화학적 매개 종간의 상호 작용을 검출하는 공 배양을 사용하여

다음 실험의 전반적인 목표는 분비된 화합물에 의해 매개되고 박테리아 유전자 발현의 변화를 일으키는 서로 다른 미생물 간의 상호 작용을 확인하는 것입니다. 이는 환경 미생물을 한천 페트리 플레이트의 콜로니로 사용하는 형광 전사 리포터를 포함하는 박테리아 균주를 배양함으로써 달성됩니다. 주황색 원은 환경 미생물의 군체를 나타냅니다.

파란색 원은 리포터의 군체이지만, 고체 배지의 성장은 이러한 군체가 생산하는 대사 산물이 한천을 통해 확산되고 인근 리포터 군체에서 유전자 발현을 활성화할 수 있도록 합니다. 여기에 표시된 별과 함께 표시된 잠재적 히트는 리포터에서 유전자 발현을 변경하는 화합물을 분비할 수 있는 콜로니입니다. 이러한 유기체는 공동 배양 스크린 플레이트에서 분리됩니다.

이러한 잠재적 유도 물질은 리포터에서 박테리아 유전자 발현을 변경하는 분자를 분비하는 유기체인지 확인하기 위해 2차 검사에서 재검사합니다. 이 방법은 미묘한 간균과 토양 유기체의 생물막 형성 상호 작용에 대한 통찰력을 제공하지만, 포도상 구균 또는 슈도모나 종의 독성 발현에 영향을 미치는 미생물 상호 작용과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 실제로, 이론적으로 유전적으로 다루기 쉬운 미생물에서 리포터의 유전자 발현을 변경하는 미생물 상호 작용을 식별하는 데 적용될 수 있습니다.텍스트 프로토콜에 따라 선택한 유기체에 대한 형광 리포터 구조를 생성한 후 주걱을 사용하여 토양과 원뿔형 튜브를 수집하기 전에 노출된 표면 토양의 상단 0.5cm를 제거하여 토양을 수집합니다. 토양 1g당 10밀리리터의 비율로 0.85%멸균 식염수를 첨가하여 토양 슬러리를 만들고 1분 동안 와류로 처리하여 토양 입자에서 박테리아를 제거합니다.

토양 슬러리를 1분 동안 침전시킨 후 상부 수성층을 새 튜브로 옮기고 텍스트 프로토콜에 따라 리포터와 토양 샘플을 희석하고 리포터 시공물을 단독으로 활성화하지 않는 조건에서 공동 배양 스크린 플레이트의 중앙에 각각 50마이크로리터를 스폿합니다. 또한 토양 샘플만 플레이트링하고 리포터만 대조군으로 플레이트합니다. 각 플레이트에 약 23mm의 멸균 유리 구슬을 추가하고 플레이트를 벤치 상단에 유지하고 앞뒤로 흔들어 셀을 펼칩니다.

액체가 흡수될 때까지 회전하면서 플레이트를 뒤집고 구슬을 에탄올이 들어 있는 폐기물 비커에 버립니다. 형광을 사용하여 공동 배양 플레이트를 배양한 후 플레이트 상단에서 시작하여 플레이트를 시야를 가로질러 밝은 점으로 앞뒤로 천천히 움직입니다. 한 번 완전히 쓸어낸 후 플레이트를 90도 돌리고 이 과정을 반복합니다.

형광 반점이 감지되면 명시야 조명을 천천히 켜고 형광이 박테리아 집락과 관련이 있는지 확인합니다. 추정되는 유도 유기체를 분리하기 위해, 이는 형광 집락에 근접한 비형광 집락이 될 것입니다. 시야의 중앙에 배치하십시오 view 그리고 주로 사용하는 손으로 접근할 수 있고 형광등은 켜진 상태로 두십시오.

Brightfield를 천천히 켜서 형광 집락과 주변 유도 유기체를 모양별로 식별하고 배치합니다.유리 막대를 사용하여 멸균된 원형 200마이크로리터 젤 로딩 팁을 집어 연필처럼 잡습니다. 바깥쪽 손바닥을 s에 대십시오.tage 작업 표면에 고정시킵니다. 그런 다음 다른 손을 손의 안쪽 엄지 손가락 쪽에 올려 피펫 팁을 플레이트 표면 위에 유지하면서 피킹 도구를 안정화합니다.

