平方而增长。对该技术进行可视化演示非常重要，因为膜片钳操作步骤复杂且需快速完成，因此学习起来较为困难。开始此操作时，应将脑切片放置在显微镜位移范围的中心位置，确保目标区域位于视野中央。接下来，识别目标细胞。然后根据显微镜坐标系保存细胞的位置。图形界面将显示所选细胞以及微移液管的全局概览，软件会在细胞位置添加标记，并叠加显示在图像上。此外，会捕获细胞的图像以供将来参考。在选定目标细胞后，通过在图形界面中设置分配控件，指定用于记录各个细胞的移液管。通过选中复选框“显示最终位置”，可预览最终配置的示意图。现在用细胞内液准备移液管，并将其放置到移液管架上。将头部固定装置放入固定位置，但不要向前滑动。为避免移液管尖端接触浴液，开启正压控制并选择所有移液管。为确保尖端保持清洁，请轻轻将每个头阶段滑入到位。接下来，在按住按钮 A 的同时按下 R2 按钮，将显微镜定位至切片上方两毫米焦平面的中心位置。对于每个操纵器，请在按住按钮 A 的同时按下 L2 按钮，调用上一次实验中保存的对应位置。此时视野中应能清晰看到移液管的阴影，或沿移液管轴向进行微小移动即可观察到其轮廓。由于移液管形状存在微小差异，需手动进行补偿调整。接下来，将移液器尖端调至焦点。然后将尖端置于视频显示的红色中心圆点上。在不移动显微镜的情况下，按住控制器上的按钮 C，同时按下 Z 按钮，通知软件移液器已位于显示中心。在定位单个移液枪头后，将该移液管向后移动，同时按住按钮 a 并按下 L 键，以便定位下一个移液枪头。当所有移液枪头均被精确定位且每个移液管均已分配给对应的细胞后，只需在图形表示窗口中右键单击细胞群的中心位置，并在弹出菜单中选择“cluster”选项，即可自动将各移液管定位至其对应细胞附近。在簇选项窗口中，选择当前需要定位的所有移液管，然后单击“使用已选移液管开始”。对每个感兴趣的细胞簇重复此操作。执行最终接近时，将移液管相对于细胞的位置设定为：沿移液管轴向距离细胞 200 微米，垂直方向上高于细胞 200 微米，此距离足以使移液管尖端保持在组织之外。然后等待移液器定位完成。接着，在按住按钮 C 的同时按下 R 键，将显微镜向移液器移动。通过将显微镜聚焦在视频显示区域内移液器尖端的任意位置，并在按住控制器按钮 C 的同时按下 B 键，重新校准每个移液器的位置。此时应短暂出现一个方格网，表示已识别的移液器位置。如果位置不正确，请将移液器尖端对准视频显示中心的圆点，并在按住控制器按钮 C 的同时按下 Z 键。现在确认当前移液管对应的目标细胞已正确标记，并处于激活标记状态。否则，请移动显微镜，使目标细胞与中央红色圆点对齐，同时按住按钮 C 并按下 Y 按钮以标记该细胞。然后在按住按钮 C 的同时按下 L 二按钮。为将移液管定位至距离其指定细胞 200 微米的位置，显微镜将自动移动至相应位置。调整移液管位置，使其与红色圆点重合。然后按住按钮 x 的同时，按下 R one 按钮以调整移液器偏移量。在继续按住按钮 x 的情况下，按下 L one 按钮以启动测试脉冲。随后，缓慢将移液管移至指定细胞。当观察到细胞膜表面出现凹陷时，在按住 Z 按钮的同时按下 Y 按钮，施加短暂的负压，使压力作用于细胞。此时，在按住 x 按钮的同时按下 L 二按钮，应建立约负 65 毫伏的保持电位。每个细胞形成吉格封接后，通过施加负压开始破裂细胞膜。接着，使用刺激采集系统进行记录。依次对单个细胞施加脉冲或脉冲串，并观察其余细胞的反应，以绘制这些记录细胞之间的连接图谱。记录完成后，通过右键单击表格中的单选按钮缓慢将移液管从组织中撤回。选择“将移液管撤回 500 微米”，使移液管沿其轴向短距离撤回。随后观察细胞电位的漂移情况，以将移液管完全撤回至初始位置。将定位速度设置为快速，并重复相同操作，但选择全部选项。通过轻轻滑出头部支架并从支架上拧下移液管，以更换已使用的移液管。以下是单次实验中绘制的直接突触连接网络的示例。这三个连接图展示了在第五层记录的 12 个锥体细胞，其相应的胞体间距离各不相同。此处为叠加在已记录锥体细胞形态染色图像上的连接图。该图展示了共同邻居效应。蓝色柱状图表示在采样网络中同时与至少一个其他神经元相连的神经元对。图A显示，具有多个共同邻居的神经元对的互连概率显著增加。在采样网络中，共享多个共同邻居的神经元对出现频率高于随机预期，且神经元对之间的连接概率随着它们共享的共同邻居数量的增加而上升。这些特性进而形成了小世界聚类网络。该图展示了Martin nty细胞募集的量化结果。此图为一个参数细胞（红色）与Martin nty细胞（蓝色）形成突触连接的图示，而该Martin nty细胞又与第二个参数细胞形成突触连接。在黑色超阈值刺激下，对参数细胞的刺激会导致Martin nty细胞被募集。通过促进性兴奋性突触后电位的整合，被募集的Martin nty细胞随后抑制第二个参数细胞。该示意图表示对越来越多的膜片钳参数细胞进行刺激及其对另一个参数细胞的影响。以下是记录到的参数细胞的平均抑制性突触后电位，其值随被刺激的邻近参数细胞数量的变化而变化。在局部环路中，当刺激九个或更多参数细胞时，DYS突触抑制的幅度趋于饱和，且随着被刺激参数细胞数量的增加，接收到DYS突触抑制的细胞比例迅速上升至1。在执行该操作过程中，需注意保持移液管尖端清洁，并在进针阶段避开血管和其他细胞，以尽量减少组织变形。完成此操作步骤后，可采用其他方法，例如光刺激，以探讨其他问题，如另一种细胞类型对膜片钳细胞的调控作用。观看本视频后，您应能够充分理解如何加快并完成对多个神经元的膜片钳操作。

