במבחנה פליטת אור הדמיה vivo ג'ין הכתב של בתאי גזע עובריים אנושיים

1. בנייה של ג'ין Fusion פעמיים Reporter
   1. כדי לבצע הדמיה של פליטת אור בתאי גזע עובריים אנושיים, תחילה עליך להשיג תאים ביציבות להביע גן הכתב בלוציפראז כגון בלוציפראז גחלילית מונע על ידי האמרגן מכוננת כמו היוביקוויטין או EF1a.
   2. ההתמקדות של פרוטוקול זה על יישומים גן הכתב, כך נהלים מפורטים לא ניתנים כאן. עם זאת, האסטרטגיה הכללית של המעבדה שלנו היא להשתמש היתוך כפול לבנות וקטור המכיל גחלילית בלוציפראז (fluc) משופרת חלבון הפלואורסצנט הירוק (egfp) מופרדים על ידי spacer בתוך pCDNA 3.1 +.
   3. בקצרה, גן היתוך כפול שלנו נמצא במקור הזרם של האמרגן ציטומגלווירוס ב pCDNA 3.1 (+), כך בקטע 3.3 kbp היה נכרת באמצעות NdeI ו NotI העיכול סוף בוטה-ligated לתוך האתר שיבוט מרובות של SIN (עצמית inactivating ) וקטור lentiviral, תחת שליטה של ​​מקדם יוביקוויטין.
      
      
2. Lentiviral התמרה
   1. hESCs ניתן transduced 3-5 ימים לאחר מעבר על ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 10 (כייל ויראלי של כ 107 מודגרות עם 106 תאים).
   2. המניה ויראלי מופשר ניתן להוסיף ישירות המדיה hESC טריים.
   3. רענן התקשורת 12 ו - 24 שעות לאחר מכן.
   4. לאחר 48 שעות, יעילות התמרה יכול להעריך על ידי איכותית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לאחר מכן, FACS ניתן להשתמש כדי לבודד תאים נגועים.
      
      
3. Culturing hESCs ומבוא הדמיה הקמה
   1. תרבות hESCs חיובי בלוציפראז שלך מזין ללא תנאים. אנחנו בדרך כלל לעקוב אחר הפרוטוקול הסטנדרטי WiCell ולהשתמש צלחות 6-היטב מצופה גורם גדילה מופחת Matrigel, או באמצעות אמצעי התקשורת מותנה או מסחריים, מזין ללא התקשורת.
   2. כדי לזהות את התאים חיובי בלוציפראז, תצטרך לקבל את הכתב בדיקה D-luciferin כבר מוכנה. כדי לעשות זאת luciferin, aliquot ב 1-1.5 ההכנות מ"ל בריכוז סופי של 45 מ"ג / מ"ל. שמור את aliquots ב -20 מעלות צלזיוס כאשר אינו בשימוש ולהימנע מחשיפה לאור על ידי כיסוי עם מגבת נייר כאשר לא אחסון.
   3. על מנת להמחיש את התאים חיובי בלוציפראז, אנו משתמשים IVIS 50 ו IVIS 200 מערכות דימות (Xenogen Corporation, Alameda, CA). מערכת זו האחרונה כוללת מנגנון isoflourane משולבת קאמרית אינדוקציה עבור הרדמה זמנית של חיות קטנות.
      
      
4. בשנת הדמיה חוץ גופית של פליטת אור hESCs
   1. עבור הדמיה פליטת אור חוץ גופית, חשוב לשמור על תנאים סטריליים. לכן, מערכת הדמיה צריך להיות סטרילי, רצוי בחדר תרבית תאים.
   2. לפני הדמיה, הסר את המדיה התא להוסיף PBS מספיק כדי לכסות את התאים. לדוגמה, להוסיף 1mL PBS היטב בכל צלחת 6-היטב המכילה תרבויות hESC שלך.
   3. יחס של D-Luciferin כדי PBS צריך להיות 1:100, אז להוסיף 10 μL של מופשר D-Luciferin היטב בכל צלחת 6-הבאר.
   4. המתן דקה אחת, ואז לקחת תמונה באמצעות זמן חשיפה של שנייה 1. אם האות חלש, להגדיל את מרווח החשיפה ונסה שוב.
   5. האות bioluminescent משקף מספר התא, כך מבחני quantitation יכול להתבצע המתואמים אות עם מספרים תאים שונים.
      
