Name: Induzindo a lesão de isquemia-reperfusão na pele da orelha de rato por Intravital Multiphoton imagem de respostas imunes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Aprenda a induzir lesão de isquemia-reperfusão na pele da orelha de camundongo usando pinçamento magnético e imagem intravital multiphoton. Este método permite observar em tempo real as respostas inflamatórias e o comportamento dinâmico das células imunes em modelos de Imunologia e Dermatologia.

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Agradecemos a Thomas Graf por nos fornecer os camundongos LysM-eGFP.

Todos os experimentos que lidam com animais vivos foram conduzidos de acordo com todo uso de animais relevantes e diretrizes e regulamentos de cuidados. 1. Escolha do Mice repórter fluorescentes <ol><li> Use de 6 a 12 semanas de idade LysM-eGFP 11 ratos (sem preferências para machos ou fêmeas). Nota: O uso de vários ratinhos repórter fluorescente específico de células permite a visualização de diferentes células imunitárias in vivo. Nesta estirpe, os neutrófilos (células GFP hi) circulante, monócitos (células GFP LO), e os macrófagos dérmicos (células GFP LO) circulante pode ser visualizado. Com os parâmetros de imagiologia usado, apenas os sinais luminosos de neutrófilos GFP-positiva será detectado. Nota: Uma lista de estirpes de rato fluorescente repórter-imune específica de células adequadas para este tipo de estudo de imagem da pele pode ser encontrado na referência 8. Nota: É altamente recomendável que os ratos albino ser usado para geração de imagens, como pigmencamundongos ted são mais propensas a photodamage. Isto é porque a pele da orelha pigmentada é muito mais sensível a salpicar induzida por laser (indicativo de queima de tecido). Como resultado, o recrutamento dos neutrófilos e acumulação pode ser observado, mesmo durante o estado estacionário 8,12. </li><li> Mantenha os ratos (SPF) condições específicas isentos de agentes patogénicos com ciclos de luz-escuro de 12 h. </li></ol> 2. Rato Anestesia <ol><li> Anestesiar o rato com uma injecção intra-peritoneal de cetamina-xilazina (8 mL g -1 de peso corporal), composto por uma mistura de 15 mg mL -1 de cetamina e 1 mg mL -1 de xilazina dissolvido em água estéril. </li><li> Colocar o rato sobre uma almofada de aquecimento para manter a sua temperatura do corpo a 37 ° C durante todo o procedimento de preparação. Verifique para anestesia suficientes observando a ausência de um reflexo toe pitada. Nota: Após a primeira hora, as doses subsequentes trimestre de anestésico terá de ser administrado por via subcutânea umad terá a duração de aproximadamente 0,5 h cada um. O movimento das vibrissas ou a cauda também pode indicar que a anestesia é esgotando e que a top-up é necessário. </li><li> Use lubrificante oftálmica nos olhos para evitar a secura e sob anestesia. </li></ol> 3. Depilação <ol><li> Cuidadosamente aplicar creme depilatório para os dois terços superiores da orelha de rato dorsal utilizando aplicadores de algodão de ponta. </li><li> Espere por 2-3 min antes de remover o creme usando aplicadores de algodão-tip molhadas de uma forma profunda mas gentil. Nota: Não permita que creme de depilação para permanecer na orelha de rato por muito tempo, pois pode induzir a inflamação 13,14. </li></ol> 4. indução de isquemia e reperfusão <ol><li> Use banhados a ouro, N42-grade imãs de neodímio, 12 mm de diâmetro x 2 mm de espessura e com uma classificação Gauss de aproximadamente 3.000 para induzir isquemia na pele de orelha de rato. Nota: Neste caso, a face de covinhas dos imans denotes seu pólo norte. </li><li> Encaixar os ímãs em suas guias de plástico individuais. Nota: O guia de plástico serve para facilitar a colocação e a separação dos imans de alta resistência. Devido à sua forte força magnética ainda uma baixa resistência à ruptura, não coloque imans individuais em estreita proximidade uns com os outros ou com outros metais. Sucata e fragmentação pode ocorrer se eles puxam para o outro. </li><li> Posicionar o primeiro (dorsal) imã de tal forma que apenas a borda está em contacto com o segundo (ventral) ímã (Figura 3a) Nota: Isto evita que os ímãs de encaixe juntos antes de terem sido devidamente posicionado. </li><li> Posicione os dois ímãs de tal modo que o íman ventral está acomodada na orelha (Figura 3a). Nota: Antes de isquemia é induzida, garantir que o mouse é mantida a 37 ° C e que a anestesia suficiente é mantida (veja o passo 2.2). </li><li> Depois de pronto, cuidadosamente deixar os ímãs vêm juntos (Figura 3a </strong&gt;). Nota: Para fins de imagiologia, clamp apenas metade da orelha de modo que pode ser observada uma IR e região não-IR. </li><li> Após 1,5 h de isquemia, remover os