Summary
ここでカンジダ皮内注射後皮膚サンプルの組織学的および分子の解析を可能にするプロトコルについて述べる。このプロトコルは、皮膚の構造的な整合性を維持でき、病原体の分布と同様、組織居住者や新人の免疫細胞の局在化のため。
Abstract
皮膚は体の非常に拡張された器官、この大きい表面のため継続的に微生物にさらさ。肌のダメージは有効で、血液中に病原体の普及の結果、真皮で感染症に簡単につながります。どのように非常に早い段階で感染症と戦う免疫システムとどのようにホストが病原体を排除することができます理解することは、将来の治療介入のベースを設定する重要なステップです。ここで述べるなど病原体がc. アルビカンスによって誘発される免疫応答と同様に、上皮のバリアを超えたとき、感染症の初期段階で発生するプロセスを視覚化することができますカンジダ感染症のモデルの侵略。皮膚と同様の存在と病原体の局在に潜入免疫細胞を示す組織学的解析を実行するのにこの感染モデルを使用しました。採取後 RNA 抽出のため感染を処理ことができます。
Introduction
人間の体は、微生物数が非常に高いで覆われています。皮膚表面は、1平方センチメートルあたりほぼ 100 万の細菌の生息地です。ただし、この数は皮膚を定着する微生物のさまざまなを反映しません。細菌だけでなく人間の体は、粘膜と皮膚のレベル2の両方を存続することができるc. アルビカンスを含む多くの菌種によって植民地化します。
近年では、真菌感染症と診断された人の割合は非常に増加しています。これは主に免疫不全者、すなわち、HIV 陽性の患者、移植3の後に化学療法や免疫抑制薬を経て患者数の増加。アメリカ合衆国で行われた監視調査、Wisplinghoffらは、院内血流感染症の 9.5% がカンジダ種4によって引き起こされたことを示した。真菌感染症とカンジダ血流感染症の中に発見の上昇の割合、特にのための高められた発生、ためこの病原体が免疫系の制御をエスケープする方法を理解することは非常に大事な。
C. アルビカンスは、酵母、blastospores、桑、5環境条件に応じて菌糸など異なる形態で育つ二形性真菌です。菌糸形態、 C. albicansはその侵襲性の最大容量を示しています、上皮6を貫通する能力を持っています。
C. アルビカンスの感染症は、いくつかの実験的アプローチを使用して研究されています。感染症の最も一般的なモデルは、 C. albicans酵母7の静脈注射です。ただし、このモデルはない考慮すべてのプロセスが起こる菌が血流に広がる管理する前に。別のモデルでは、上皮に侵入するC. albicansの機能を活用します。このメソッドでは、またとして知られている砂のペーパー モデル81998年9Gaspariらによって開発された、こうしてc.albicansを適用する前に角質を除去、肌を研磨する砂のペーパーを使用して成っています。この手順では、この病原体の侵襲的な能力の分析ができ、上皮に侵入する菌をことができます。最後に、消化管10と11気道感染症の他のモデルは、さまざまな研究で使用されています。
(砂のペーパー モデル) のように傷の形成は、癒しのプロセス12を促進するために免疫細胞の動員と活性化を含む、いくつかの経路の活性化を引き起こします。変更、または具体的結果を交絡につながる、病原体に対して誘発される免疫応答をマスクできます。
ここで初期傷の形成を回避する皮膚感染症法と基底炎症性環境の誘導について述べる。そのまま上皮構造を維持するために直接、菌糸形深いダーマでc. アルビカンスを挿入します。炎症の量が制限され、制限されているにもかかわらず、単一の注入は、軽度の炎症を引き出すことができる、砂のペーパー モデルのように開いた傷の形成と比較して。我々 はここで説明するアプローチには、真菌感染症と機械的な損傷によって引き起こされる過度なと既存の炎症性環境を回避しながら普及に免疫応答の研究ことができます。
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Protocol
すべて手順の機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) の下で承認された子供に動物資源科の監督の下で運営のボストン小児病院の病院 (ARCH) またはイタリア語によって承認されました。厚生省機関動物ケア委員会ミラノ ビコッカ大学の下。
1 C. albicansの準備。
- 文化c. アルビカンスCAF3 113、25 ° C でウリジン (50 mg/L) を添加した豊富な媒体 (酵母エキス ペプトン ブドウ糖 (YEPD)、1% (w/v) 酵母エキス、バクト ペプトン、2% (w/v) グルコースの 2% (w/v)) を含んでいる管のひずみこれらの条件の下でc. アルビカンスは酵母として育ちます。
