Неинвазивная 3D-визуализации с суб-микронных Резолюция Использование синхротронного рентгеновского томографии

Животных, используемых в данном исследовании

Образцы партеногенетических панцирных клещей Archegozetes longisetosus (Acari, Oribatida) взяты из нашей лаборатории культуры. Культура растет на гипс / уголь смесь (9:1) в пластиковые банки, в постоянной темноте при 20-23 ° С около 90% влажности воздуха.

Пробоподготовка

1. Образцы были взяты из культуры, чистить мягкой щеткой и помещен в 6:03:01 смесь 80% этанола, 35% формальдегида и 100%-ной уксусной кислотой в течение 24 часов.
2. После этого образцы были обезвожены в серии градуированных этанола на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% и 100% с 3 изменений при каждой концентрации, и в 10 минутах между ступенями.
3. Наконец, образцы помещались в пресной 100% этилового спирта в ночное время и критическая точка сушат в CO ₂ (CPD 020, Balzers). Высушенные образцы были прикреплены к кончику пластмассовых штифта (1,2 см длиной, 3,0 мм в диаметре).

Синхротронное рентгеновской томографии

Рентгеновской томографии была выполнена в beamline ID19 (ESRF, Гренобль, Франция, эксперимент SC-2127).

1. Образцы были установлены в стаканчик и доводили до центрального положения в пучке.
2. Образцы были измерены с энергией 20,5 кэВ. Рентгенограммы были записаны с охлаждением ПЗС (ESRF Фрелон камеры) с 14-битным динамическим диапазоном, 2048 × 2048 пикселей и эффективный размер пикселя 0,7 мкм. 1500 прогнозы были зарегистрированы более 180 вращения образца ° с временем экспозиции 0,35 с для каждой проекции. Детектора к образцу расстояние 20 мм.

Использование определенного расстояния между образцом и детектором позволяет дифференциальных визуализации материалов с низкой рентгеновской коэффициентов затухания (Cloetens и соавт. 1996), который будет производить недостаточная контрастность изображения в поглощении (где образец расположен непосредственно перед детектором ). Большинство биологических вопросы фазовых объектов, состоящий из материалов с низким поглощения и / или только небольшие различия в атомный номер (Бец, и соавт. 2007). Однако, фаза расширенной томографии требует высокой пространственной когерентности однородного пучка рентгеновских лучей. Таким образом, синхротронное излучение лучше подходит, чем настольных сканеров для такого рода измерений.

Анализ данных

1. В результате 2D рентгенограммы были преобразованы в 3D воксела данных (8-бит серого значений) с фильтром резервного проекции алгоритм (Cloetens и соавт., 1997)
2. Воксела данные были проанализированы с помощью программного обеспечения VGStudio Макс 1.2.1. (Том Графика, Гейдельберг, Германия).
3. Серый значения от фона были удалены из гистограммы для 3D-визуализации.
4. Предустановленные камеры пути были использованы для создания вращательного анимации и анимационных плоскостей отсечения.
5. Определяемые пользователем пути камеры была создана следовать пищеварительной системы А. longisetosus.

В этой презентации, мы сосредоточились на 3D-визуализации внутренней анатомии chelicerate микро-членистоногих. Синхротронного рентгеновского измерения позволяют пикселей разрешением до 0.3 мкм, в зависимости от размера выборки. Здесь мы показали данные с 0.7μm пикселей разрешение. Как правило, синхротронного рентгеновской томографии могут быть полезны для анализа малых биологических материалов (или ткани) с низкой рентгеновского поглощения. Пикселей, что почти достигает обычного светового микроскопа. Техника может быть применена к любому виду материал, для которого внутренняя организация представляет интерес и которые не должны быть уничтожены секционирования. Гистологические срезы, однако, имеет то преимущество, что ткани могут быть окрашены дифференцированно, что невозможно с рентгеновской томографии. Но здесь, различных серо-значения соответствуют тканей с разными рентгеновских затухание, и серо-распределения значений можно расширить с помощью количественных томографии фазы (holotomography;. Cloetens и др., 1999; Heethoff & Cloetens, 2008). Техника синхротронного рентгеновской томографии необычайно ценной из-за следующих причин:

1. пробоподготовки просто и ограничивается фиксации и сушки, не гистологических срезов необходимо
2. Метод является неинвазивным: внутренняя организация образце можно наблюдать в естественном состоянии
3. в результате данных могут быть проанализированы в любой желаемой ориентации, которая отличается от гистологических срезов, где разделы крепятся к одной ориентации.

Мы предлагаем рассмотреть эту технику, когда внутренние структуры в естественном состоянии небольших образцов или образцов, которые не должны быть уничтожены (например, окаменелости в янтаре или типа образцов) должны быть проанализированы. Конечно, эта методика не ограничивается биологическими материалами, но здесь она имеет большое преимущество благодаря возможности анализа материалов с Х-лучей, которые имеют низкую рентгеновского поглощения.