Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Görselleştirme bir otomatik mikrosıvısal aygıtı kullanarak Candida albicans biyofilm oluşumu

Published: December 14, 2017 doi: 10.3791/56743
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Molecular and Cell Biology, School of Natural Sciences, University of California, Merced

Summary

Bu protokol ana bilgisayar fizyolojik koşullar altında Candida albicans biyofilm oluşumu görselleştirmek için özelleştirilebilir otomatik mikrosıvısal aygıt kullanımını açıklar.

Abstract

Candida albicans hastane edinilen sepsis vakaların yaklaşık % 15'i neden insanlar, en sık görülen mantar patojen var. Bir büyük virülans C. albicans özniteliktir onun yetenek-e doğru formu biyofilmler, biyotik ve abiyotik yüzeylere bağlı hücre yapılandırılmış topluluklar. C. albicans biyofilmler Mukozal katmanlar gibi ana bilgisayar doku ve tıbbi cihazlar, Kateterler, Kalp pilleri, protez ve eklem protezleri gibi oluşabilir. Fiziksel ve kimyasal tedirginlikler için son derece dayanıklıdır ve tohum için rezervuarlar enfeksiyonlar Dissemine hareket edebilir çünkü biyofilmler önemli klinik sorunlar teşkil. Çeşitli vitro deneyleri C. albicans biyofilm oluşumu, microtiter plaka deneyleri, Kuru Ağırlık ölçüleri, hücre canlılığı deneyleri ve confocal tarama lazer mikroskobu gibi eğitim için kullanılmıştır. Tüm bu deneyleri tek son nokta deneyleri, nerede biyofilm oluşumu belirli bir zaman noktasında değerlendirilir vardır. Burada, biz gerçek zamanlı laminar akış koşullar altında bir otomatik mikrosıvısal aygıt kullanarak biyofilm oluşumu çalışma için bir protokol tanımlamak. Biyofilm zaman içinde bu ana bilgisayarın bu vasküler kateter karşılaştı gibi taklit özelleştirilebilir koşul kullanma geliştikçe bu yöntem biyofilm oluşumu gözlem için sağlar. Bu iletişim kuralı genetik mutantlar biyofilm kusurlarý yanı sıra biyofilm geliştirme gerçek zamanlı olarak antimikrobiyal ajanlar inhibitör etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir.

Introduction

Ancak bu aynı zamanda bir fırsatçı patojen, yüzeysel ve ciddi mantar enfeksiyonları1,2neden yeteneğine candida albicans insan microbiota komensal bir üyesidir. Bir büyük virülans özellik C. albicans , onun yetenek forma esnek ve ilaca dirençli biyofilmler, hücre toplulukları bir yüzeye yapıştırılır ve bir hücre dışı matriks malzeme1,3' te alınmış. C. albicans biyofilmler son derece yapısal, birden çok hücre tiplerinin birkaç kat içeren (tomurcuklanma Maya biçimli yuvarlak hücreler, oval pseudohyphal hücreleri ve tübüler hyphal hücreleri)4. C. albicans biyofilm geliştirme yüzeyde bu hücrelerin çoğalması tarafından takip bir yüzey (biyofilm tohum), yuvarlak mantar biçimli hücrelerin bağlılık ile başlar ve sonra olgunlaşmamış biyofilm olgunlaşma yapısı içine bir hücre dışı matriks malzeme4tarafından çevrili tam olarak kurulan biyofilm. Olgun biyofilm ağırlıklı olarak biyofilm4mimari istikrar sağlayarak yoğun ve bağlantılı ağlar oluşturmak uzun hyphal hücreleri oluşur. Biyofilm yaşam döngüsü boyunca mayası yuvarlak hücreler olgun biyofilm dağıtmak ve Dissemine enfeksiyonlara neden veya diğer siteler4,5yeni biyofilmler tohum vücudun diğer bölgelerine seyahat olabilir. C. albicans biyofilmler biyotik yüzeylerde, Mukozal yüzeyler gibi ve ana bilgisayar doku, boyunca ve Kateterler, Kalp pilleri, takma diş ve protez eklemler gibi abiyotik yüzeylerde oluşabilir. Biyofilmler inatçı özelliklerini, nedeniyle ortadan kaldırmak son derece zordur ve çoğu zaman tek etkili tedavi stratejisi enfekte cihaz4çıkartılmasıdır. Böylece biyofilm oluşumu gözlenen klinik ayarlarında benzer koşullarda araştırmak önemlidir.

C. albicans biyofilm oluşumu6,7,8eğitim için kullanılan çeşitli kritik in vivo hayvan modelleri vardır; Ancak, bu çalışmalar ve pahalı, zaman alıcı olabilir suşları ve belirli bir zamanda test edilebilir antimikrobiyal ajanlar sayısıyla sınırlıdır. Vitro biyofilm deneyleri, öte yandan, antifungal bileşikler ve mutant suşları hızlı, yüksek üretilen iş değerlendirmesi için izin ve çok daha düşük maliyetli ve taşınan biyofilm deneyleri daha etik hayvan out modelleri9, 10,11,12,13,14. Burada geliştirilen ve biyofilm oluşumu laminar akış özelleştirilebilir mikrosıvısal aygıt14,15kullanarak geçici altında gözlemlemek için en iyi duruma getirilmiş bir vitro tahlil açıklayın. Tahlil her aşamasında ilk bağlılık adım, hücre çoğalması, biyofilm olgunlaşma ve hücre dağılımı gibi biyofilm oluşumu görselleştirme için sağlar. Tahlil de hücre morfolojisi değişiklikleri bir biyofilm gelişimi boyunca görselleştirmek yararlıdır.