注: C. albicansの他の系統も使えます、臨床分離c.albicansひずみ SC531413など生得の免疫組織の14、その細胞壁成分と構造を保持するすべてのc.albicansひずみ理論的に活性化による、潰瘍性のプロセスことを示してきたからだけでなく、菌糸の予測を発信する機能を使用できます。 - 細胞カウンター アナライザーを使用して細胞濃度をカウントすることによって文化を監視します。
- 約 8 × 106セル/ml の濃度に達すると文化を収穫します。また、外径600を測定するのに分光光度計を使用します。
注: 通常、外径 φ600の値 = 3 × 10、7セル/ml の酵母濃度に対応する 1 が、滴定をお勧め。 - YEPD ウリジン中、バッファー剤として HEPES (50 mM、pH 7.5) を使用して文化を再懸濁し、菌糸の形成を誘導する 37 ° C で文化を孵化させなさい。100 倍の倍率の顕微鏡で菌糸の形成を確認します。菌糸の形成は 37 ° C で培養後表示 5 h です。ただし、菌糸の割合が全体の文化のほぼ 95% に達した場合、37 ° C で培養後セル 16 h を使用します。
- 菌糸の濃度で準備をさらに充実させて、遠心分離機因数 3,300 x g で 5 分間の文化の上澄みを廃棄し、1 × 108菌糸/mL の濃度で滅菌 PBS でペレットを再懸濁します。
2. 深い皮膚注入
- 24 時間前感染症プロシージャはケタミン (80-100 mg/kg) およびキシラジン (10 mg/kg)、腹腔内注入マウスを麻酔し、電気クリッパーを使用してマウスの側面を剃る。
注: 麻酔を含むプロシージャの後彼らが効率的に回復するまで、加熱ランプの下でマウスを配置します。 - シェービング加工による任意の炎症を避けるために 24 時間のマウスを置きます。
- シェービングの手順後 24 h は、ケタミン (80-100 mg/kg) およびキシラジン (10 mg/kg 腹腔内注射マウスを麻酔します。
- 足反射マウスが深く麻酔したことを確認するを確認します。足をしっかりとつまんで足反射を評価します。麻酔が達成された場合、動物は痛みを感じていないと動かない。
- 50 μ L/注入、5 x 106菌糸・射出に対応する最終巻で 30 x 8 mm 針で 0.3 mL インスリン注射器を使用して深いダーマのc.albicans菌糸を注入します。
- 深いダーマに直接ボリュームを注入するために 2 本の指を使用するピンと張った坊主の側面の皮膚を引っ張ったり。針が上向きの傾斜面と 10 ~ 15 ° の角度で針を挿入します。
- この角度、病原体は約 300-500 μ m の深さと注入されます。注射はよく実行するはバンプの噴射量フォームが注入後数分を吸収されることを確認します。
注: バンプ形成後約 1 cm2の注射になります。これは、分子または組織学的分析のための指定された時点で削除される領域です。 - (推奨) 24 h 未満の時間ポイント マーカー ペンで注入を形成したバンプ吸収後、数分持続するので感染症の領域をマークします。24 時間以上の時間ポイントの潰瘍または嚢胞のどちらかが明確に表示されるため、この手順は必要、ありません。
3. サンプルの収集と組織染色のための準備
- 制度の手順に従ってマウスを安楽死させます。
- 以前マーカー ペンでマークされた、注入されたサイトの境界に皮膚を引っ張って手術用鉗子を使用して、します。外科はさみを使用すると、マークのラインの皮膚を切断することによって感染したサイトを切除します。
注: ラウンド チップはさみを使って腹膜から皮膚を分離するように気をつけてください。 - 上向き肌の内部側で最適な切削温度 (OCT) 化合物は、いっぱい使い捨て基本金型で肌を浸します。化合物が白になるまでは、液体窒素でサンプルを凍結します。サンプルをカバーこれはサンプルを損なうことになると、それは完全に凍結され前に液体窒素を聞かせていません。
注: 注意!ステップ 3.3 の間に液体窒素から保護するため顔面シールドを着用します。 - サンプルをスライド準備のためすぐに使用しない場合-80 ° C で急速に保存します。
注: サンプルすることができます-80 ° C で不明確に保存されます。
4. スライドの準備
- サンプルは、サンプルの中心から始まって組織学のためのスライスを準備する半分にカットします。
- クライオスタットと 5 μ m の厚さのスライスをカットします。
メモ: 皮膚のサンプル、クリオスタットの温度ではありません-25 ° C 以上の高H 10 月の部分溶融高温になります、したがってサンプルが維持されない正しい位置で切断のプロシージャの間に。 - 正荷電の顕微鏡のスライドを使用して、スライスを収集します。
- 収集スライスを準備の後すぐに使用しない場合は-20 ° C で保存します。この時点で、スライス-20 ° C で不明確に保存されることができます。
5. ヘマトキシリン ・ エオシン染色
- 5 分間流水でスライド 4 分洗浄ギルのヘマトキシリン浸漬によってスライドを染色します。