imans rodando os imans de distância umas das outras utilizando as guias de plástico, permitindo a reperfusão a ter lugar. Nota: É preciso ter cuidado para evitar que as orelhas fiquem enrugados quando os ímãs são colocados. Isquemia incompleta é evidente se os vasos sanguíneos major macroscopicamente visíveis re-orvalhar imediatamente (ou seja, o sangue enche os vasos imediatamente) depois que os ímãs são removidos. Embora a reperfusão não ocorre imediatamente após a remoção dos ímans, oclusão de vasos sanguíneos é de apenas transitória. Como tal, é imperativo para preparar a orelha de rato para geração de imagens tão rapidamente quanto possível. </li></ol> 5. A injeção de agentes de marcação do navio de sangue <ol><li> Imediatamente após a remoção ímã, administrar por via intravenosa (via retro-orbital ou injeção na veia da cauda) azul de Evans (10 mg mL -1em PBS ou solução salina; 1 mL g -1 de peso corporal) ou outro agente de rotulagem vaso sanguíneo de escolha. Nota: Antes da injecção, certifique-se que a anestesia suficiente ainda é mantida através da realização de beliscar toe suave. </li></ol> 6. Colocação da orelha sobre a plataforma de imagem <ol><li> Corte 2 pedaços de fita adesiva com 1,5 cm de comprimento e 1,8 cm de largura. </li><li> Permitir que os lados adesivas para ficar juntos mesmo tempo que deixa cerca de 1 mm de adesivo ao longo da sua largura. </li><li> Cortar a fita adesiva em duas partes, no sentido do comprimento, para acomodar a sua colocação no interior da fenda na plataforma orelha. </li><li> Inserir esta fita adesiva sobre a meio caminho através da fenda, de modo que o lado adesivo virado para cima. </li><li> Posicione o mouse sobre a almofada de aquecimento, de modo que o ouvido a ser trabalhada fica ao lado da tira de fita adesiva. </li><li> O uso de dois aplicadores de algodão-tip PBS-umedecidos, pressione suavemente o ouvido contra a fita adesiva. </li><li> Utilizando a tira de guia, trazer a orelha de ratoatravés da fenda enquanto ajusta simultaneamente o mouse para mais perto do palco. </li><li> Para remover a fita adesiva, o primeiro adicionar uma gota de PBS para reduzir a aderência da fita. </li><li> Separe a orelha de rato a partir da fita adesiva o mais suavemente possível usando um pincel fino. </li><li> Achatar a orelha contra a plataforma de ouvido rolando delicadamente um aplicador de algodão-ponta úmida sobre a orelha. </li><li> Colocar uma gota de PBS por baixo da lamela (que é mantido em posição no suporte da lamela utilizando massa lubrificante; Figura 2) e colocá-lo suavemente sobre a orelha. Complete com mais PBS, se necessário. Nota: O titular lamela aumenta a estabilidade durante o exame. </li><li> Inserir a sonda de temperatura rectal e ligar os fios para o sistema de aquecimento de acordo com as instruções do fabricante. Nota: Ajustar a temperatura da almofada de aquecimento do corpo a 37 ° C e a plataforma fase orelha a 35 ° C. </li></ol> 7. Multiphoton Microscópio Sete parâmetros de imagem Nota: Este protocolo usa um único feixe, multiphoton microscópio com um ajustável (680 - 1080 nm) Ti: Sa laser (3,3 W a 800 nm; comprimento de pulso de 140 fs; taxa de repetição de 80 MHz) com um objetivo 20X água (NA = 1.0) para estudos de imagem intravital. <ol><li> Abra o software de imagem. </li><li> Alinhar a laser de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Ajustar o comprimento de onda de excitação a 950 nm. Nota: GFP e azul Evans pode ser ao mesmo tempo animado em 950 nm. </li><li> Para visualização, use as seguintes configurações: 500 mm 2 scanfield, pixel de resolução 505 x 505, e uma frequência de varredura de 800 Hz em uma única varredura de linha. Clique em &quot;Preview&quot;. </li><li> Alternar o poder atenuador (laser). Assegurar que todos os sinais essenciais são apanhados, sem expor o campo de imagem a quantidades excessivas de potência do laser, o que pode induzir danos provocados pelo calor. Nota: Comece com uma potência baixa atenuador e aumentar se o signal é fraca. Como neutrófilos estará ausente do interstício no início do tempo de pós-reperfusão aponta, os macrófagos podem ser utilizadas como um indicador para determinar a potência mínima exigida, já que são mais escuro do que os neutrófilos. Nota: Se essa etapa é para ser feito, pela primeira vez, ajuste as configurações na zona de não-isquêmica, onde se espera que a integridade vascular intacta e facilitará a definição do poder atenuador. Em experiências posteriores, estas definições não exigem muita modificação, a menos que a potência do laser é instável. </li><li> Ajustar as configurações PMT. Nota: Verifique com o fabricante para a tensão de ganho ideal máxima para o PMT. Ajustando a tensão PMT para além do limite