      
5. הכנה של העכבר על הזרקת תאים in vivo הדמיה
   1. כתב הגן הדמיה מספק שיטה תפוקה גבוהה, זול רגיש עבור תאים המעקב לאחר ההשתלה על ימים, שבועות ואפילו חודשים. זה חשוב במיוחד מאז בתאי גזע מושתלים לעתים קרובות בצורת teratomas, נדחות על ידי המערכת החיסונית של המארח, או פשוט למות.
   2. השיטה הפשוטה ביותר ליצירת תפלצת הדמיה in vivo היא להזריק hESCs המבטאים את הגן כתב בלוציפראז גחלילית לתוך גבם של עכברים SCID ולרכוש תמונות bioluminescent עם מערכת IVIS.
   3. כאשר אתה מוכן להשתיל את התאים, או להשתמש dispase collagenase כדי לשחרר את התאים, לשטוף כמה פעמים, להשעות אותם בתערובת 01:01 של גורם הגדילה מופחתת matrigel ו DMEM. בדרך כלל אנחנו הראשונים לערבב את התאים DMEM מקורר ולאחר מכן להוסיף matrigel. עבור כל אתר הזרקה תת עורית, אנו מזריקים 200,000 תאים תלוי בנפח 50-100 ul תערובת matrigel / DMEM. מספר התא יכול להיות מותאם בהתאם ליישום שלך. זכור לשמור את הכל על קרח לפני הזריקה.
   4. לאחר התאים מוכנים, להרדים את העכבר על ידי הצבת אותו בתיבה אינדוקציה עם הזרם isoflurane מופעלת. אחרי 1-5 דקות, העכבר ישנה ניתן להציב על שולחן הניתוחים עם isoflurane רציפה.
   5. כי באופן טבעי הפרווה אוטומטי מאיר ועלול לטשטש את התמונה bioluminescent, נצטרך להסיר את השיער מן הצד האחורי של העכבר. הדרך הקלה ביותר לעשות זאת היא להשתמש במכונת גילוח חשמלית, אבל אתה יכול גם להשתמש להסרת שיער ג'ל. נגבו עם אלכוהול לעקראת העור לאחר מכן
   6. בשלב הבא, להכין מתלה הנייד שלך מזרק. 23-27 מחטים מד העבודה הטובה ביותר מאז הם לא סותמים עם תאים. אם המחט גדולה מדי (<23 מד) את דרכי מחט עלול להשאיר חור גדול שדרכו תאים יכול לדלוף החוצה.
   7. להזריק את התאים מתחת לעור לחלק האחורי של העכבר. בגלל העור רופף למדי, השתמש באגודל ובאצבע לצבוט ולמתוח את האזור אתה רוצה להזריק. להזריק מתחת לעור, נזהרת שלא לנקב עמוק מדי. כמו כן, מנסה לשמור את המחט מלהחליק מתוך הזריקה בזמן מדכא על הבוכנה: זה ימנע יצירת חור בעור שדרכו התאים יכול לדלוף אם תנסה להזריק שוב.
   8. אחרי התאים מוזרקים, לחכות כמה שעות כדי לאפשר העכבר להתעורר להתרוצץ מחדש לפני הרדמה הדמיה פליטת אור. פעולה זו נמנע רעילות isoflurane.
      