- 水道の流水で 5 分間洗浄プロトコルを続行する前に蒸留水を使用してスライド内のスライド 1 分洗浄エオシン Y 溶液中浸漬によるスライドを染色します。
- 連続エタノール溶液 (50%、70%、80%、95%、100%) 濃度の増加に浸すことによって脱水します。15 のスライドを浸す各エタノール溶液で s。
- 組織学的クリア剤浸漬によって、少なくとも 2 分間スライドをオフします。
- メディアをマウントし、カバー スリップを使用してスライドをマウントします。
- 40 倍の倍率での顕微鏡スライド スキャナーと、スライドのイメージを取得します。
6. 過ヨウ素酸シッフ (PAS) 染色
- 1 分の水道水を実行しているスライド 1 分洗浄のため室温で ≥99.5% アセトンでスライドを固定します。
- 染色スライド周期酸溶液 (1 g/dL) 浸漬によって 5 分洗浄の蒸留水の 3 変化でスライド。
- スライド 15 分洗浄シフの試薬に浸漬 5 分間水道水を実行しているスライドを染色します。
- 5 分洗浄は 30 に水道の流水で滑るのためギルのヘマトキシリン浸漬によってスライドを染色 s。
- 3 変更の 100% エタノール浸漬によってスライドを脱水します。15 のスライドを浸す s たびに。
- 組織学的クリア剤浸漬によって、少なくとも 2 分間スライドをオフします。
- メディアをマウントし、カバー スリップを使用してスライドをマウントします。
- 顕微鏡スライド スキャナーと、スライドのイメージを取得します。
7. サンプルの収集と RNA の抽出のための準備
- 制度の手順に従ってマウスを安楽死させます。ステップ 3.2 のように皮膚のサンプルを削除します。
- 酸のためチオシアン酸-フェノール-クロロホルム抽出用試薬 1 mL を 2 mL スナップ キャップ チューブに試料を浸します。
注: プロトコルがここで一時停止にすることができ、サンプルは-80 ° C で保存できます。 - 約 0.2 cm2を用いての手術用鉗子にサンプルを切る。
注: 注意!RNA の隔離のための試薬のほとんどは、毒性、変異原性。7.3 と 7.4 の手順を実行する必要がありますは、ヒューム フードの下で行われます。 - また 20 分の 20 振動/秒の速度でビーズミルでサンプルを粉砕、機械的・ ポッターを使用ことができます。
- 皮膚のままの作品の存在を捜すことによってサンプルの効果的な均質化を確認してください。サンプルは完全に均質化しない場合は、この手順を繰り返します。
- 遠心分離機の 16,000 x g で 1 分間維持でサンプルの RNA の抽出上清、ペレットを破棄します。髪や抽出列をブロック可能性があるがれきを除去するためにこの手順を実行します。
- RNA 精製列14を使用して RNA の抽出を続行します。
- 分光光度計を使用すると、RNA の精製・濃縮を評価します。RNA 抽出を cDNA の準備のためすぐに使用しない場合は-80 ° C で試料を保存します。
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Representative Results
深いダーマで直接病原体の注入を通して組織の形態のままそのまま (図 1 a)。
皮膚構造健全性の維持では、免疫細胞の検出と感染症のサイトに局在をことができます。図 1 bに示すように高倍率では、膿瘍は主に感染症のサイトにその閉じ込め病原体の広がりを含む多形核白血球 (Pmc) の撰を明らかにします。好中球など、Pmc の募集組織14内菌の拡散を避けるため、膿瘍の形成が可能で。高倍率 (図 1d) を示すどのように膿瘍の周辺地域は、Pmc で濃縮されまた。
構造的な整合性を維持することによって、感染病原体の局在を決定できます。C. アルビカンス、病原体の同定の細胞壁多糖類の高いコンテンツの利用を行った PAS 染色を使用して菌に紫マゼンタ色を与えます。図 2 aに示すとおり、PAS 染色は、顆粒球14の採用によって形成される膿瘍中病原体に閉じ込められことを明らかに示します。C. アルビカンスは高倍率 (図 2 b) に明確に表示され壊死および免疫細胞によって囲まれます。
上記の方法を使用して、時間の経過とともに感染過程やそれに伴う炎症を続けてできます。当初、免疫細胞で募集は、(図 1 a 図 3 a) 膿瘍の形成に します。48-72 h、皮膚構造の破壊と瘢痕の形成は可視化した皮膚組織の解析まで延長されたとき (図 3 bC)。この構造体の形成は、病原体14の追放に続く癒しの段階によるものです。