recomendado vai resultar em uma maior proporção de sinal-para-ruído. A recomendação geral é para definir a tensão de ganho de PMT para o limite recomendado e para aumentar o poder atenuador conforme necessário, caso o sinal seja muito fraca. </li><li> Selecione uma região de imagem que está em estreita proximidade coma borda da isquemia, caracterizado por o vazamento de azul de Evans em massa. </li><li> Recolha GFP e os sinais azuis Evans utilizando 525/50 passa banda (PA) e 655/40 filtros BP, respectivamente. Para sinais de geração de segundo harmônico (SHG) de fibras de colágeno dentro do compartimento dérmico, use um filtro 475/42 BP. </li><li> Crie uma pasta para guardar as imagens em um formato que seja compatível para o software de análise de imagem disponível. </li><li> Para adquirir, utilizar as seguintes definições: 500 mm 2 scanfield, 505 x 505 pixels de resolução e uma varredura de frequência de 400 Hz em uma única varredura de linha. </li><li> A 100 ^ M-Z-pilha com um tamanho de passo de 4 mm pode ser adquirida repetidamente ao longo do tempo, em intervalos de 1 min, para controlar a infiltração de neutrófilos. Nota: Especialmente para leucócitos (por exemplo, neutrófilos) com uma velocidade de migração mais elevada, um intervalo que é maior do que 1 min pode resultar em dificuldades na análise de seguimento célula. Neste caso, o utilizador pode reduzir a espessura da ACaqui- empilhar ou aumentar a frequência de varredura. Nota: Embora a pilha de aquisição necessária da zona de isquemia pode parecer menor como resultado da compressão (caracterizado, alternativamente, por uma intensidade mais elevada SHG), reperfusão subsequente resultará na inflamação maciça que faz com que a orelha para inchar. desvios significativos na direcção Z são esperados. Como tal, a aquisição de um grande Z-pilha é necessária para acomodar a deriva. </li><li> Durante toda a imagem, completar o PBS e água regularmente para manter a orelha úmida e a lente objetiva imersa em água. Nota: Uma experiência típica geralmente dura por 2-4 h. Dependendo do desenho experimental, e juntamente com um regime de anestesia bem controlado, prolongar a duração das imagens é possível. </li></ol> 8. concluir o experimento <ol><li> Euthanize o mouse por asfixia com dióxido de carbono de acordo com a instituição Comitê Animal Care Institucional e Uso (IACUC) procedures. Nota: Sempre eutanásia o mouse por métodos aprovados conforme determinado por regras, regulamentos e diretrizes da instituição. Se imaging repetido é necessário, manter o mouse sobre a almofada de aquecimento até que a anestesia desgasta fora. Uma vez que o rato recuperou a consciência suficiente e é móvel, devolver o mouse para sua gaiola. </li></ol> Análise 9. Imagem Nota: Os dados gerados a partir do experimento de imagem podem ser visualizados por diferentes pacotes de software. <ol><li> Abra o software de análise de imagem. </li><li> Sob Ultrapasse Mode, importar o arquivo (Open → selecionar qualquer arquivo na pasta desejada → clique em &quot;Abrir&quot;). </li><li> cores Editar pseudo se as cores padrão não se aplicam (ajuste Editar → Visor → Sob a guia de canais, selecione a cor desejada na paleta de cores). </li><li> Ajustar o brilho, o contraste e fundo (Edit → visualização de ajuste → Alternar Max e valores min). </li&gt; <li> Certifique-se de que as dimensões do arquivo estão corretos (propriedades Editar → Imagem → Na guia geometria, verificar o tamanho do voxel. Neste protocolo, X = 0,99, Y = 0,99 e Z = 4). Nota: Derive X e Y, dividindo a dimensão scanfield pela resolução de pixel. Z é a espessura entre cada fatia. Nota: A produção destes conjuntos de dados podem ser apresentados como filmes máximos de projecção. Nota: análise de rastreamento é necessário para caracterizar completamente as atividades celulares e interações a fim de compreender a sua função in vivo. As instruções detalhadas de acompanhamento de célula usando a função local disponível no software pode ser encontrado no protocolo em 15 de Referência. Nota: Há muitas formas de quantificar a migração de leucócitos, cujos detalhes podem ser encontrados no artigo de revisão em 16 de Referência. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Significado IR é uma das principais causas de úlceras de pressão pele. Os estágios iniciais (I e II) de úlceras de pressão descrevem a condição da pele humana (em comparação com os tecidos subcutâneos subjacentes e músculos). No entanto, uma compreensão da etiologia imunológica ainda está em falta. Aqui, apresentamos um modelo de IR simples e robusto na pele de orelha de rato, a fim de resolver esta lacuna. Nós simular a isquemia por clampeamento da orelha de rato entre dois ímãs e, posteriorme...