그것을 시야로 옮기고 선택하려는 식민지 위의 중앙에 놓습니다. 팁은 초점에서 벗어날 것입니다. 손의 바깥쪽 가장자리를 사용하여 피펫 팁을 집을 집을 위해 천천히 아래로 돌립니다.

아주 가볍게 터치하여 피킹 도구를 회전시키지 않고 팁이 접촉하는 다른 콜로니의 수를 최소화하려고 합니다. 새 접시의 한 부분에 팁을 줄무늬로 만듭니다. 콜로니를 채취한 후 분석 지침에 따라 플레이트를 배양합니다.

군체가 보이면 입체경을 사용하여 플레이트에서 단일 또는 여러 유형의 유기체가 자라고 있는지 확인하고 각 모르포 유형을 새 플레이트에 줄무늬를 만들고 자랄 때까지 배양합니다. 추정 유도 물질이 실제 유도 물질인지 테스트하려면 기자와 비 형광 부모 균주의 잔디밭을 준비하십시오. 플레이트가 건조된 후 멸균 이쑤시개를 사용하여 테스트 콜로니에서 세포를 채취합니다.

빈 접시에 패치를 붙인 다음 두 개의 잔디 접시에 패치합니다. 대안적으로, 멸균 플라스틱 수의사에서 1밀리리터의 액체 배지에 추정되는 유도 유기체를 현탁시키고, 각 현탁액의 OD를 정규화한 후 현탁액의 OD 600을 측정하여 0.5 스폿의 OD 600에 도달하고, 각 현탁액의 1마이크로리터를 3개의 플레이트 각각에 상쇄합니다. 마지막으로, 유기체가 자라도록 한 후 해부 현미경으로 형광을 사용하여 형광 리포터 균주를 활성화하지만 부모의 통제 균주는 활성화하지 않는 추정 유도 유기체를 식별합니다.

여기의 스크리닝은 형광 전사 리포터를 사용하여 b에서 미묘한 생물막 매트릭스의 구조적 구성 요소의 유전자 발현을 변경하는 화합물을 분비하는 토양 유기체를 식별하는 데 사용되었습니다. 이상적으로, 각 공동 배양 플레이트는 밀접하게 배치된 개별 군체인 토양 군체에 대한 리포터의 일대일 비율을 포함해야 합니다. 여기에서는 갈색 원으로 표시되는 토양 군체에 비해 파란색 원으로 표시되는 리포터 군집의 비율이 높으면 공동 배양 플레이트에서 실제 유도 유기체를 정확히 찾아내는 데 대한 신뢰도가 높아지는 방법을 설명합니다.

유도하는 토양 유기체는 리포터를 활성화하는 화합물을 분비합니다. 여러 리포터 군체는 토양 대 리포터 비율이 더 높은 플레이트에 유도되어 별이 나타내는 다른 추정 유도 인자와 빨간색으로 표시된 실제 유도 인자를 쉽게 식별할 수 있습니다. 영양소 함량은 성장 군집 형성의 정도를 제어하고, 접종물의 희석은 결과 군체가 적절하게 분산되었는지 여부를 결정합니다.

이 공동 배양에서 볼 수 있듯이 이미지 B는 미묘하게 토양의 수많은 미생물에 반응하여 형광 생물막 매트릭스를 생성합니다. 우리가 조사한 토양의 경우 Ptap A YFP 매트릭스 리포터의 적중률이 높았습니다. 이는 유사한 스크린에서 발표되지 않은 결과와 대조적입니다.

포자 형성 및 역량을 사용하여 기자가 거의 또는 전혀 타격을 확인하지 못했습니다. 따라서, 상이한 세포 유형에 대한 HI 비율은 매우 가변적이며 사전에 예측하기 어려울 수 있습니다. 여기에 표시된 것은 잠재적인 유도 콜로니가 분리를 위해 선택되기 전과 후의 공동 배양 스크린 플레이트의 두 가지 예입니다.

패치 및 스팟 방법 모두의 음성 및 양성 결과가 여기에 표시되며, 2차 검사에서 검사된 집락의 약 50%가 진양성입니다. 이러한 절차에 따라서, 추가적인 질문에 답하기 위해 다른 방법들을 수행할 수 있는데, 예를 들어, 유도 유기체의 계통발생학적 동일성을 결정하기 위한 16 s SR DNA 염기서열분석, 또는 활성 화합물의 화학적 동일성을 결정하기 위해 NMR에서 HPLC 질량 분석법을 사용한다.