潰瘍の形成を導くプロセスは、感染後数日間続くことができます。図 4 aのように、c57bl/6 野生型マウスは時間の経過とともに増加する潰瘍性のプロセスを表示します。約マウスの 70-80% は感染後 72 h 潰瘍の形成を示します。実験的変動により少なくとも 8 マウスはすべての実験で使用ください。統計解析は、異なる遺伝子型または治療法を比較する場合各潰瘍スコア 8-10 マウスの最小値を使用することをお勧めします。この場合、小さな相違点が表示されます。潰瘍性のプロセスの説明写真は、図 4 bに表示されます。特定の治療法や遺伝的欠陥、時に潰瘍形成減らすことができるおよび/または14を廃止します。いくつかのケースで、潰瘍ではなく嚢胞形成、図 4に示すよう。
ヘマトキシリン ・ エオシンと PAS 染色、以外いずれかの特定の細胞マーカーや他の免疫組織化学的染色を見やすくしますスライドは汚すことが: コラーゲン線維;組織内サイトカイン/ケモカインの場所免疫細胞の識別と分布。
組織学的準備に加えて、分子解析ものサンプルを使用できます。全体の注射部位は、組織学的製剤に関しては、切除し、RNA の抽出の処理できます。組織からの RNA 抽出研究と病原体との伝染の間にそれらの遺伝子の誘導の同定ができます。分子解析のためのサンプルを処理する可能性がより良いために、組織学的解析とともに、重要なツールを特徴付ける病原体と初期段階および後期段階の規制に対して誘発される免疫応答の種類後チャレンジ14。
図 1: 皮膚の形態や細胞局在の保守します。(A) すべてのレイヤーが保持されます。筋細胞、脂肪細胞、上皮は、簡単に認識できます。(B) 多形核白血球 (矢印で強調表示) は、膿瘍内で識別できます。(C、 D)高倍率は、膿瘍を周辺エリアに多形核白血球 (矢印) の存在を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
C. albicansの図 2: 識別します。(A) c. アルビカンスは PAS 染色で組織内で検出できます。紫色のステンド グラス、菌を見やすくします (B) 高倍率は膿瘍内限定。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 炎症性プロセスのフォロー アップします。(A) C. albicansの注入によって誘発される炎症性プロセスの非常に初めに、顆粒球は病原体に限定する膿瘍を形成するために募集しています。(B、 C)潰瘍の形成は、菌の追放のため必要です。癒しの組織は皮膚の構造の整合性の変質によって特徴づけられるし、傷跡の形成につながることができます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 潰瘍の動力学。感染後の最初の日の間に増加の傾向を (A) 潰瘍性プロセス次のよう。感染後 72 時間は、マウスの 70-80% は、感染部位に潰瘍を示しています。16 C57BL/6 野生型動物が使用されました。(B) 感染後 48 h を開発した潰瘍の例示写真。(C) 感染後嚢胞形成の説明写真です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここで深いダーマの真菌の入口に開始される炎症過程を研究するC. albicans感染症法について述べる。
深いダーマで直接菌の注入により駆動型真菌膿瘍形成の研究だけでなく、特定の免疫の解析、皮膚膿瘍形成はC. albicans感染15時に比較的まれなイベントが、真菌を含む参加細胞は します。ここで説明する方法、それは機械的破損や傷、炎症反応を回避しながら、真菌の拡散を制御する重要な免疫細胞の募集と同様、免疫細胞間の相互作用を研究することが可能形成します。確かに、上皮の構造をそのまま維持する可能性は、耐摩耗性などの機械的刺激による炎症性環境の開発を避けるために重要です。理論初めてポリー Matzinger によって 1994年16で、として損傷信号、実際をアクティブに免疫応答し、その結果、強力病原体によって誘発される免疫反応に影響を与えます。
関連する損傷の分子パターン (DAMPs) ことができます死んだ細胞由来が、ストレス条件下でリリースすることも。これらの信号は、組織の損傷の状況を作り出すことができる、ので、傷の形成は感染症のコンテキストの前にもハイパー炎症性環境になります。については法は DAMPs のリリースを制限し、要素を交絡のプレゼンスを削減します。
また、直接深いダーマに病原体の注入は真菌感染症のみならず細菌課題に使用できる手法です。病原体別皮膚の両方の症例数の上昇を担当、血流感染症は黄色ブドウ球菌4です。我々 は最近、どのように、このプロトコルは、また黄色ブドウ球菌感染症14を研究する重要なツールを示しています。特に、ブドウ球菌は体17のいくつかの地区で膿瘍をフォームする能力のための診療所で知られています。黄色ブドウ球菌によって駆動される非常に初期のイベントの研究が、治癒につながる免疫反応の関与だけでなく、発生と同時にでき、膿瘍の形成につながる深いダーマの黄色ブドウ球菌の注入相。