Genellikle yüksek üretilen iş, süre vitro biyofilm deneyleri için kullanılmaktadır Microtiter levha, kontrollü akış koşulları için izin vermez. Geleneksel laminar akım hücre sistemleri biyofilm oluşumu kontrollü akış koşullarında sürekli değerlendirilmesi için izin, ancak bunlar çoğu kez kurmak ve dinamik aralık denetimi ve işlem hacmi sınırlıdır eğilimindedir için zaman alıcı. Burada kullanılan mikrosıvısal cihaz bu sınırlamalar (48 wells içeren) yüksek işlem hacmi plakaları birleştirerek yerleşik laminar akış odası ile üstesinden gelir ve son derece çok yönlü, tekrarlanabilir ve özelleştirilebilir.

Burada, bir vahşi-türü C. albicans biyofilm oluşumu değerlendirmek için piyasada bulunan otomatik mikrosıvısal cihazın kullanımı için bir protokol tarif zorlanma, bilinen bir antifungal ajan bir biyofilm ve biyofilm gelişimi üzerine etkisi daha önce biyofilm için rapor edilmiştir (bcr1Δ/Δ ve efg1 Δ/Δ) iki mutant suşları oluşumunda vitro ve in vivo16,17,18kusurları. Açıklanan Protokolü biyofilm oluşumu bir biyofilm gelişimi boyunca inhibe antimikrobiyal ajanların etkinliğini test etmek ve mutant kitaplıkları eleme tarafından normal biyofilm gelişimi için gerekli genler tanımlamak için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. mantar hücre kültür hazırlama

Not: Kuralları hücre kültürü içinde bir biyogüvenlik kabini iş (yani kriyojenik hisse senedi tüpler, hücre kültür tüpleri ve şişe açılış). Kabine'nın ultraviyole (UV) antiseptik lamba en az 1 h önce iş ve aktif olarak kabinde çalışırken UV lambası kapatın açın. Eldiven, koruyucu gözlük ve uygun kişisel koruyucu ekipman ve tezgah ve Pipetler deneme başlangıcı önce % 70 etanol ile yüzeyi dezenfekte etmek. Steril filtre ipuçları ve temel aseptik Mikrobiyolojik teknikleri ile aşinalık kullanımı önerilir.

  1. Çizgi C. albicans suşları (vahşi-türü, bcr1 Δ/Δ ve efg1 Δ/Δ) Maya üzerinde ayıklamak pepton dekstroz (YPD) orta (pH %6.8 1 Maya ekstresi, % 2 pepton, % 2 glikoz;) Ağar kaplamalar. İçin 48 saat, aşağıdaki standart Mikrobiyolojik yöntemleri1930 ° C'de kuluçkaya.
  2. Yalıtılmış bir koloni YPD sıvı orta (pH %6.8 1 Maya ekstresi, % 2 pepton, % 2 glikoz;) 4 mL aşılamak ve standart bir kuluçka için 12-15 h, aşağıdaki standart Mikrobiyolojik prac sallayarak 225 rpm'de sallayarak ile 30 ° C'de kuluçkaya kalıbı seçin tices19.
  3. Hücre yoğunluğu kültür 600 optik yoğunluk (OD) ölçerek belirlemek nm bir küvet (1 mL, 1 cm yol uzunluğu), aşağıdaki standart Mikrobiyolojik yöntemler19.
  4. Hücre kültürü 0,5, Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI)-1640 orta 2 x 107 hücre/ml, eşdeğer son OD600 seyreltik (165 mM 3-morpholinopropane-1-sulfonic asit (paspas), L-Glutamine, içeren ve sodyum olmadan bikarbonat, pH 7,0) veya örümcek orta (%1 besin et suyu, %1 mannitol, %0,4 K2HPO4, pH 7.2).
    Not: Alternatif medya ilgi suşlarının belirli büyümeyi desteklemek için kullanılabilir.
    Not: cep dilutions çok önceden yer yapmayın. Bu dilutions adım (hif oluşumu hücreleri izleme kanalının içinde sağlanan önce inisiyasyon engellemek için aşağıda açıklanan) 3.3 sonra başlamak için tavsiye edilir.

2. mikrosıvısal kanalları mikrosıvısal plaka hazırlanması

Not: mikrosıvısal sistem kullanıcı el kitabına başvurun (bkz. tablo malzemelerin) plakalar ve enstrüman kurulum hakkında bilgi için.

  1. Mikrosıvısal deney çalıştırmadan önce RPMI-1640 veya örümcek ortamlardan bir kuluçka 37 ° C'de 20 mL sıcak Ek ortam birimi adım 2.8 hesaplamalarına göre gerekli olabilir. Öncesi ısınma medya deney sırasında hava kabarcıklarının oluşumunu önler.
  2. Denetleyici, iki güç kaynağı üniteleri, mikroskop, kamera ve sisteme bağlı bilgisayar içeren havacilik sistemi açın. Sistemi kontrol yazılımını açın (bkz. tablo malzemelerin) bilgisayarda program menüsünden. Program açıldığında iki pencere-ecek gözükmek.
  3. Kullanımda plaka barkod numarasını bulun ve yazılım tarafından istendiğinde numarasını girin. İki ayrı bilgisayar ekranları üzerinde iki windows yazılımları görmek için kullanın. Bir pencere (kontrol modülü) plaka için denetimleri içerir ve ikinci pencere (montaj, görüntüleme modülü), mikroskop ve kamera için denetimleri içerir.
  4. Isıtıcı güç düğmesine denetleyicisinde geçiş ve havacilik sistem sıcaklığı 37 ° C sıcaklık kumanda üzerindeki ok düğmelerini kullanarak ayarlayın.
  5. Steril su aşağıdaki gibi kullanarak arabirim plaka (şekil 1) temiz. Alt plaka sprey ile steril su ve kir/toz kaldırmak için objektif kağıt kullanın. Arabirim plaka ön yüzü aşağı dönük kuru hava temiz objektif kağıt üzerinde bekletin. % 70 isopropanol ve objektif kağıt kullanarak arabirim plaka üst temiz.
    Not: Arabirim plaka mikrosıvısal sistem hücreleri ve medya içerir plaka bağlanır. Emin olun hiçbir sıvı kalır ve tüm lifleri ve kir kaldırılır. Yanlış temizlik yılında düşük kaliteli resim ve videoları neden olabilir.
  6. Yoğunlaşma arabirimi plaka üzerinde tüpler kaldırın.
    1. Objektif kağıt üzerinde dinlenme aşağı plaka yüz bırakın. Denetimde modül penceresini plaka için el ile modunu tıklatın. Yamultma denetim menü bölümünde, sütun 1-4 ve 5-8 için sıvı seçimi tıklatın ve 37 ° C aþaðý açýlan menüsünden seçin. Kesme denetimi bölümünde, akış modunu ayarlamak için sabit ve maksimum kesme 2 din/cm2 olarak ayarlayın (0,2 Pa) (şekil 2A).
    2. Giriş wells yoğunlaşma kaldırmak için arabirim plaka tüpler aracılığıyla steril hava akışını başlatmak için tıklatın. 5 dakika sonra iyi plaka kontrol bölümünde (şekil 2A) Durdur düğmesini tıklayın. Tüm yoğunlaşma kaldırıldığını doğrulamak için arabirim plaka tüplerde gözlemlemek. Damlacıkları hala görünür durumdaysa, steril hava akışını başka bir 5 min için yukarıda bahsedilen kadar yineleyin.
      Not: Giriş tüpler sadece steril hava havacilik sisteme giriliyor sağlamak için 0,22 mikronluk filtre eklenir. Akış kontrol modül penceresinde ekranda olay günlüğü tarafından izlenebilir.
  7. 48-şey 0-20 dyne mikrosıvısal plaka mikroskop sahnesinde yerini.