lesão de isquemia-reperfusão (IRI) ocorre quando há uma hipoxia transitória devido à obstrução do fluxo sanguíneo (isquemia), seguido por uma subsequente re-oxigenação dos tecidos (reperfusão). Na pele, isquemia-reperfusão (IR) é pensado para ser um dos fatores que contribuem para a fisiopatologia das úlceras de pressão, onde repouso prolongado predispõe os pacientes do hospital de longo prazo para a lesão. Nesses pacientes, a pele e os músculos subjacentes são constantemente expostos a pressão do peso exercido sobre áreas de proeminência óssea, resultando em lesões localizadas que, se não tratada, pode tornar-se necrótica 1. Os danos envolvidos em um IRI são duas. Durante a isquemia, a oclusão de vasos sanguíneos conduz a uma redução drástica da entrega de oxigénio aos tecidos. Isto resulta numa diminuição de ATP e pH, que inactiva ATPases envolvidas no metabolismo celular. Por sua vez, os níveis de cálcio celular pico, e salientou ou danificado cells sofrem apoptose ou necrose 2. A liberação de conteúdo intracelular ou padrões moleculares danos associados (DAMP), como HMGB1, contribui para a resposta inflamatória 3. O segundo insulto ocorre durante a reperfusão. Embora os níveis de oxigénio e de pH são restaurados durante a reperfusão, isto resulta na geração de espécies reactivas de oxigénio (ROS), o que leva à oxidação de lípidos intracelulares, DNA e proteínas. Por conseguinte, os mediadores pró-inflamatórios são activados, o que desencadeia uma resposta inflamatória secundária que envolve o recrutamento das células imunes para o local inflamatório 2. Enquanto a cascata de acontecimentos bioquímicos que conduzem à resposta inflamatória tem sido bem descrito, a regulação espacial e temporal das actividades celulares imunitárias não são bem compreendidos. Aqui, descrevemos um modelo IR robusta na pele de orelha de rato usando simples aperto ímã. Juntamente com a imagem multiphoton intravital (MP-IVM), nósestabeleceu um modelo para estudar as respostas inflamatórias in vivo que ocorrem após a reperfusão ocorre. A lógica por trás do desenvolvimento e uso desta técnica é tentar entender como ambas as células intersticiais e infiltrando responder a IR em tempo real. Modelos existentes de IR utilizando a técnica de fixação na lateral da pele são altamente invasivo, uma vez que exigem a implantação cirúrgica de placas de aço no flanco da pele, tornando-os menos do que o ideal para estudos imunológicos 4. Uma técnica de fixação não-invasiva semelhante foi descrito na pele do rato 5,6 flanco. No entanto, devido à incorporação da componente de imagem intravital neste método, que em vez escolheu a pele da orelha como o local de IR alvo, uma vez que contorna os movimentos devidos à respiração e oferece estabilidade durante a imagiologia de 7,8. Além disso, subconjuntos de leucócitos que se estendem por o interstício são idênticos entre a pele da orelha e o flanco da pele, embora onúmeros e proporções podem variar ligeiramente 9. Assim, a pele da orelha representa um local de imagem ideal. Além disso, a maioria dos dados obtidos a partir destes modelos IRI são limitadas a avaliações macroscópicas (classificação de úlceras) e análises microscópicas de endpoint indicadores inflamatórios 10. Utilizando este modelo, a visualização em tempo real, da resposta celular de neutrófilos após a reperfusão na pele de um rato repórter fluorescente é activado. Um modelo de imagem da orelha intravital publicado anteriormente é utilizado 8 com modificações adicionais (Figuras 1, 2).