最後に、ここで説明した方法論のもう一つの重要な特徴はそのまま上皮構造のメンテナンスが組織学的に免疫細胞の局在と活性化することができます異なる経路を分析する可能性を与えること空間的に区分されました。これらの実験条件下で実際には、皮膚の別の解剖学的構造が変わらないし、免疫細胞と炎症性メディエーターを正確な位置で視覚化することができます。
免疫細胞の分布を保存するこのメソッドの使用するに真菌や細菌性の皮膚感染症の中に各細胞のタイプの役割を理解するために理想的です。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
FG は、ラ Ricerca スル Cancro (IG 2016Id.18842) あたり Associazione イタリアーナ、Cariplo 財団 (助成 2014年-0655) とラ Ricerca Biomedica (FRRB) あたりスタンパーリアラヴェッロ オルシによってサポートされます。
IZ は、NIH グラント 1R01AI121066 01A1, 1R01DK115217, マルチカメラ P30 DK034854 グラント、発見したハーバード医療学校ミルトン、CCFA シニア研究賞 (412708)、エレノア、マイルの海岸に支えられて 50 周年記念フェローシップ プログラムと Cariplo 財団 (2014-0859)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS | Euroclone | ECB4053L | warm in 37 °C bath before use |
| H-OCT compound | histo-line laboratories | R0030 | |
| Gill's Hematoxilyn | histo-line laboratories | 09-178-2 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | histo-line laboratories | 09-209-05 | |
| Ethanol absolute | scharlau | ET00232500 | |
| Citro-HISTOCLEAR | histo-line laboratories | R0050 | |
| Eukitt, mounting medium | bio-optica | ||
| Acetone | sigma-aldrich | 179124 | |
| PAS staining system | sigma-aldrich | 395B-1KT | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology | Applichem PanReac | 50-99-7 | |
| Uridine | Merck Millipore | 8451 | |
| HEPES | Applichem PanReac | A1070,0500 | |
| Safe-Lock tubes 2 mL | eppendorf | 30121597 | |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596018 | Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed |
| Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| liquid nitrogen | Wear eye protection | ||
| Instrument | |||
| Coulter Counter-Particle Count | Beckman Coulter | ||
| Centrifuge 5415 R | eppendorf | ||
| MC 3000 Microtome Cryostat | histo-line laboratories | ||
| TissueLiser | QIAGEN | ||
| Materials | |||
| 0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle | BD | 324826 | |
| Surgical forceps | |||
| Surgical scissors | |||
| Base mould disposable | histo-line laboratories | 2781 | |
| Positively charged bio microscope slides | bio-optica | 09-2000 | |
| Cover slips 24 x 50 mm | thermo scientific | 11911998 |
References
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