3. candida albicans biyofilm oluşumu mikrosıvısal sisteminde

  1. Biyofilm oluşumu kaydetmek için (bkz. şekil 1 plaka düzeni için) giriş wells Önceden ısıtılmış RPMI-1640 orta veya örümcek orta 600 µL ekleyin. Deneysel her koşul için iki çoğaltır var.
    1. C. albicans biyofilm oluşumu test etmek için vahşi tipi ve mutant suşları, deney plaka giriş wells için 600 µL örümcek orta ekleyin.
    2. Biyofilm oluşumu antifungal ilaçlar (veya ilgi diğer bileşikler) huzurunda test etmek için RPMI-1640 orta iki kuyu (negatif kontrol) için 600 µL ve Amfoterisin B (16 µg/mL) ile desteklenmiş RPMI-1640 orta 600 µL ekleyin (veya ilaç tercihi istenen konsantrasyon) için iki giriş wells.
      Not: 12 h biyofilm oluşumu deneme için giriş wells Önceden ısıtılmış medya 600 µL ekleyin. Daha uzun deneyler için ek ortam (50 µL/h) giriş wells için ekleyin. Maksimum ses iyi (1.500 µL) fazla olamaz.
  2. Temizlenmiş arabirimi plaka 48 iyi mikrosıvısal plaka üzerine yavaşça indirin. Interphase plaka üzerinde tüpler giriş ve çıkış kuyu üstüne konumlandırılmış kadar arabirimi plaka biraz sola doğru kaydırın.
Arabirim plaka konumda kilitlemek için sağa soldan arabirimi tabakta kolu çevirin, deneme sağlanması hava geçirmez.
Not: Arabirim plaka tüplerde steril hava akışının sıvı (yönüne bağlı olarak bilgisayarda yazılım kullanarak seçili), giriş veya çıkış Wells itecektir giriş ve çıkış arasında görüş kanal yoluyla sıvı akması özelleştirilmiş yön ve hız kullanıcı tarafından dikte Wells.
  • Kesme denetimi bölümünde, akış modunu ayarlamak için sabit ve maksimum kesme 1 din/cm2 olarak ayarlayın (0,1 Pa). Giriş wells ile kitle iletişim araçları giriş medya çıkış wells (kanal hazırlamak için,şekil 2A) için akışını başlatmak için tıklatın. 5 dk iyi plaka kontrol bölümünde stop düğmesini tıklattığınızda. Arabirim plaka kaldırmak ve mikrosıvısal plaka wells gözlemlemek. Kanalları priming sonra sadece küçük bir damla medya çıkış wells görünür olması gereken. Damla görünür değilse, medya çıkış Wells küçük damla görünene kadar kanalları 2 dk aralıklarla Başbakan.
    Not: Astar görüntüleme kanaldan hava kaldırmak ve kanalları ile istenen ortam dolu emin olmak için gereklidir.
  • Arabirim plaka mikrosıvısal plaka kaldırmak ve steril bir yüzeye koyun. Hücre kültür (1.5 adımda anlatılan) 50 µL her prizine de ekleyin.
    1. C. albicans test etmek için vahşi tipi ve mutant suşları, eklemek vahşi-tipi (SC5314) hücre kültürünün 50 µL örümcek medyada iki çıkış wells, iki çıkış wells için örümcek medyada bcr1 Δ/Δ ve efg1 Δ/Δ iki çıkış wells için örümcek medyada. Arabirim tabağa geri mikrosıvısal tabak yerleştirin ve kapağı kilitleyin (bkz. şekil 1 plaka düzeni için).
      Not: 3.1.1 adımda anlatıldığı gibi tüm ilgili giriş wells örümcek ortamları içerir.
    2. C. albicans biyofilm oluşumu Amfoterisin B veya diğer bileşik faiz huzurunda test etmek için 50 µL vahşi-tipi (SC5314) hücre kültürünün RPMI-1640 ortamda dört çıkış wells için ekleyin. Arabirim tabağa geri mikrosıvısal tabak yerleştirin ve kapağı kilitleyin (bkz. şekil 1 plaka düzeni için).
      Not: 3.1.2 adımda anlatıldığı gibi tüm ilgili giriş kuyu RPMI-1640 ortamları ve Amfoterisin B veya diğer bileşik faiz olmadan içerir.
  • Kesme denetimi bölümünde, akış modunu ayarlamak için sabit ve maksimum kesme 2 din/cm2 olarak ayarlayın (0,2 Pa). Çıkış wells hücrelerle medyadan giriş çıkış wells ( C. albicanstohum başlamak için,şekil 2A) için akışını başlatmak için tıklatın. Durdur düğmesine iyi plaka kontrol bölüm hücreleri giriş wells girmesini önlemek için 3 s tıklayın sonra.
    Not: Hücreleri giriş wells doğru çıkış kuyulardan taşınır; Bu hücreleri giriş wells ulaşmadan akışını durdurulur esastır. Bu giriş wells hücre kültürü ile kontamine değil olduğunu ve medya giriş Wells deneme süresi için steril kalır sağlar. Kesme kuvveti ve zaman gerekli kullanılan medyasının viskozite ve hücrelerin boyutunu dayanır.
  • Hücreleri izleme kanalının ilk hücre yapışma için 10-20 dk için akış (0 din/cm2) hiçbir sabit kalmasını sağlar. Bu 10-20 dk bağlılık adımı sırasında bilgisayara kamera sahne pozisyonlar yakalamak ve önceden floş görüntüleri (ayrıntılı bölümleri 4-6 açıklanmıştır) alma başlamak ayarlayın.

