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 JoVE General

공중 드롭 방법을 사용하여 마우스 배아 줄기 (MES) 세포의 체외 차별에

1, 1

1Division of Cardiovascular Medicine, Stanford University

Article
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    Summary

    이 동영상은 매달려 드롭 방법을 사용하여 embryoid 기관에 마우스 배아 줄기 세포의 체외 차별에 수행하는 방법을 보여줍니다.

    Date Published: 7/23/2008, Issue 17; doi: 10.3791/825

    Cite this Article

    Wang, X., Yang, P. In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method. J. Vis. Exp. (17), e825, doi:10.3791/825 (2008).

    Abstract

    줄기 세포는 다양한 세포 유형으로 개발하는 놀라운 잠재력을했습니다. 줄기 세포가 분할되면, 각각의 새로운 세포 중 줄기 세포 유지하거나보다 전문적인 기능을 세포의 다른 종류가 될 수있는 잠재력을 가지고, 과학의이 약속은 질병을 치료하는 세포 기반 치료법​​의 가능성을 조사하기 위해 과학자을 선도하고 있습니다. 언제 antidif​​ferentiation 요소없이 서스펜션의 문화, 배아 줄기 세포는 저절로 차별과 입체 다세포 합산를 형성하고 있습니다. 이러한 세포 집계는 embryoid 단체 (EB)라고합니다. 드롭 문화를 교수형에 처하는 것은 널리 사용 EB 형성 유도 방식입니다. 매달려 드롭의 둥근 바닥 MES 세포에게 성형 EBS를위한 좋은 환경을 제공할 수있는 ES 세포의 집합 수 있습니다. 교수형 드롭 aggregatied ES 세포의 숫자는 페트리 접시의 뚜껑에서 드롭으로 멈춘 것으로 초기 세포 현탁액에있는 세포의 수를 변화에 의해 제어할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 우리는 reproducibly ES 세포의 미리 정해진 숫자의 균질 EBS를 형성할 수 있습니다.

    Protocol

    1. 전에 37 ° C, 5 % CO 2 조직 문화의 인큐베이터 하룻밤 하루에 0.1 % 젤라틴 용액과 부화 플레이트를 사용하여 T75 휴대용 술병을 아교 질로 만들다.
    2. , 품어에서 MES의 세포를 꺼내서 매체를 대기음, PBS와 ES 세포 문화를 린스, 요리의 코트 바닥 (2 ml/100mm 판)에 0.05 %의 트립신 솔루션을 추가합니다.
    3. 세포가 접시를 sloughing 때까지, 37 ° C 약 1 분 동안 품어.
    4. 부드럽게 (pipet 위, 아래) 4-6 번 연결 파스퇴르 피펫으로 ES 세포를 분산하기 위해 trypsinized 세포, 씹다. prewarmed을 (37 ° C) MES 매체가 포함된 15 ML 원뿔 원심 튜브에 분산 ES 세포를 전송합니다.
    5. 원심 분리하여 세포를 수집합니다. 뜨는을 기음, MES 매체 10 ML을 추가하고 단일 세포 현탁액을 형성하고 아래로 피펫.
    6. 37 0.1 % 젤라틴과 부화로 사전 코팅 T75 플라스크에 세포 현탁액을 전송 ° C 한 시간 만이라도 5 % CO 2

      * 일시간 후, 섬유아 세포는 판에 부착된했지만 줄기 세포는 매체에 남아 있습니다. 줄기 세포를 수집하는 매체를 피펫.

    7. 5 분 1,000 RPM에서 세포를 분사하고 MES 미디어를 대기음. 다음 MES 차별 매체의 또 다른 10 ML을 추가하고 세포의 벌금 정지있을 나타날 때까지 반복적인 pipetting하여 세포를 resuspend.
    8. 멸균 분지 20ul (20ul/drop) 당 400-500 세포의 농도에 줄기 세포 현탁액을 희석하기 위해 hemocytometer 사용 차별화 매체와 세포를 계산합니다.
    9. 뚜껑을 리프트, 조심스럽게 그것을 반전하고 PBS 10 ML 들어있는 접시 위에 놓으십시오. 멀티채널 피펫을 사용하여 조직 문화 요리의 뚜껑의 최대 - 설정되어 안쪽 표면에 20ul 방울의 행을 확인합니다.
    10. 조심스럽게 2 일 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. 이틀 뒤에는, 신중하게, 슬라이딩 커버를 뒤집 180 UL 신선한 차별 미디어를 기음과 96 잘 ultralow 부착 판의 우물에 몇 방울을 넣어. 다음 피펫과 전송 방울, 일대일하여 96 - 웰 플레이트까지 픽업 드롭합니다. 3 일간 그대로 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
    11. 문장의 각 우물의 젤라틴 0.1 %의 300ul와 48 - 잘 조직 배양 플레이트. 젤라틴을 추가 후, 37시 야간 번호판을 품어 ° C 하루 앞서 전 EBS를 전송합니다.
    12. 다음날 48 아니라 판에서 젤라틴을 대기음. 다음 각 잘하는 차별화 매체 300 UL를 추가합니다. 48 잘 젤라틴 - 코팅 접시 하나별로 하나에 96 잘 접시에서 EBS를 전송합니다. 다음날 매체를 변경 후 세포를 유지하기 위해 매일 매체를 변경합니다.
    13. 자연 cardiaomyocyte 수축이 7 일 이내 분명해야합니다.

