유방암 세포주에서 세포 증식을 결정하기위한 세 가지 방법 비교

이 데모의 전반적인 목표는 세 가지 다른 세포 증식 분석을 비교하고 각 방법의 장점과 단점을 제시하는 것입니다. 이 방법은 가장 적절한 세포 증식 방법의 사용과 같은 암 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 세포 영상 장치 단계를 배우기가 어렵기 때문에 이 방법의 준비는 매우 중요합니다.

적절한 세포 계수 마스크를 적용하기 전에 세포에 집중해야 합니다. 이 절차를 시작하려면 페놀 레드가 없는 DMEM을 사용하여 T75 제곱센티미터 조직 배양 플라스크에서 3일 동안 2개의 MCF-7 세포주를 75-80% 합류점으로 성장시킵니다. 3일 후, 배지를 폐기물 용기에 부어 플라스크에서 세포를 제거합니다.

그런 다음 즉시 예열 된 2 회 트립신 2 밀리리터로 세포층을 세척하십시오. 트립신을 흡인하고, 인큐베이터에 넣기 전에 예열된 트립신 2ml를 세포층에 더 첨가합니다. 세포가 분리되면 10ml의 따뜻한 신선한 보충제 DMEM으로 세척합니다.

그런 다음 세포 현탁액을 멸균 15ml 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 원심분리합니다. 5분 후 조심스럽게 흡입하여 상층액을 제거합니다. 그 후, 5ml의 신선한 보충제 DMEM에 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

세포 계수를 수행하려면 100마이크로리터의 세포 현탁액을 DPBS의 1배인 900마이크로리터로 희석합니다. 그런 다음 새로운 60마이크로미터 센서를 자동 셀 카운터에 놓습니다. 플런저를 누른 상태에서 센서를 희석된 세포 현탁액에 담그십시오.

세포 카운터의 플런저를 천천히 놓습니다. 그런 다음 완료되면 셀 카운터에서 센서를 제거합니다. 96웰 플레이트에 약 20% 포화도의 최종 부피 100마이크로리터에 세포를 파종하여 3-5일 동안 세포 성장 및 증식 측정을 위한 공간을 확보합니다.

혈구계를 사용하여 세포 수를 측정하려면 세포 배양 인큐베이터, 오븐 또는 수조에서 배지와 트립신을 모두 섭씨 37도로 예열합니다. 다음으로, 세포의 배지를 폐기물 용기로 흡인합니다. 그런 다음 2 회 트립신 30 마이크로 리터로 한 번 세척하고 배지를 폐기물 용기에 다시 흡입합니다.

다음으로, 2 배 트립신 30 마이크로 리터로 세포를 다시 씻고 섭씨 37도에서 5 분 동안 배양합니다. 플레이트 가장자리를 부드럽게 두드려 세포를 제거합니다. 그런 다음 50마이크로리터의 보충제를 DMEM으로 추가하고 단일 세포 현탁액이 형성될 때까지 피펫팅으로 세포를 혼합합니다.

유리 커버 슬립을 계수 챔버 위에 놓고 커버 슬립 가장자리와 헬로사이토미터 사이에 뉴턴의 굴절 고리가 보일 때까지 부착합니다. 그런 다음 커버 슬립 아래의 셀 supension 20 마이크로 리터를 부드럽게 피펫팅하고 모세관 동작으로 계수 챔버를 채우도록합니다. 그런 다음 그리드 레이아웃의 계수 챔버를 10배 배율로 시각화합니다.

이 절차에서는 발광 시약을 섭씨 22도의 수조에서 30분 동안 해동합니다. 균일한 혼합물을 얻기 위해 병을 부드럽게 뒤집습니다. 그런 다음 파종된 세포 한 플레이트를 실온에서 30분 동안 평형을 이룹니다.

그런 다음 각 웰에 100마이크로리터의 발광 시약을 추가합니다. 내용물을 오비탈 셰이커에 넣고 2분 동안 섞습니다. 그런 다음 플레이트를 실온에서 10분 동안 배양합니다.

다중 모드 플레이트 리더 소프트웨어를 사용하여 발광 실험을 설정하려면 다중 모드 플레이트 리더를 켜고 소프트웨어를 엽니다. 작업 관리자에서 실험 및 새로 만들기를 선택합니다. 그런 다음 측면 도구 모음에서 파일을 선택하고 프로토콜 탭에서 절차를 선택합니다.

그런 다음 플레이트 유형으로 Greiner 96 평평한 바닥을 선택하고 뚜껑 사용 상자를 선택합니다. 읽기 메서드 상자에서 읽기 작업을 선택합니다. 그런 다음 검출 방법으로 발광(Luminescence)을 선택하고 읽기 단계(Read Step) 상자 OK.In 클릭하고, 전체 플레이트(Full Plate) 탭에서 스캔할 웰을 선택하고, 빈 웰로 작동할 웰을 선택합니다.

필터 세트를 빈 필터로 설정합니다. 게인을 135로 설정하고 통합 시간을 웰당 5초, 읽기 높이를 6.5mm로 설정합니다. OK(확인)를 클릭하여 발광 읽기에 대한 설정을 저장합니다.