    • 4. sahne pozisyonlar mikrosıvısal deney için ayarlama

    Not: Sadece deneme başlamadan önce sahne pozisyonları ve plaka kalibrasyon ayarlamanız gerekir. Bu kurulum bilgisayar deneme sırasında görüntüleri yakalamak için her kanalının konumlarını saklamak verir. Mikrosıvısal plaka sahne pozisyonları ayarladıktan sonra rahatsız değil. Plaka taşınırsa, sahne pozisyonlar deneme başlamadan önce sıfırlanması gerekir.

    1. Görselleştirme analiz yazılımı kullanın (bkz. tablo malzemelerin) sahne ayarlamak için konumlandırır; her izleme kanalının bir sahne (1-24) (şekil 1 d) ve her aşamada farklı pozisyonlarda kanalının (şekil 1 c) boyunca görüntü yakalamak için üç alt aşamaları (1-3) vardır. Görüntüleme modül penceresinde, 'Çok boyutlu edinme' (MDA) modülü MDA sekmesinde (şekil 2B) tıklatarak açın.
    2. MDA modülü (şekil 2B) sol taraftaki menüde 'Sahne' sekmesini tıklayın. Sahne bölümünde 48 de 0 - 20 dyne mikrosıvısal plaka için ana sahne listesini yükle. Her izleme kanalının etapları resim alma olmalıdır.
    3. Açık belgili tanımlık 'Örnek yeniden ayarlama' (SRA) ve 'Mutlak pozisyonu aşamaya taşımak' SRA ve harita sekmelerinde (şekil 2B) tıklayarak (harita) modülleri. SRA modülünde crosshairs ile bir görüntü önizlemesini görmek için 'Live' düğmesine basın.
    4. Joystick kullanarak getirin iyi plaka öyle ki (fiziksel olarak plaka üzerinde bulunur) ok ucu ince artı yazılım bu kanal 4 ile ilgilenen bitişik hizalar. HARİTA menüsünde 'Kökenli ayarla' düğmesini (şekil 2B) tuşuna basın. Geçerli konum şimdi 0 içinde X, Y ve Z okumalısınız.
    5. SRA modülünde, sol taraftaki menüden (şekil 2B) 'İlk referans noktaları' bölümüne tıklayın. 'Yük ayarları' nı tıklayın ve 48 de 0 - 20 dyne mikrosıvısal plaka için dosyasını yükleyin.
    6. MDA modülün sahne bölümü üzerinde çift tıklayın ' sahne pozisyon 22,2'. Bu konumu izleme (alt Aşama 2) ortasına gösterir kanal sayısı 22. Bu sahne ile ilgilenen mikroskop getirecektir ve kamera odaklama kanal 22 görüntüleyerek ok işaretçiyi yakınlığı kapatın. Joystick kullanarak getirin iyi plaka öyle ki (fiziksel olarak plaka üzerinde bulunur) ok ucu kanal 22 ile ilgilenen bitişik ince artı ile hizalar.
    7. Y koordinatı noktası 2 Y konumunu SRA modülü (şekil 2B) 'Güncelleştirme referans noktaları' sekmesinde MDA modülünde kopyalayın.
    8. SRA 'Güncelleştirme sahne pozisyonları' sekmesinde 'MDA sahne listesine Uygula' tıklayın (şekil 2B).
      Not: Bu tüm güncelleştirir sahne pozisyonları belirli mikrosıvısal plaka konuma mikroskop Sahne Alanı'nda ayarlanması için plaka (1-24) ile ilgilenen.
    Plaka resim alma için hazır ve kalibre edilmiş sahne pozisyonları tüm 24 kanalları ile ilgilenen üç pozisyonlar görüntüleri yakalarken taşımak için kullanın.