      
6. פליטת אור בתחום ההדמיה vivo של התאים המושתלים
   1. עבור הדמיה חיה כל פליטת אור, אנחנו עושים זריקה intraperitoneal של D-luciferin במשקל מ"ג / ק"ג 375 הגוף. לשקול את בעל החיים כדי לחשב את המינון לפני הזריקה.
   2. להזריק את D-luciferin ב הצפק, ממש ליד קו האמצע. להיזהר לא להיכנס עמוק מדי או שאתה יכול לגרום נזק לאיברים פנימיים. אם העכבר מתחיל להתעורר, מקום אותו בתיבה בנוקאאוט ולחכות דקה או שתיים. עבור עכברים, פליטת אור מקסימלית מתרחשת בדרך כלל 15-40 דקות לאחר ההזרקה.
   3. זכור למקום נייר שחור מט בתיבת הדמיה לעזור לקלוט את כל האור הנפלטת לא hESCs. מניחים את העכבר (עד הישבן) בחדר הדמיה עם isoflurane, על גבי נייר שחור. התחלה עם זמן חשיפה של 10 שניות. אם אות רווי, לנסות ולהקטין את זמן החשיפה, אם חלש מדי, להגדיל את החשיפה.
   4. לאחר זמן חשיפה האות עבר אופטימיזציה עבור העכבר, להתחיל לקחת תמונות מכל רגע עד האות מגיע לשיא. הדבר נעשה כמיטב באמצעות תוכנת הדמיה כדי לבחור "אזורים של עניין (ROI)" כי לכסות אתרי הזרקה שלך. על ידי ניטור עוצמת האות בכל ROI כל אתה יכול בקלות לקבוע מתי האות מתחילה ירידה, המציין את עוצמת האות המקסימלי הושג. אות המקסימלי צריך לשמש הנתונים הסופיים שלך.
   5. כאשר אתה מרוצה עם התמונות שלך, הסר את העכבר מן isoflurane ולאפשר לו להתעורר בכלוב שלה. בדרך כלל, העכבר צריך להתעורר תוך 15 דקות.
   6. כתב פליטת אור הדמיה הגן ניתן לחזור על בסיס יומי, שבועי וחודשי ככל hESCs לשרוד החיה. אותות מן תפלצת רוחנית מתפתחת יגדל אקספוננציאלית לאורך זמן, בדרך כלל בסדר גודל של שבועות, כפי hESCs מתחילים להתרבות.
   7. לאחר הקורס הזמן הרצוי של תמונות פליטת אור נרכש, בעלי חיים עשוי להיות קורבן וקטעי רקמה המשמש היסטולוגיה.

לעומת שיטות אחרות כגון PET ו-MRI, פליטת אור בעל רזולוציה מרחבית מוגבלת חדירה לרקמות מופחת בשל האנרגיה חלשה יחסית של פוטונים הנפלטים (2-3 eV); מסיבות אלה יש עד כה לא היה רלוונטי בחיות גדולות. עם זאת, פליטת אור יש את היתרון של להיות בעלות נמוכה, תפוקה גבוהה, ולא פולשנית, מה שהופך אותו רצוי מאוד עבור תא גזע vivo מעקב אצל בעלי חיים קטנים. ללא פליטת אור גנים הכתב כגון בונה PET ו פלואורסצנציה ניתן להשתמש בשילוב עם בלוציפראז ליצור לכתב היתוך הגן מורכב תחומים שונים המכילים את הגנים כתב בודדים. לדוגמה, הקבוצה שלנו משתמשת היתוך מבנה המכיל fluc, monomeric חלבון פלואורסצנטי אדום (mrfp), ואת וירוס הרפס סימפלקס מקוצץ thymidine קינאז (ttk, גן הכתב PET) למעקב אחר אפנות רב של התנהגות בתאי גזע של בעלי חיים קטנים. במשך הזמן, גנים משולבים כתב ביציבות עשוי להיות כפוף להשתקת גנים באמצעות המנגנון כרומוזומליות אנדוגני. הרגישות הגן של הכתב כדי השתקת הגן קשורה קשר הדוק הבחירה של האמרגן נהיגה הביטוי שלה. למשל, האמרגן ציטומגלווירוס (pCMV) מושתק במהירות hESCs. במעבדה שלנו יש לו הצלחה טובים עם האמרגן היוביקוויטין-C האנושי (ערווה) לנהוג ביטוי היתוך כפול לבנות שורות תאים מרובים hESC, יש לצפות אובדן האות מינימלית לאורך זמן.

לסיכום, לפני hESC הנגזרות התחדשות התאים הופך להיות רלוונטיות קלינית, כמה מכשולים ביולוגיים בסיסיים שיש להתגבר עליו - כלומר מוות של תאים או אפופטוזיס לאחר השתלה של תאים מובחנים, היווצרות תפלצת רוחנית מתוך תאים שלא עברו התמיינות, וכן דחייה של מערכת החיסון על ידי האורגניזם המארח. אתגרים אלה ואחרים מדגישים את הצורך engraftment hESC מעקב, הישרדות, ועל התפשטות בתוך האורגניזם המקבל. פיתוח טכניקות הדמיה מולקולרית כגון הגן גחלילית בלוציפראז הכתב אולטרה רגיש מצלמות CCD איפשר פולשני, הערכה חוזרת ונשנית של מיקום התא, הגירה, שגשוג, והבחנה in vivo. טכנולוגיות כגון אלו יעזרו תרגום לדחוף הביולוגיה hESC מהמעבדה לכיוון יישומים קליניים.