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    Discussion

    한 방울의 액체 볼륨으로 인해 표면 장력에 의해 뚜껑에 매달려 방울을 유지하기 위해보다 50ul에 국한되며, 그것은 방울을 매달리기 매체를 변경 불가능 : 매달려 드롭 방식의 단점은 다음과 같다. 직접 현미경과 방울에 EBS를 형성의 관찰 재배 기간도 매우 어렵습니다. 또한 더 매달려 드롭 방법은 두 단계로 구성되어 있으므로, 매달려 드롭 방식의 단계는 일련의은 골칫거리 수 있습니다.

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    Disclosures

    Materials

    Name Type Company Catalog Number Comments
    DMEM Reagent GIBCO, by Life Technologies 11965-092
    Fetal Bovine Serum(FBS) Reagent Hyclone SH30070.03
    L-Glutamine Reagent GIBCO, by Life Technologies 25030
    Non-Essential Amino Acids Reagent GIBCO, by Life Technologies 11140-050
    Penicllin / Streptomycin Reagent GIBCO, by Life Technologies 15140-122
    Sodium Pyruvate Reagent GIBCO, by Life Technologies 11360-70
    β-mercapt–thanol Reagent Chemicon International ES-007-E
    leukemia inhibitory factor(LIF) Reagent Chemicon International LIF2005
    96-well ultralow attachment plate Tool Corning 3474

    References

    1. Wobus, A. M., Wallukat, G., & Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation, 48(3), 173-182. (1991).

    2. Metzger, J. M., Lin, W. I., & Samuelson, L. C. Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. J Cell Biol, 126(3), (1994).

    Comments

    7 Comments

    Dear Doctor Xiang Wang,  your technique appear useful and very interesting. I' m studying mES and I want to differentiate them into simple embryoid bodies, but not into predefinite cells. So I have a question for you. The differentiation medium could be a stem cell medium just without LIF? Or do I need to add some elements to my medium to produce embryoid bodies? Thank you very much and best regards,  Barbara Tondelli.
    Reply

    Posted by: AnonymousOctober 8, 2008, 7:13 AM

    hi, i work together w/ xiang. he returned to china so i asked him to respond to you but in case he dŒsn't, let me answer: 1. yes. embryoid bodies can be made w/ the stem cell medium w/o lif. you need to create a voumetric clusters. this could be done using the hanging drop method or plate in cluster of cells. we have had best exerience making hanging drop. hope this helps.   phil
    Reply

    Posted by: AnonymousOctober 8, 2008, 12:09 PM

    Hello I want to know the function and concentration here of sodium pyvurate. Can the heartbeat appear in a differentiation medium without sodium pyvurate? And if the plates are taken out sometimes during the suspension culture period, dŒs it matter so much? I've been trying but no cardiocytes seemed to appear, and I cannot find the key to this. Thank you a lot!  
    Reply

    Posted by: AnonymousNovember 7, 2008, 3:02 AM

    Dear Huijun Zhu,   I use 1mM Sodium pyvurate for mESC culturing. Sodium pyvurate works mostly  as  an additional source  energy. It also have protective effects against hydrogen peroxide.  According to my experience,  Sodium pyruvate is not necessary for differentiation. It 's not good for moving  out of the incubate when the EBs are in hanging drop situation. It should be fine to take out the plate carefully and take a simple look once they were in ultralow attachment plates. Hope this helps, Good luck!   Xiang Wang  
     
    Reply

    Posted by: AnonymousNovember 10, 2008, 8:00 AM

    Thank you Xiang Wang! The cardiaomyocyte contractions became obvious after 9days. But the contraction of a certain area became weaker and finally disappeared. Is it  normal or something gŒs wrong? And how can I purify the cardiaomyocytes? How can I increase the percent of the cardiomyocytes? Thank you a lot!
    Reply

    Posted by: AnonymousNovember 18, 2008, 3:59 AM

    Dear Doctor Xiang Wang

    is necessary to add gelatin on the plate or not??
    Reply

    Posted by: AnonymousJune 12, 2009, 10:42 AM

    Dear Doctor Xiang Wang,

    is it possible to split the cardiomyocytes? Or how can i isolate them, to start my assays with them?
    Thank you very much.

    Kind regards
    Reply

    Posted by: AnonymousApril 26, 2011, 11:27 AM

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