    5. satın almalar için görüntü kurma mikrosıvısal deneme sırasında yakalama

    1. Görüntüleme modül penceresinde MDA modülü kullanmak ve sol taraftaki menüden (şekil 2B) kutusunda 'Kaydet' sekmesini tıklatın. Deneme ve alınan görüntüleri bilgisayarda depolamak için klasör için dosya adı seçin.
    2. MDA modülündeki kutusunda sol taraftaki menüden 'Timelapse' sekmesini tıklatın ve 145 toplam görüntüleri ayarlayın; Resim 5 dk arasında timelapse ayarlayın. Bu 1 Resim 12 h biyofilm geliştirme deneme için her 5 dk da yol açar.
      Not: Fotoğraf ve görüntüleri toplam sayısı arasındaki zaman aralığını temel alınarak deneysel gereksinimleri ayarlanabilir. 12 h daha uzun süre görüntüleme, ilave her türlü medya adımda 3.1 giriş kuyu Kuyu kuru çalıştırmayın emin olmak için ekleyin. (50 µL/h) gerektiğinde daha uzun deneyler için giriş wells için ek ortam ekleyin.
    3. MDA modülündeki (şekil 2B) sol taraftaki menüde 'dalga' sekmesini tıklatın ve deney için dalga boyu sayısını 1 ayarlayın. %50 aydınlık alan ve % 50 olarak yakalamak için dalga boyu ayarla 12-20 ms, 0.6 kazanç ve 20 MHz Dijital dönüştürücü bir çekim hızı ile fotoğraf makinesi.
      Not: Ek dalga boylarında, dalgaboyu Floresans görüntüleme için de dahil olmak üzere kullanılabilir (örneğin, biz başarılı bir şekilde mCherry ve bu mikrosıvısal aygıtı kullanarak öğesini GFP C. albicans suşları görselleştirildiği). Satın alma parametrelerini de bağlı olarak deneysel gereksinimleri değiştirilebilir. Örneğin, ikinci bir dalga boyu kadar ayarlama ve 'Her Timepoint, otofokus' seçerek ve üçüncü dalga boyu ve 'Autoexposure her Timepoint,' seçme odakta olan görüntü satın alma fırsatları en üst düzeye çıkarmak yeni başlayanlar için tavsiye edilir.
    4. MDA modülünde sahne listesi tabs içinde sol taraftaki menüden seçin. Aşamaları 1,1-24,3 görüntülenir. Teker teker, her sahnede tıklatın ve iyi odaklama ayarları el ile izleme kanalının hücrelerde her aşaması için odaklanmak için kullanın. Görüş alanı içinde odak olduğunda, güncelleştirmek ve her aşaması için ayarları kaydetmek için sahne listesinin yanındaki siyah oku tıklatın. Bilgisayar görüntüleri her zaman noktasında bu konumu el ile tanımlanmış ve odak ayarlarını kullanır. Kullanılmayan herhangi bir aşamada 'Kaldır' oku kullanarak listeden kaldırın.
      Not: MDA modülü ve programın aşamaları birbirinin yerine kanalları görüntülemek için bakın ve aynı terminolojiyi yazılım tarafından kullanılır.

    6. mikrosıvısal deneme gerçekleştirme

    1. Görüntüleme modül penceresinde, tüm alt aşamaları (şekil 2B) için önceden floş yapıştırılan hücrelerin görüntülerini yakalamaya başla için ' al' MDA modülü kullanarak seçin.
      Not: Görüntüleme modülü pencere ve kamera denetimleri şimdi yakalanır resim gösterecektir ve harita, SRA ve MDA modülü artık görünür hale gelir. Sonraki görüntü yakalama döngüsü başlamadan önce yakalanan görüntüleri çekilen görüntü sayı belirtmek için yan ve zaman atlamalı üzerinde de bir zamanlayıcı gösterilir. Sonraki adımla devam etmeden önce çekilen görüntülerin bir tur için bekleyin.
      Not: görüntüleme modülü penceresi ekranda 'Pause' veya 'Mark olay' düğmeleri kullanmayın. Şu andan itibaren deneme sırasında yalnızca denetim modülü pencere ikinci bilgisayar ekranında (şekil 2A) üzerinde fareyi tutun. Bu görüntüleme modülü pencere rahatsız edici önlemek önemlidir.
    2. Denetim modülü pencere kalmak plaka için el ile modunu. Kesme denetimi bölümünde, akış modunu ayarlamak için sabit ve maksimum kesme 1 din/cm2 olarak ayarlayın (0,1 Pa). Çıkış wells O1, O7, O13 ve O19 çıkış wells (şekil 2A) için giriş üzerinden medya akışını başlamak için sigara yapıştırılır hücreleri kaldırmak için tıklatın. 5 dk iyi plaka kontrol bölümünde stop düğmesini tıklattığınızda. Görüntülerin ikinci tur için elde edilebilir için izin verme. Görüntüleri görüntülenir ve zaman atlamalı görüntüleme modülü penceresindeki ikinci ekranda izlenebilir.
    3. Kesme denetimi bölümünde 0.5 din/cm2 maksimum kesme akışına ayarlayın (0,5 Pa) max sayısında tıklayarak sütun ve 0,5 girmek için klavyeyi kullanarak kesme. Klavyedeki enter tuşuna basın ve Debi kontrol modül penceresinde (şekil 2A) olay günlüğünde değişikliği onaylayın. Deneme 12 h için karanlıkta rahatsız bekletin.
      Not: pozlama ışık ve hareket/titreşim ciddi deney boyunca alınan görüntüleri kalitesini düşürebilir. Mikrosıvısal deney sonunda görüntüleme modülü pencerenin herhangi bir görüntü göstermez ve geri SRA, harita ve MDA modülleri gösterecek şekilde döner. Görüntüleme modülü yazılımı görüntüleri, videolar birleştirin ve biyofilmler ölçmek için kullanılabilir (aşağıda açıklanmıştır) kurdu.