<table><tbody><tr><td colspan="4">Cepas de camundongos</td></tr><tr><td>Lysozyme-GFP C57BL/6</td><td>Thomas Graf, Centro de Regulação</td><td></td><td></td>Genômica</tr><tr><td>C57BL/6-C2J</td><td>Jackson Laboratories</td><td>000058</td><td>Para ser cruzado com Lysozyme-GFP para gerar Lysozyme-GFP albino para imagens da</td></tr><tr> pele<td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Viaflex 0,9% (peso / volume) solução salina</td><td>Baxter Healthcare</td><td>F8B1323</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina (100 mg mL &minus; 1 cloridrato de cetamina</td><td>Parnell</td><td></td><td>A cetamina é uma droga controlada e todas as regulamentações locais relevantes devem ser seguidas</td></tr><tr><td>Ilium Xylazil-20 (20&nbsp; mg&nbsp; mL&minus; 1 cloridrato de xilazina)</td><td>Troy Laboratories</td><td></td><td>Xylazil-20 é um medicamento controlado e todos os regulamentos locais relevantes devem ser seguidos.</td></tr><tr><td>Evans azul (10&nbsp; mg&nbsp; mL&minus; 1 em PBS ou solução salina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46160</td><td></td></tr><tr>Água <td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>ultrapurificada<td colspan="4">Equipamento</td></tr><tr><td>Seringa de insulina com agulha</td><td>BD</td><td>328838</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferência</td><td>Biologix Research Company</td><td>30-0135</td><td></td></tr><tr><td>Fita adesiva de papel 3 M</td><td>3M</td><td>2214</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de cobertura do microscópio Deckglaser (22 mm e vezes; 32 mm)</td><td>Paul Marienfeld</td><td>101112</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de lasca curva</td><td>Aesculap, B. Braun Melsungen</td><td>BD312R</td><td></td></tr><tr><td>Creme de depilação Veet</td><td>Reckitt Benckiser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores médicos com ponta de algodão</td><td>Puritan Medical Products Company</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Toalhas dobráveis em C</td><td>Kimberly-Clark</td><td>20311</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes lenços delicados para tarefas</td><td>Kimtech Science</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Ímãs de neodímio banhados a ouro, grau N42, 12 mm de diâmetro e 2 mm de espessura&nbsp;</td><td>first4magnets</td><td>F656S</td><td></td></tr><tr><td>Guia de plástico, 10 cm por 1,5 cm (material de cloreto de polivinila)</td><td></td><td></td><td>dobrado ao meio no sentido do comprimento, encadernação com fita adesiva e ímã de ranhura em</td></tr><tr><td>graxa de alto vácuo</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Microscópio</td></tr><tr><td>TriM Scope II microscópio de dois fótons de feixe único</td><td>LaVision BioTec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ajustável (680&ndash; 1.080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:laser de safira (&ge; 3,3 W a 800 nm; comprimento de pulso de 140 fs, taxa de repetição de 80 MHz)</td> <td>Objetivas coerentes</td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>imersão em água (20 &vezes;, NA = 1,0)</td> <td>Olympus</td><td>XLUMPLFLN20xW</td><td></td></tr><tr> < td colspan = "4 ">Miscroscope filter and mirror sets (para imagens GFP, SHG, Evans Blue) </td></tr> <tr><td>495 Chroma de passagem longa</td><td></td><td>T495LPXR</td><td></td></tr><tr><td>Chroma de 560 lomg pass</td><td></td><td>T560LPXR</td><td></td></tr><tr><td>475/42 passagem de banda</td><td>Semrock</td><td>FF01-475 / 42-25</td><td></td></tr><tr><td>525/50 passagem de banda</td><td>Chroma</td><td>ET525 / 50m</td><td></td></tr><tr><td>655/40 passagem de banda</td><td>Chroma</td><td>NC028647</td><td></td></tr><tr><td colspan = "4 ">< forte > plataforma de estágio de imagem da pele (consulte o diagrama para montagem) < / forte ></td></tr> <tr><td>Uma placa de base de metal (126 mm e vezes; 126 mm e vezes; 1 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uma plataforma de latão para a orelha (79 mm &vezes; 19 mm; 1 mm de espessura na lateral, 0,5 mm de espessura no meio; <forte>Figura 1</forte>) com fenda (1,7 mm &vezes; 1 mm; 1,5 mm de distância da borda longa)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dois blocos de plástico (10 mm de altura)&mdash; para isolamento</td><td></td><td></td><td></td>térmico</tr><tr><td>Suporte curvo, para posicionar o termistor de controle na plataforma</td><td></td><td></td><td></td>auricular</tr><tr><td>Cabo de interface CC-28 com conector DIN e termistores, um para o controle de temperatura e outro para o monitor de temperatura</td> <td>(Warner Instruments (Harvard Apparatus)</td><td>640106</td><td>conecte o cabo de interface a ambos os blocos de aquecimento resistivos ajustados em 35 & C</td></tr><tr><td>Blocos de aquecimento resistivos RH-2</td> <td>(Warner Instruments (Harvard Apparatus)</td><td>640274</td><td>Os blocos de aquecimento resistivos podem aquecer a plataforma de latão com orelha de até mais de 100 &graus; C em poucos minutos. Certifique-se de que o termistor de controle esteja devidamente preso no suporte para evitar superaquecimento.</td></tr><tr><td>Controlador de temperatura TC-344B para a plataforma de ouvido</td> <td>(Warner Instruments (Harvard Apparatus)</td><td>640101</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura TR-200 para almofada de aquecimento do mouse</td><td>Ferramentas de Fine Science</td><td>21052-00</td><td>A unidade não está mais à venda. Peça alternativas ao fabricante Fonte</td></tr><tr><td>de alimentação para TR-200</td><td>Fine Science Tools</td><td>21051-00</td><td>A unidade não está mais à venda. Peça alternativas ao fabricante Almofada</td></tr><tr><td>de aquecimento</td><td>Fine Science Tools</td><td>21060-00</td><td>A unidade não está mais à venda. Pergunte ao fabricante por alternativas.&nbsp;</td></tr><tr><td>Sonda retal animal&nbsp;</td><td>A unidade Fine Science Tools</td><td>21060-01</td><td>não está mais à venda. Pergunte ao fabricante por alternativas. Depois de conectar a sonda retal e a almofada de aquecimento ao controlador de temperatura TR-200, ajuste a temperatura para 37 > C</td></tr><tr><td colspan="4">Porta-lamínula</td></tr><tr><td>2 hastes de plástico, 1 cm de diâmetro, 10 cm de comprimento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 adaptador de plástico com furos perfurados para acomodar hastes (consulte o diagrama)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 parafusos de aperto de plástico para manter as hastes de plástico no lugar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 placa de metal, 6 cm x 2,5 cm, com um corte quadrado de 2 cm em 1 extremidade, 2 mm de borda longe da borda</td><td></td><td></td><td></td>curta</tr><tr><td>1 par de porca e parafuso para prender a placa de metal à haste</td><td></td><td></td><td></td>de plástico</tr><tr><td>1 base de acrílico (4 cm x 5 cm x 1,5 cm) com ímã para segurar o suporte de lamínula na plataforma do estágio de imagem da pele. 1 haste é fixada permanentemente na base.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software de análise de imagem</td></tr><tr><td>Imaris v8.1.2</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

