Summary
我们已经开发出一种慢病毒载体,拥有,除了达反应的LTR,冯应答元件(RRE)报告基因的表达在HIV - 1达和冯依赖的方式,可以调节。向量允许通过活细胞GFP表达的复制艾滋病毒的特异性检测。
Abstract
大部分的艾滋病毒抗体反应表达载体的基础上艾滋病毒的推动者,长末端重复序列(LTR)的。 LTR的响应早期艾滋病毒的蛋白质,达,也反应细胞活化状态,并整合发生的地方染色活动。这可能会导致艾滋病毒高独立的活动,并已成为制约LTR的记者有用标志艾滋病毒1,2,3阳性细胞。在这里,我们构建了一个表达的慢病毒载体,具有,除了达LTR的响应,许多艾滋病毒的DNA序列,包括冯响应元素和艾滋病毒剪接位点4,5,6。纳入一种慢病毒记者病毒载体,允许艾滋病毒的复制非常具体的检测活细胞群。测定绿色荧光蛋白(GFP)的表达载体的活动。这个向量的应用,这里提供了一个新颖的现有方法的替代方法,如原位PCR或HIV抗原染色,以确定HIV阳性细胞。载体也可以为基础或临床试验,针对艾滋病毒抗体阳性的细胞表达的基因治疗。
Protocol
1。冯依赖的慢病毒颗粒的生产质粒转染
设置:依赖REV - GFP慢病毒载体,PNL - GFP - RRE - SA,描述以前4,5,6。要组装成病毒颗粒,质粒是contransfected到HEK293 T细胞的HIV - 1包装构造,pCMVΔ8.2(请Dider Trono博士提供),质粒携带的VSV - G糖蛋白(pHCMV - G) 。使用磷酸钙法转染进行了。
缓冲区的制备:10 ×哈佛商学院(HEPES缓冲液)溶解5克HEPES,8克氯化钠0.37克氯化钾,1克葡萄糖,0.103克的Na 2 HPO 4(无水)在100毫升H 2 O。分装the10 X哈佛商学院的缓冲区为1毫升分装和储存在-20 ° C在转的时间,转换成10 ×哈佛商学院2个哈佛商学院与H 2 O(1:5稀释),并调整pH值至7.05 - 7.12 。 (10毫升2 ×哈佛商学院,它通常需要大约50μL1M氢氧化钠)。通过传递通过0.22μm的微孔过滤器,过滤消毒2X哈佛商学院的缓冲区。 氯化钙缓冲液是由溶解在10 mM的HEPES 氯化钙2至终浓度为2M 。调节pH值至5.8,过滤消毒的缓冲区,并储存于4 ° C。
程序:
- 转染前一天,种子2 × 10 6 HEK293T细胞在100毫米的Petri盘,增长37细胞在10毫升的DMEM + 10%FBS的隔夜℃,5%的CO 2。
- 第二天,取出细胞培养上清和取代5 mL新鲜的DMEM + 10%FBS,连续4小时的细胞培养。
- 在一个5毫升的聚苯乙烯管,加480μL的2倍哈佛商学院的缓冲区。
- 在第二个5毫升的聚苯乙烯管,添加60μL的2M 氯化钙 2缓冲区,质粒DNA,并转染TE缓冲液(1毫米的Tris,25 mM的EDTA,pH值8.0),一个总体积为480μL 。对于每个基于Petri盘,质粒应在10微克的PNL - GFP - RRE - SA,pCMVΔR8.3,7.5微克和2.5毫克pHCMV - G比例增加。
- 加入质粒DNA - 氯化钙混合滴加到2 x哈佛商学院管,并在室温下孵育30分钟。的罚款,沉淀就会形成。
- 吸管滴加细胞的混合物中加入960微升。在37℃,5%的CO 2过夜孵育。
- 第二天,去除上清液,并添加10毫升新鲜的DMEM + 10%FBS,并不断孵育的细胞在37℃,5%的CO 2一夜之间。
- 在转染后48小时,收获的病毒去除上清,转移到50 mL无菌管。添加到每个培养皿菜新鲜10毫升新鲜的DMEM + 10%FBS,继续培养过夜。病毒上清保存在4 ° C。
- 继续在72小时后转染收获,收集上清。合并所有上清,离心上清在500 XG 15分钟以沉淀,去除细胞碎片。
- 上清通过0.22μm的微孔过滤器收集和筛选。该病毒是通过体积排阻柱进一步集中。
2。浓缩病毒颗粒,并确定病毒滴度
- 病毒颗粒集中由一个体积排阻柱(100000兆瓦切断,Centricoin)。病毒上清装入列,在4 ° C 15分钟,并在6000 XG离心。
- 浓缩病毒上清,收集,分装,并保存于-80 ° C。
- 由TNF -α治疗的HIV - 1阳性外套细胞株,J1.1 7感染病毒滴度测定。在2.5 × 10 5细胞每毫升(100毫升的总量),细胞培养在96孔板和100毫升为一个星期连续稀释VNL - GFP的RRE - SA的感染。估计粒子的滴度(TCID50)以下的里德和Muench 8方法计数GFP阳性井。
3。标记HIV - 1阳性细胞的慢病毒颗粒,VNL - GFP - RRE - SA