발광 판독을 수행하려면 Instrument Control 탭을 선택하여 플레이트 홀더를 꺼내고 Plate Out을 클릭합니다. 96웰 플레이트를 플레이트 홀더에 놓고 뚜껑이 켜져 있는지 확인합니다. Instrument Control(기기 제어) 탭에서 Plate In(플레이트 입력)을 클릭하여 플레이트 홀더를 닫습니다.

그런 다음 도구 모음에서 Read Now(지금 읽기)를 클릭하여 발광 읽기를 수행합니다. 그런 다음 추가 분석을 위해 각 웰에 대한 RLU 측정값을 스프레드시트로 내보냅니다. 세포 이미징 실험을 설정하려면 다중 모드 세포 이미저를 켜고 소프트웨어를 엽니다.

작업 관리자에서 실험 탭을 선택하고 새로 만들기를 선택합니다. File(파일) 도구 모음에서 Protocol(프로토콜) 탭을 클릭한 다음 Procedure(절차) 탭을 클릭합니다. 온도 설정 작업을 선택합니다.

인큐베이터를 켜기로 설정하고 온도를 섭씨 37도로 설정합니다. Preheat를 확인한 다음 OK를 클릭하여 설정을 저장합니다. 그런 다음 읽기 작업을 선택합니다.

감지 방법으로 이미지를 클릭합니다. 그런 다음 Endpoint/Kinetic 읽기 유형과 Filters 광학 장치 유형을 선택하고 OK(확인)를 클릭합니다. 그런 다음 Full Plate 탭을 클릭하고 이미징할 플레이트의 웰을 선택합니다. 확인을 클릭하여 설정을 저장합니다.

이제 드롭다운 목표 옵션에서 2.5배 목표를 선택합니다. 채널 탭에서 GFP 469.525 및 Bright Field를 선택합니다. 두 채널 모두에 대해 자동 노출을 확인하고 자동 노출 웰을 선택합니다.

자동 초점 설정을 결정하려면 옵션을 클릭합니다. 자동 초점 옵션의 경우 스캔 방법을 선택한 다음 자동 초점을 선택합니다. 확인을 클릭하여 설정을 저장합니다.

그런 다음 우물 중심에서 수평 및 수직 오프셋을 0으로 설정합니다. 3 x 2 몽타주에서 웰당 여러 이미지를 스캔하려면 선택합니다. 그런 다음 확인을 클릭하여 절차 설정을 저장합니다.

선택한 플레이트에 대한 실험을 읽으려면 기기 제어 탭을 클릭하고 플레이트 출력 기능을 선택합니다. 플레이트 홀더에 96웰 플레이트를 놓고 뚜껑이 켜져 있는지 확인합니다. Instrument Control 탭에서 Plate In 기능을 선택합니다.

그런 다음 플레이트 탭에서 Read Now를 선택하고 시딩 후 최대 96시간까지 24시간마다 읽기를 반복합니다. 이미지를 분석하려면 이미징된 플레이트의 데이터 탭을 클릭하고 Picture GFP 469, 525 plus Bright Field를 선택합니다. 그런 다음 이미징된 웰을 두 번 클릭합니다.

이제 로드된 이미지를 클릭합니다. 분석을 선택한 다음 분석할 몽타주의 단일 이미지를 선택합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다. 그런 다음 GFP 채널만 확인하고 표 3에 설명된 대로 매개변수를 설정합니다.

그런 다음 시작을 클릭하여 이미징된 셀에 매개변수를 적용합니다. 이미지당 세포 수를 결정하는 데 사용되는 이미징된 세포 위에 배치된 세포 계수 마스크를 관찰합니다. Apply Changes(변경 사항 적용)를 클릭하고 실험 전반에 걸쳐 이미지화된 각 플레이트에 대해 이러한 설정을 유지합니다.

이 그림에서는 MCF-7-LeGO 세포와 MCF-7-델타 40p53 세포의 세포 증식을 측정하기 위해 조사된 여러 방법 간의 상관 관계를 비교하기 위해 선형 회귀 분석을 수행했습니다. Pearson의 상관 계수를 계산하고 세포 증식을 측정하는 여러 방법 간의 유의성을 결정했습니다. 발광 기반 분석법과 세포 영상기의 비교 사이에 가장 강한 상관관계가 관찰되었습니다.

여기에 표시된 것은 세포가 100% confluence에 근접할 때까지 24시간마다 세포 이미저를 사용하여 캡처한 GFP 양성 MCF-7-LeGO 및 MCF-7-delta 40p53 유방암 세포의 대표적인 이미지입니다. 이 방법은 여러 날에 걸친 세포 성장을 시각적으로 모니터링하고 서로 다른 세포주 간의 세포 크기와 세포 형태를 비교할 수 있는 등 유용한 세포 정보를 제공합니다. 테스트한 각 방법의 장점과 단점에 대한 요약이 여기에 나와 있으며, 이는 각 방법의 다양성을 보여주고 독자가 가장 적합한 방법을 선택하는 데 도움이 될 것입니다.

이 동영상을 시청한 후에는 세 가지 다른 세포 증식 어세이를 잘 이해하게 될 것이며 어떤 것이 자신의 실험 설계에 가장 적합한지 결정할 수 있을 것입니다.