induzindo a lesão de isquemia-reperfusão na pele da orelha de rato por intravital multiphoton imagem de respostas imunes

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

A lesão de isquemia-reperfusão (IRI) ocorre quando há hipóxia transitória devido à obstrução do fluxo sanguíneo (isquemia) seguida de uma subsequente reoxigenação dos tecidos (reperfusão). Na pele, a isquemia-reperfusão (RI) é o principal fator contribuinte para a fisiopatologia das úlceras por pressão. Embora a cascata de eventos que levam à resposta inflamatória tenha sido bem estudada, as respostas espaciais e temporais dos diferentes subconjuntos de células imunes a uma lesão de IR não são bem compreendidas. Os modelos existentes de IR usando a técnica de pinçamento no flanco da pele são altamente invasivos e inadequados para estudar as respostas imunes à lesão, enquanto estudos semelhantes de pinçamento magnético não invasivo no flanco da pele são menos do que ideais para estudos de imagem intravitais. Neste protocolo, descrevemos um modelo robusto de RI não invasiva desenvolvido na pele da orelha de camundongo, onde pretendemos visualizar em tempo real a resposta celular das células imunes após a reperfusão via imagem intravital multifotônica (MP-IVM).

Esse protocolo utiliza uma pele de orelha de plataforma de imagem-construído sob encomenda, como se mostra na Figura 1. Várias características desta plataforma são projetados especificamente para facilitar a imagem, mantendo as configurações fisiológicas. Colocar a orelha na plataforma de bronze aquecida não só mantém a orelha a uma temperatura fisiológica de 35 ° C, mas também a partir de isolados do ouvido movimentos inevitáveis ​​devidas à respiração. A adição de um c...

Este protocolo descreve a indução de um modelo de isquemia-reperfusão (IR) em pele de orelha de rato usando íman de fixação. Usando um modelo de imagens intravital custom-built, estudamos nas respostas inflamatórias in vivo pós-reperfusão. A lógica por trás do desenvolvimento desta técnica é ampliar a compreensão de como leucócitos responder a uma lesão IR pele.

Induzindo a lesão de isquemia-reperfusão na pele da orelha de rato por Intravital Multiphoton imagem de respostas imunes

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

O objetivo geral deste experimento é compreender como as células imunes respondem à isquemia e reperfusão por meio da imagem multiphotônica intravital da pele da orelha de camundongo. Este método pode ajudar a responder algumas das questões mais importantes na área de Imunologia e Dermatologia, para entender o comportamento dinâmico das células imunes. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece um modelo de imagem robusto para estudar atividades celulares na pele em estado inflamado ou em repouso.Embora este método possa fornecer informações sobre lesões por isquemia e reperfusão, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como reações de hipersensibilidade, bem como infecções. Para iniciar este procedimento, coloque o camundongo sobre uma placa aquecida para manter sua temperatura corporal em 37 graus Celsius durante todo o procedimento de preparação. Confirme a profundidade da anestesia pela ausência do reflexo de pinçamento dos dedos dos pés.Em seguida, aplique um lubrificante oftálmico nos olhos do animal para prevenir ressecamento durante a anestesia. Depois, aplique cuidadosamente creme depilatório no terço superior das duas orelhas dorsais e aguarde dois a trê

inducing-ischemia-reperfusion-injury-mouse-ear-skin-for-intravital

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este vídeo demonstra a técnica de microscopia de fluorescência intravital para estudar a formação de trombos em um modelo de camundongo. O camundongo é injetado com um polissacarídeo marcado com fluoróforo para monitorar a circulação sanguínea. Após a iluminação com uma luz de alta intensidade, a indução fototóxica de uma lesão na microvasculatura da orelha leva à formação de um trombo, que é confirmado pela visualização da obstrução no fluxo sanguíneo.

Microscopia de fluorescência intravital para estudar a formação de trombos microvasculares

A matriz extracelular sofre remodelação substancial durante a cicatrização de feridas, inflamação e tumorigênese. Nós apresentamos uma abordagem microscopia de imunofluorescência intravital romance de visualizar a dinâmica de fibrilar, bem como componentes da matriz de malha-like com resolução espacial e temporal alta usando epifluorescência ou microscopia de dois fótons.