    7. sonuçlarını çözümleme

    1. Görüntüleme modül penceresinde 'Çözümleme Araçları' sekmesini seçin ve 'Bir daha gözden geçirme çok boyutlu veri' (RMD)--dan damla aşağı yemek listesi tıklatın. RMD modülünde 'Bankası dosya seçin' üzerinde'yi tıklatın. Bu 'Çok boyutlu veri kümesi Utilities' pencere açılacaktır.
    2. 'Dizin Seç' butonuna tıklayın ve deneme 5.1 adımda kaydetmek için kullanılan klasörü seçin. "Veri kümeleri" listesinde deney dosya günlüğü (.nd uzantılı) seçin. Günlük yüklendikten sonra 'görüş' butonuna tıklayın.
    3. Dalga boyu sol 'Dalga' menü seçenekleri tıklatarak seçin ve aşağı açılan menüsünden görüntülemek için sahne alanı konumu seçin. Resim numarasını sağ tıklatarak sayıları üst modül yüklemek için seçin. Bir kez seçme, ilgili resimleri yüklemek için 'Resimleri Yükle' düğmesini tıklatın. Bir resmi veya tüm resimleri aynı anda görüntüleyebilirsiniz.
    4. Zaman atlamalı video yapmak için tüm görüntüleri seçin. Seçilen görüntüler bir video yeni bir pencerede açılacaktır. Görüntüleme modülü penceresindeki 'dosya' sekmesine tıklayın ve 'kayıt' dan damla-aşağı yemek listesi. Elde edilen video varsayılan dosya (TIFF/MetaSeries) olarak kaydedin.
    5. Açın ve ImageJ yazılımı kullanarak kaydedilmiş video dosyasını yükleyin. ImageJ, 'dosya' sekmesini ve 'kayıt' tıklayın. '.Avi' aþaðý açýlan menüsünden seçin ve 10 kare/s için ayarlamak JPEG dönüşüm kullanarak bir .avi dosyasını için dosya dönüştürmek.
      Not: Kare/s değiştirerek video hızı ayarlanabilir.
    6. Biyofilmler ölçmek için 7.2 ve 7.3 7.4 adımları yineleyin.
    Son resim (sayı 144) seçin ve resim yüklemek için 'Resimleri Yükle' düğmesini tıklatın. Görüntü yeni bir pencerede açılacaktır. 'Eşik resim' butonuna tıklayın ve 'Inclusive' eşik seçin. Hiçbir hücre bölgeleriyle değil renklendirilir ve biyofilm hücreleri kırmızı renkli kadar götür.
  • Ölçümler oturum için 'Açık günlüğü' düğmesini tıklayın (düğme 'Açık günlüğü' yalnızca başlangıçta görüntüler; bir günlük etkin olduğunda düğme için değiştirilmiştir olacak ' F9: günlük verilerini '). 'Dinamik veri değişimi' 'Açık veri günlüğü' penceresinde seçin ve 'Tamam' tıklatın
  • Görüntüleme modül penceresinde 'Çözümleme Araçları' sekmesini seçin ve 'Bölge istatistikleri göster' seçeneğini tıklatın. Bu ölçümler görüntüden gösteren yeni bir pencere açar. 'Tüm görüntü' kullanılabilir 'Ölçü' seçenekleri seçin ve tıklatın ' F9: günlük verilerini.' Tüm ölçümleri içeren bir excel dosyası görüntülenir. 'Alan' ve 'Thresholded alan' için değerleri bulun ve ikinci alan biyofilm tarafından işgal için sayısal bir değer elde etmek için eski bölün.
    Not: 'Alan' deneme sırasında elde edilen her resim için aynıdır ve böylece 'Thresholded alan' ölçüm vahşi tipi suşları ve mutant suşları arasında biyofilm oluşumu farklılıkları değerlendirmek veya etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilir biyofilm oluşumu test ilaç.

    • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Biz burada bir vahşi türünü kullanarak açıklanan mikrosıvısal biyofilm tahlil gerçekleştirilen C. albicans baskı altında iki ortam koşulları (RPMI-1640 ve örümcek medya), yaban tipi zorlanma bilinen antifungal ilaç RPMI, Amfoterisin B (16 µg/mL) huzurunda ve iki mutant suşları daha önce biyofilm oluşumu (bcr1Δ/Δ ve efg1 Δ/Δ) örümcek medya kusurları olup bildirdi.

    Video 1 yaban tipi biyofilm gelişimi RPMI-1640 orta ve biyofilm oluşumu antifungal ilaç, Amfoterisin B, etkilerini gösterir. Vahşi-türü koşullarda birkaç hücreyi şiddetle kanala uygun, hif zaman ilerledikçe hücreler oluşturmak ve kalın bir biyofilm hif enterkalasyon ile gözlenen ve hücrelerin maya. Mikrosıvısal deneme sonuna doğru vahşi tipi biyofilm tamamen izleme kanalının doldurur. Amfoterisin B, varlığı ancak, biyofilm azaltılması üzerinde belirgin bir etkiye sahiptir. Özellikle, hücre yapışma azalır ve tedavi edilmezse koşulları, Amfoterisin B, huzurunda aksine uzak medya kesme akışı ile akan birkaç hücreyi görülebilir. Zaman ilerledikçe, hücreleri başaramamak-e doğru formu hif ve bir biyofilm biçimlendirilmemiş. Bu farklılıklar da 4 saat-Puan 0 h, 2 h, 6 h ve 12 h tahlil gösterilen şekil 3' te gösterilmektedir.

    Video 2 vahşi tipi biyofilm gelişimi gösterir ve iki daha önce örümcek medyada biyofilm-arızalı mutantlar (bcr1 Δ/Δ ve efg1 Δ/Δ) bildirdi. Her iki bcr1 Δ/Δ ve efg1 Δ/Δ suşlarının isogenic vahşi tipi zorlanma için karşılaştırıldığında önemli ölçüde azaltılmış biyofilm oluşumu göster. Efg1 Δ/Δ zorlanma için yapıştırılan hücrelerin hif oluşturmaz ve elde edilen biyofilm ağır kusurlu olması görülmektedir. Bcr1 Δ/Δ gerginliği için biz sadece bcr1 Δ/Δ zorlanma biyofilm oluşumu, ama bu kusurlu da görüntüler net bir bağlılık defekt, nerede hücreleri görülebilir gözlenen uymak başarısız olarak kesme Akış yönünde sürüklenen Kanal görüntüleme. Bu farklılıklar da tahlil 0 h, 2 h, 6 h ve 12 h 4 saat puan gösterilen şekil 4, gösterilir.