设置:一个人的CD4 T细胞系,CEM - SS的,是先用HIV - 1感染。在感染后48小时,细胞的慢病毒颗粒,VNL - GFP - RRE - SA superinfected。另外两天的二重感染,GFP阳性细胞流式细胞仪分析。作为对照,HIV - 1未受感染的CEM - SS的细胞是相同的感染VNL - GFP - RRE - SA。 HIV - 1感染的CEM - SS的细胞,只有产生了GFP阳性细胞,但不是HIV - 1的未受感染的CEM - SS的细胞。
程序:
- 感染前的两个小时,加入终浓度为4毫克/毫升的polybrane。计数细胞,并采取2 × 10 5每个感染的细胞。感染200毫微克的HIV - 1的NL4 - 3(P24)2小时细胞。
- 洗涤离心10分钟,重新悬浮细胞在300 XG细胞为2 × 10 5细胞/毫升,和文化在37 ° C 48小时。
- 计数细胞,并采取2 × 10 5%感染的细胞与VNL - GFP - RRE - SA。添加100毫升VNL - GFP - RRE - SA的培养,在37 ° C过夜。洗涤细胞,重悬成2 × 10 5细胞/ mL。
- 执行48小时后二重感染流式细胞仪分析。感染的细胞颗粒和成500毫升1%paraformaldehede室温孵育20分钟,悬浮,然后在FACScan分析仪分析(流式细胞迪肯森)。
4。代表性的成果
如果实验成功地进行,一个庞大的GFP人口将流式细胞仪检测出HIV - 1感染细胞CEM - SS的,在控制,而GFP阳性细胞不会被检测到HIV - 1的未受感染的CEM - SS细胞。
如果实验成功执行,冯依赖的慢病毒载体,VNL - GFP - RRE - SA,将允许在活细胞数量的艾滋病毒复制非常具体的检测,测量通过绿色荧光蛋白(GFP)的表达。在这个例子中,收获CEM - SS的细胞染色的PE标记的大鼠单克隆抗体对CD24的鼠标,HSA的,然后在HSA和绿色荧光蛋白表达的流式细胞仪分析。
图1。如下所示,一个庞大的GFP人口VNL - GFP - RRE - SA(图1c)superinfected的HIV - 1感染细胞中检测到。与此相反,没有检测到GFP阳性细胞为HIV - 1的未受感染的CEM - SS的细胞中没有慢病毒重叠(图1a)或HIV - 1慢病毒重叠(图1b)未受感染的细胞。
Discussion
至于与早期开发的达依赖性表达载体,这里描述的是冯系统利用一个演变艾滋病毒过程。列入冯依赖呈现的LTR表达载体的高度依赖复制艾滋病毒的存在。这个向量的应用报道中,一个艾滋病毒相关的记者病毒,提供了全新的方式来确定艾滋病毒呈阳性的细胞。向量允许活细胞检查,可以表达任何基础或临床试验的基因,并作为一个伪类型的慢病毒已获得大多数细胞类型和组织。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是支持部分由公共卫生服务授予1R01AI081568从NIAID的YW M.罗森和第2天公司举办的2009年NYCDC艾滋病骑的捐助者和骑手的慷慨捐赠
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Biosafety Cabinet | |||
37°C 5%CO2 incubator | |||
Flow cytometer | FACSCalibur | ||
Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Allega®6KR | |
4°C regrigerator | |||
-20°C refrigerator | |||
-80°C refrigerator | |||
Cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer® AutoT4 | |
HEK293T cell line | National Institutes of Health | ||
CEM-SS cell line | National Institutes of Health | ||
Jurkat cell line J1.1 | National Institutes of Health | ||
DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
RPMI 1640 | Invitrogen | 21870 | |
HI FBS | Invitrogen | 10438-018 | |
HIV-1NL4-3 | prepared by tranfsection of HeLa cells with cloned proviral DNA | ||
pNL-GFP-RRE | copmlete deletion of all HIV ORFs of pNL4-3 | ||
pNL-GFP-RRE-SA | Insert HIV-1 A5 and D4 into pNL-GFP-RRE | ||
pCMVΔ8.2 | provided by Dr. Dider Trono | ||