a-computer-assisted-multi-electrode-patch-clamp-system

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

计算机辅助多电极膜片钳系统

本实验旨在介绍如何对非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵母细胞进行膜片钳记录，内容包括卵黄膜的去除、吉欧姆级封接（gigaseal）的形成，以及可选地将膜片转换为外翻式构型（outside-out...

在非洲爪蟾卵母细胞中表达的离子通道的膜片钳记录

使用膜片钳技术记录BK通道的离子电流。通过向非洲爪蟾卵母细胞Xenopus...

膜片钳与灌流技术在研究离子通道表达中的应用 非洲爪蟾 卵母细胞

本方案描述了一种称为全细胞膜片钳电生理的技术，该方法用于研究斑马鱼胚胎中 Mauthner...

全细胞膜片钳电生理学：一种研究神经元电学特性的方法

本视频展示了利用两性霉素B介导的穿孔膜片钳技术，对逼尿肌平滑肌细胞中瞬时受体电位 melastatin 4...

两性霉素B介导的穿孔膜片钳分析：一种用于研究膀胱尿路上皮细胞离子电流的电生理学技术

本文介绍了一种利用细胞贴附式膜片钳技术，从单个离子通道获得长时间电流记录的操作步骤。该方法能够实时观察离子通道开闭构象变化的模式，从而揭示生物信号产生的基础。这些数据可提供关于未受干扰的生物膜中离子通道特性的信息。...

单通道细胞贴附式膜片钳记录

对人多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CMs）进行电生理表征，对于心脏疾病建模及评估药物反应至关重要。本方案提供了将hPSC-CMs解离并接种于多电极阵列上的必要信息，用于测量其场电位，并介绍了一种分析QT间期和RR间期的方法。...

利用多电极阵列（MEAs）对人多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CMs）进行电生理分析

本方案描述了如何使用近期开发的用于标准体外电生理学设备的系统，开展自动图像引导的膜片钳实验。...

应用自动化图像引导膜片钳技术研究脑片中的神经元

本文描述了使用质子选择性电极和膜片钳技术来测量质子转运系统活性的方法。这些方法克服了常用于研究质子转运活性的技术中存在的一些局限性，例如灵敏度中等、时间分辨率不足以及对细胞内环境控制不充分。...

电生理学测量在研究电中性转运蛋白活性中的应用

单纤维记录是一种适用于中枢和周围神经系统的有效电生理技术。结合带有附着坐骨神经的完整背根神经节制备，可检测传导阻滞的机制。这两种方案均有助于加深对周围神经系统与疼痛关系的理解。...

利用体内单纤维记录法及附着坐骨神经的完整背根神经节研究传导阻滞的机制

本文介绍了一种制备小鼠视网膜暗适应切片以进行电生理记录的实验方法。...

小鼠视网膜神经元在暗适应脑片制备中的膜片钳记录

学习计算机辅助多电极膜片钳技术，实现同时对多达12个神经元进行全细胞记录，自动定位微电极并建立紧密封接，用于高分辨率解析小型神经环路网络特性。该方法显著提升电生理记录效率。

一种计算机辅助的多电极膜片钳系统

探索更多视频