    Figure 1
    Şekil 1: Bu deneyde kullanılan mikrosıvısal aleti. Paneli A kullanılan, mikrosıvısal enstrüman B gösterir arabirimi plaka paneli C gösterir şematik bir anahat tek kanalının (sahne) ve deneme sırasında kamera tarafından çekilen üç alt aşamaları paneli gösterir ve Panel D çıkış ve giriş kuyuları ve görüntüleme penceresi bir şematik kullanılan 48-şey mikrosıvısal plaka şematik bir özetini gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Figure 2
    Resim 2: modulesoftware ve mikrosıvısal plaka görüntüleme Select ekran görüntüleri kontrol sistemi. Paneli A gösterir mikrosıvısal plaka için denetimler içeren kontrol modülü ve panel B görüntüleme modülü pencere 'Hareket Sahne Alanı'na mutlak konum' gösterir (harita) modülü, 'Çok boyutlu edinme' (MDA) modülü ve 'Örnek yeniden ayarlama' (SRA) modülü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Figure 3
    Şekil 3: Amfoterisin B maruz biyofilm oluşumu hataları sonuç. RPMI-1640 medya (sütun 1) ve RPMI-1640 medya ile 16 µg/mL Amfoterisin B (sütun 2) Dinamik Akış (0.5 din/cm2) altında 12 h sonrası bağlılık için 37 ° C'de mikrosıvısal sisteminde takıma biyofilm oluşumu zaman bağımlı görselleştirme. Temsilcisi 0 h (sonrası bağlılık ve ilk yıkama), 2 h, 6 h ve 12 h görüntüleri (yukarıdan aşağıya) için isogenic vahşi tipi zor SN250 gösterilir (sütun 1 ve 2). Ölçek barlar her panelinde 20 µm vardır. Biyofilm oluşumu karşılık gelen zaman hızlandırılmış videoları Video 1' de verilmektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Figure 4
    Resim 4: BCR1 veya EFG1 silinmesine biyofilm oluşumu hataları oluşur. Zaman bağımlı görselleştirme örümcek medya (sütun 1-3)'ın altında dinamik akış (0.5 din/cm2) 37 ° C'de biyofilm oluşumu için 12 h sonrası bağlılık mikrosıvısal sisteminde. Temsilcisi 0 h (sonrası bağlılık ve ilk yıkama), 2 h, 6 h ve 12 h görüntüleri (yukarıdan aşağıya) için isogenic vahşi tipi zor SN250 gösterilir (sütun 1), bcr1Δ/Δ zorlanma (sütun 2) ve efg1 Δ/Δ zorlanma (sütun 3). Ölçek barlar her panelinde 20 µm vardır. Biyofilm oluşumu karşılık gelen zaman hızlandırılmış videoları Video 2' de verilmektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Video 1: Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

    Video 2: Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Burada açıklanan özelleştirilebilir mikrosıvısal biyofilm tahlil biyofilm oluşumu görselleştirme sağlar gerçek zamanlı bir sabit oranlı laminar akış ve sabit sıcaklık maruz bir tek hücre düzeyinde. Vahşi-türü ve mutant suşları biyofilmler gelişimi çalışma için güçlü bir araç sağlar ve klinik ayarlarında antimikrobiyal Ajan tedavilerinin biyofilmler fizyolojik koşulları taklit koşullar altında üzerinde etkileri görülmektedir. Çoğu vitro biyofilm deneyleri, gerçek zamanlı olarak gelişmekte olan bir biyofilm muayene için bu yöntem sağlar bu formları gibi.

    Bu yöntem nereye kadar 24 örnekleri biyofilm oluşumu değerlendirmek için aynı anda çalıştırmak olabilir yüksek üretilen iş bir şekilde kullanılabilir. Yöntem de mutant kütüphanelerin normal biyofilm gelişimi için gerekli genler tanımlamak için genetik ekranlar yapmak için kullanılabilir ve bileşik kitaplık ekranı ilgi antimikrobiyal bileşiklerin biyofilmler karşı etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilir. Biz gelecekteki uygulamalar mikrosıvısal aygıttaki böyle ekranlar içerecektir tahmin. Biz, ancak, bazı uyuşturucu tedavi testi olarak yetiştirilen biyofilmler bu mikrosıvısal aygıt kullanarak biyofilm kalınlığı sınırlanacaktır olduğunu unutmayın > 16 h izleme kanalının yapışmasına neden olabilir eğilimindedir. Böylece, uyuşturucu testi deneyler için yapılması gerekecektir < 16 h.

    Genel olarak, bu cihaz son derece özelleştirilebilir ve çok yönlü ve farklı mikrobiyal türler Krallık, akış hızı, sıcaklık, kuluçka süreleri ve medya arasında değerlendirmek için ayarlanabilir. Açıklanan yöntemi biyofilm oluşumu, ilk hücre bağlılık, biyofilm olgunlaşma ve hücre dağılma da dahil olmak üzere bir dizi farklı yönleri hakkında bilgiler sağlar. Biz sadece sonucu elde etmek için tek tür biyofilm oluşumu burada rapor olsa da, bu iletişim kuralını da çift ve karışık-türler - biyofilm oluşumu çalışmaya adapte olabilir.

    İki adımları başarıyla bu protokole gerçekleştirmek için kritik öneme sahiptir. İlk olarak, sistemindeki hava kabarcıkları deneysel sıcaklığında medya ön ısıtma ile kaçınılmalıdır. Bir yaygın hata değil ısıtılmış medya hücrelerde seyreltme var. Hücreleri giriş kuyular için kullanılan aynı medya seyreltilmiş. İkincisi, prizinden hücrelere wells dikkatle izlenmesi gerekir giriş akışı; hücreleri çok uzak akış, giriş medya kontamine ve deneme yorumlanabilir sonuçlar vermez. Öte yandan, daha sonra hiçbir hücre deneme sırasında kanalda görünür olacak hücreleri izleme kanalının ta taşımak için izin verilmiyorsa, boş resimlere lider. Akılda tutulması gereken ek kilit noktaları vardır hacmi ve kuyu mikrosıvısal plaka arasında hareket her sütun için birbirine bağlı ve mümkün olduğu kadar medya tutarlılığı korumak önemlidir (benzer viskozite ile yoğunluk, hücre ve kompozisyon) ve benzer şekilde boy hücreleri (mümkünse), farklı bir ortam ve farklı hücre boyutları farklı akış oranları sütun olacak gibi. Deneme sırasında geri tepme hücrelerin mikroskop kullanarak izlenir; Ancak, sadece iki kanal (10 X objektif kullanarak) bir anda görüntülenebilir. Böylece, prizinden hücreleri kullanarak giriş wells için akış için gereken süreyi ölçmek için sahte bir deney gerçekleştirmek için önerilir ve gerçek deneyde kullanılacak medya planlanmış.