pHCMV-G | |||
10 x HBS (Hepes Buffered Saline) | Invitrogen | 11344-041 | |
2M CaCl2 buffer | Invitrogen | S-013-154-10 | |
1% paraformaldehy | Sigma-Aldrich | 158127 | |
Bleach | |||
50ml Falcon tubes | BD Biosciences | 358206 | |
5ml round bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
0.45μM Millipore filter | EMD Millipore | SLHA033SS | |
0.20μM Millipore filter | EMD Millipore | SLFG85000 | |
100mm Petri-dish | Sigma-Aldrich | CLS430588 | |
Size-exclusion column (100,000MW cut off) | Sartorius AG | VS2041 | |
2ml frozen tube | Axygen Scientific | SCT-200 | |
96-well plate | BD Biosciences | 353227 | |
1.7mL Microcentrifuge Tube | Axygen Scientific | MCT- 175-C |
References
- Garcia, J. A., Wu, F. K., Mitsuyasu, R., Gaynor, R. B. Interactions of cellular proteins involved in the transcriptional regulation of the human immunodeficiency virus. EMBO Journal. 6, 3761-3770 (1987).
- Merzouki, A. HIV-1 gp120/160 expressing cells upregulate HIV-1 LTR directed gene expression in a cell line transfected with HIV-1 LTR-reporter gene constructs. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand. 41, 445-452 (1995).
- Aguilar-Cordova, E., Chinen, J., Donehower, L., Lewis, D. E., Belmont, J. W. A sensitive reporter cell line for HIV-1 tat activity, HIV-1 inhibitors, and T cell activation effects. AIDS Res Hum Retroviruses. 10, 295-301 (1994).
- Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W.
Rev-dependent lentiviral expression vector. Retrovirology. 4, 12-12 (2007). - Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. Rev-dependent indicator T cell line. Current HIV Research. 5, 395-403 (2007).
- Young, J., Tang, Z., Yu, Q., Yu, D., Wu, Y. Selective killing of HIV-1-positive macrophages and T Cells by the Rev-dependent lentivirus carrying anthrolysin O from Bacillus anthracis. Retrovirology. 5, 36-36 (2008).
- Perez, V. L. An HIV-1-infected T cell clone defective in IL-2 production and Ca2+ mobilization after CD3 stimulation. Journal of Immunology. 147, 3145-3148 (1991).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).