Longo prazo intravital Imunofluorescência imagem do tecido componentes da matriz com epifluorescência e microscopia de dois fótons

Os mecanismos que regulam a motilidade intersticial de células T efectoras CD4 em locais de inflamação são relativamente desconhecidos. Apresenta-se uma abordagem não invasiva para visualizar e manipular em células T CD4 + in vitro -primed na derme da orelha inflamado, permitindo o estudo do comportamento dinâmico destas células in situ.

Migração intersticial imagens de células CD4 T na derme inflamadas

Este protocolo atual emprega repórteres fluorescentes, marcação in vivo e técnicas de imagem intravital para permitir o monitoramento do processo dinâmico de priming de neutrófilos em animais vivos.

Imagem intravital de neutrófilos Priming Usando IL-1-driven promotor DsRed Mice Reporter

O modelo orelha do rato SKH1-hr hr sem pêlos permite a microscopia de fluorescência intravital da microcirculação e indução trombo fototóxico sem preparação cirúrgica prévia no leito microvascular examinado. Portanto, a orelha do rato sem pêlo é um excelente modelo in vivo para estudar as interacções complexas durante a formação do trombo microvascular, evolução de trombos, e trombólise.

Intravital Microscopia e trombo Indução no lóbulo da orelha de um rato calvo

Estabelecemos um protocolo cirúrgico romance para a imagem latente de dois fotões de fígado de ratos ao vivo com invasão mínima. Com esta técnica, identificamos a estrutura detalhada do fígado durante endotoxemia induzidas pelo lipopolissacarídeo. Nós antecipamos que este método pode ser utilizado para determinar a eficácia de vários tratamentos de reagentes para migração de leucócitos hepática.

Imagem de Intravital dois fotões de leucócitos durante a resposta imune em fígado de rato lipopolissacarídeo-tratados

A imagem in vivo é uma ferramenta poderosa para o estudo da biologia na saúde e na doença. Este protocolo descreve imagens transpupilares da retina de camundongos com um microscópio padrão de dois fótons. Também demonstra diferentes métodos de imagem in vivo para marcar fluorescentemente múltiplas coortes celulares da retina.

Imagem transpupilar de dois fótons in vivo da retina do rato

O recrutamento de leucócitos e plaquetas constitui um componente essencial necessário para o crescimento efetivo das artérias colaterais durante a arteriogênese. A microscopia multifóton é uma ferramenta eficiente para rastrear a dinâmica celular com alta resolução espaço-temporal in vivo e menor fototoxicidade para estudar o recrutamento e extravasamento de leucócitos durante a arteriogênese.

Imagem Intravital Multifóton para Monitoramento do Recrutamento de Leucócitos durante a Arteriogênese em Modelo de Membro Posterior Murino

A migração de neutrófilos depende da remodelação rápida e contínua da membrana plasmática em resposta ao quimioatraente e suas interações com o microambiente extracelular. Descrito aqui é um procedimento baseado em Microscopia Subcelular Intravital para investigar a dinâmica de remodelação da membrana em neutrófilos injetados na orelha de camundongos anestesiados.

Imagem da migração de neutrófilos na pele de camundongos para investigar a remodelação da membrana subcelular em condições fisiológicas

O protocolo apresenta uma nova ferramenta para simplificar a obtenção de imagens intravitais usando microscopia confocal invertida.

Abordagem simplificada de imagem intravital para monitoramento de longo prazo da dinâmica do tecido epitelial em um microscópio confocal invertido

Este estudo apresenta uma abordagem in vivo de imagem de dois fótons para visualizar as estruturas dos terminais axônicos de mecanorreceptores de baixo limiar (LTMR) na pele da pata dianteira de camundongos. Utilizando imagens repetidas e de alta resolução de axônios individuais, esse método oferece uma nova plataforma para estudar a estrutura e a função do circuito sensorial cutâneo durante o desenvolvimento e em adultos.

Imagem Intravital de Dois Fótons da Morfologia do Axônio Sensorial de Toque em Pele de Camundongos

Aprenda a induzir lesão de isquemia-reperfusão na pele da orelha de camundongo usando pinçamento magnético e imagem intravital multiphoton. Este método permite observar em tempo real as respostas inflamatórias e o comportamento dinâmico das células imunes em modelos de Imunologia e Dermatologia.

Induzindo a lesão de isquemia-reperfusão na pele da orelha de rato por Intravital Multiphoton imagem de respostas imunes

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