    Genel olarak, in vivo hayvan test etmeden önce kullanılmak üzere bir vitro tahlil olarak bu mikrosıvısal biyofilm tahlil kullanımı önerilir. Tahlil, ancak, hala bir vitro tahlil ve sonuçları ilgili hayvan modellerinde doğrulanması gerekir. Tecrübelerimizi, bu mikrosıvısal biyofilm tahlil sonuçlarını en iyi değeri vardı diğer vitro deneyleri ile karşılaştırıldığında in vivo biyofilm deneyleri için biz14değerlendirildi var.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Clarissa J. Nobile BioSynesis, Inc, inhibitörleri ve C. albicans biyofilmler teşhis gelişen bir şirket kurucusudur.

    Acknowledgments

    Biyofilm deneyleri üzerinde tüm üyeleri için yararlı tartışmalar Nobile laboratuarı, teşekkür ederim. Bu çalışmada Sağlık (NIH) hibe R21 AI125801 (C.J.N.) ulusal Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. DLR Üniversitesi California Meksika ve Amerika Birleşik Devletleri (UC-MEXUS) ve Consejo Nacional de Ciencia y Technologia (CONACYT) Enstitüsü'nden Doktora Bursu tarafından desteklenmiştir.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    BioFlux 1000z Fluxion Automated microfluidic device for live cell analysis
    48-well plate 0-20 dyne Fluxion 910-0047 Microfluidic plate
    Montage Software Fluxion Version 7.8.4.0 Visualization analysis software
    ImageJ Software NIH https://imagej.nih.gov/ij/
    Yeast Extract Criterion C7341
    Bacto Peptone BD Biosciences 211677
    Dextrose (D-Glucose) Fisher Scientific D163
    Potassium Phosphate Monobasic Fisher Scientific P285-500
    RPMI-1640 Sigma-Aldrich R6504
    MOPS Sigma-Aldrich M3183
    Nutrient Broth Criterion C6471
    Difco D-Mannitol BD Biosciences 217020
    Agar Criterion C5001
    Amphotericin B Corning 30-003-CF
    Sterile Inoculating Loops VWR 30002-094
    Petri Dishes with Clear Lid Fisher Scientific FB0875712
    Disposable Cuvettes Fisher Scientific 14-955-127
    Lens Paper VWR 52846-001
    Microplate and Cuvette Spectrophotometer BioTek EPOCH2TC
    Shaking Incubator Eppendorf M12820004

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans Biofilms and Human Disease. Annu Rev Microbiol. 69, 71-92 (2015).
    2. Kojic, E. M., Darouiche, R. O. Candida infections of medical devices. Clin Microbiol Rev. 17 (2), 255-267 (2004).
    3. Fox, E. P., Nobile, C. J. Candida albicans: Symptoms, Causes and Treatment Options. Dietrich, L. A., Friedmann, T. S. , Nova Science Publishers. 1-24 (2013).
    4. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes Infect. 18 (5), 310-321 (2016).
    5. Uppuluri, P., et al. Dispersion as an important step in the Candida albicans biofilm developmental cycle. PLoS Pathog. 6 (3), e1000828 (2010).
    6. Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
    7. Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
    8. Nett, J. E., et al. Rat indwelling urinary catheter model of Candida albicans biofilm infection. Infect Immun. 82 (12), 4931-4940 (2014).
    9. Krom, B. P., Willems, H. M. In Vitro Models for Candida Biofilm Development. Methods Mol Biol. 1356, 95-105 (2016).
    10. Hawser, S. P., Douglas, L. J. Biofilm formation by Candida species on the surface of catheter materials in vitro. Infect Immun. 62 (3), 915-921 (1994).
    11. Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 45 (9), 2475-2479 (2001).
    12. Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. J Clin Microbiol. 49 (4), 1426-1433 (2011).
    13. Krom, B. P., Cohen, J. B., McElhaney Feser, G. E., Cihlar, R. L. Optimized candidal biofilm microtiter assay. J Microbiol Methods. 68 (2), 421-423 (2007).
    14. Lohse, M. B., et al. Assessment and Optimizations of Candida albicans In Vitro Biofilm Assays. Antimicrob Agents Chemother. 61 (5), (2017).
    15. Winter, M. B., et al. Global Identification of Biofilm-Specific Proteolysis in Candida albicans. mBio. 7 (5), (2016).
    16. Nobile, C. J., et al. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).
    17. Fox, E. P., et al. An expanded regulatory network temporally controls Candida albicans biofilm formation. Mol Microbiol. 96 (6), 1226-1239 (2015).
    18. Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).
    19. Baker, K. At the bench: A laboratory navigator. 27, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).

    Tags

    Bulaşıcı hastalıklar sayı: 130 biyofilm Candida albicans görselleştirme mikrosıvısal cihaz vitro biyofilm deneyleri biyofilm yöntemleri biyofilm protokolleri biyofilm ekranlar Laminer akım
    Görselleştirme bir otomatik mikrosıvısal aygıtı kullanarak <em>Candida albicans</em> biyofilm oluşumu
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Gulati, M., Ennis, C. L., Rodriguez, … More

    Gulati, M., Ennis, C. L., Rodriguez, D. L., Nobile, C. J. Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (130), e56743, doi:10.3791/56743 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter