In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.
Syntetiske materialer er kjent for å initiere kliniske komplikasjoner som inflammasjon, stenose, og infeksjoner når implantert som vaskulære substitutter. Kollagen har vært i utstrakt bruk for en lang rekke biomedisinske anvendelser, og er ansett som en gyldig alternativ til syntetiske materialer på grunn av sin iboende biokompatibilitet (dvs. lav antigenisitet, inflammasjon og cytotoksiske responser). Imidlertid har de begrensede mekaniske egenskaper og relaterte lav hånd-evne kollagen gels hemmet deres bruk som stillasmateriell for vaskulær tissue engineering. Derfor er begrunnelsen bak dette arbeidet var først å konstruere cellularized kollagen gelen i en rørformet geometri og andre for å forbedre glattmuskelceller drevet reorganisering av kollagen matriks for å oppnå vev stive nok til å kunne håndteres.
Den strategi som er beskrevet her er basert på den direkte montering av kollagen og glatte muskelceller (konstruere) i et 3D cylindrical geometri ved bruk av en støpeteknikk. Denne prosessen krever en modningsperiode, under hvilken konstruksjonene dyrkes i en bioreaktor under statiske betingelser (uten påsatt ytre dynamiske mekaniske begrensninger) for en eller to uker. Den "statisk bioreaktor" gir en overvåket og kontrollert sterilt miljø (pH, temperatur, gassutveksling, næringstilførsel og fjerning av avfall) til konstruksjonene. I løpet av dyrkningsperioden ble tykkelsesmålinger utført for å evaluere celler drevet ombygging av kollagenmatriksen, og glukoseforbruk og laktatproduksjon rater ble målt til å overvåke cellene metabolsk aktivitet. Til slutt ble det mekaniske og viskoelastiske egenskaper vurderes for de resulterende rørformede konstruksjoner. For dette formål, spesifikke protokoller og en fokusert kunnskaper (manipulasjon, gripende, som arbeider i hydratisert miljø, og så videre) ble utviklet for å karakterisere de konstruerte vev.
Vaskulær tissue engineering ser for seg ulike strategier rettet mot fabrikasjon av konstruerte fartøy, inkludert grafts basert på syntetiske stillaser, celle sheet-baserte vev-konstruert blodkar (TEBVs) og ekstracellulære matrix (ECM) komponenter basert TEBVs. Blant disse metodene, syntetiske polymerer som oppviser gode mekaniske egenskaper, men har en felles ulempe som de mangler es bioaktivitet. Cellen ark basert metode tillater produksjon av konstruerte vaskulære erstatninger med høye mekaniske egenskaper, men den tid som kreves for å produsere slike grafts er omtrent 28 uker 2. Naturlige biopolymerer av ECM, slik som kollagen, elastin, fibrin 3 eller en kombinasjon derav, være gullstandarden materialer av vev stillaser. Dette er først og fremst på grunn av at disse materialene har en generelt god biokompatibilitet og være i stand til å indusere funksjonelle cellulære responser 4-5. Blant disse biopolymers, type I kollagen er en av de mest tallrike og dominerende bærende protein ifølge ECM i mange vev, slik som hud, sener og blodårer. Omfattende arbeid har blitt utført på de mekaniske egenskaper av kollagen 6 – 8, men det har vært få studier på cellulær ombygging av kollagen geler i løpet av statisk modning. Cellular ombygging refererer til de strukturelle modifiseringer av kollagen matriks indusert av celler som kan påvirke stabiliteten av kollagen fibriller nettverk 9. Som en naturlig stillas, kan forholdsvis store mengder av type I kollagen isoleres, steriliseres og lagres fra forskjellige kilder slik som rotte-hale sener 10. Forstå cellulære interaksjoner med kollagen og tilknyttede generelle mekaniske atferd av cellularized kollagen stillaser (konstruerer) er et viktig skritt for bygging av vev. Kollagen-baserte TEBVs kan behandles ved direkte å blande celler med kollagengel under fremstillingen og videre støpes til bestemte former som rørformet og plane 11. Vaskulære celler inne i gels sprer og oppussing type I kollagen 12. Således, omgår denne metoden behovet for spesifikk makroporøsitet som representerer en av de viktige problemene i utviklingen av stillas for vev tekniske anvendelser. Imidlertid har de store ulempene med kollagen geler er deres lave mekaniske egenskaper sammenlignet med syntetiske materialer 13.
I denne studien ble en levedyktig vev med homogen fordeling av celler konstruert ved direkte blanding av kollagen med celler i en ett-trinns prosess. "Statiske bioreaktorer" ble brukt til en eller to uker med statisk modning av cellularized kollagen gels (uten påført ytre dynamiske mekaniske begrensninger). Under kultur, kollagenmatriksen ombygging inntraff, og dermed gi strukturell forsterkning til konstruksjonene. Videre har disse konstruksjoner ble ready å bli overført til en roterende vegg bioreaktor og en homogen endotel var oppnådd. I tillegg, i dette arbeidet en spesifikk mekanisk testprotokollen er også foreslått å gi en passende ny fremgangsmåte for å karakterisere de mekaniske egenskaper for rørformede bløtvev.
Oppsummert viser dette arbeidet en fremgangsmåte for in vitro hurtig fabrikasjon og modning av vaskulært vev som er sterke nok til å kunne håndteres, ikke bare for biologiske og mekaniske karakteristikker, men også for ytterligere mekanisk kondisjonering i en dynamisk bioreaktor, som er ansett som et viktig trinn i regenerering av vev.
Blant fellesskap av vaskulært vev ingeniører, er enorme anstrengelser blitt gjort for å reprodusere tunica media laget ansvarlig for den mekaniske stabilitet av blodkar 16. Siden den banebrytende arbeid for Weinberg og Bell 17, har kollagen blitt mye brukt som et stillas for vaskulær tissue engineering grunn av sin biokompatibilitet, ikke-immunogene egenskaper og tilgjengelighet. Men bruken av kollagen er en stor utfordring for forskere, da dette materiale ikke er lett å håndtere, på grunn av den iboende mangel på mekanisk stivhet. Manipulasjoner under stillaset preparatet kan skade stillasene, at det går dem for videre bruk.
Den teknikk som er beskrevet i dette arbeidet kan: i) å konstruere cellularized kollagen gel inn i en rørformet geometri, ii) å konstruere biologisk vev sterk nok til å kunne håndteres etter kort statisk modningsperiode (en eller to uker), iii) til såsess mekaniske og viskoelastiske egenskaper til slike rør-formet biologiske vev i to retninger. Celler i gelen spille en nøkkelrolle i kollagenmatriksen ombygging. Under modningsperioden, kontraktile SMC førte til komprimering av gelene som gir en konstruksjon med høyere mekanisk stabilitet som kan vurderes i den langsgående og periferiske retninger. Etterpå HUVECs seedet i luminal siden av konstruksjonene generert en homogen og levedyktig endotelet, og dermed demonstrere egnethet kollagen gels for vaskulære vev tekniske applikasjoner.
Bioreaktor presentert i dette arbeidet ble spesielt utviklet for å gi et optimalt miljø for cellevekst under statisk modning. I tillegg ble de anordninger som er utviklet for karakterisering av de mekaniske og viskoelastiske egenskaper av konstrukter utformet med sikte på å redusere eventuelle skader som ligger til manipulering avslike delikate materialer. Derfor ble den statiske bioreaktor utstyrt med et 0,22 mikrometer filter og en filtermembran på kapselen (trinn 1.1.2, figur 1A og B) som mulig for gassutveksling mellom kulturmediet på innsiden av reservoaret og inkubatoren, samtidig som et sterilt kulturmiljøet. Luer septum i bunnen ble brukt som en port for kulturmedium prøvetaking og endring i løpet av statisk kultur. Noen viktige skritt må tas hensyn til ved konstruksjon fabrikasjon og karakterisering. Alle manipulasjoner (utført i trinn 2.1.1 og i de etterfølgende trinn) som kan endre sterilitet av systemet ble utført i en steril biologisk hette. Celler og kollagen gel blanding forberedelse ble håndtert på is for å forsinke geleringsprosessen (trinn 2.1.4 til 2.1.7). I trinn 2.1.7, eventuelle luftbobler fanget i blandingen før gelering er potensielle stresset konsentrasjon områder som kan kompromittere slønnsomhet av konstruksjonene. Derfor krever fjerning av slike luftbobler lett risting montering eller ved hjelp av medisinsk vakuum i 3 minutter for degasing i sterile betingelser. Til slutt ble grepene spesielt utformet for å holde aksen til spindelen sentralt i den rørformede formen under gelering og for å tillate manipulering av delikat konstruksjonene ved høsting (fjerning av doren, seksjon 2.4), for endotelialisering, og for å lette montering på det mekaniske systemet (langsgående tester).
Den nåværende protokollen foreslår en original lett-å-prosessen alternativ tilnærming til forsterkning av kollagen gels konstruksjoner basert på naturlig iboende kontraktile potensialet i SMC. Vanlige teknikker for kollagen-matriser armering innebære bruk av fysiske og kjemiske tverrbindingsmidler som kan ha skadelige virkninger på celler-matriksinteraksjoner 18 – 20. Fabrikasjon teknikk presenteres idette arbeidet lar regissere denne celler-drevet ombygging prosessen for å gi en vev-konstruert konstruksjonen med målrettede mekaniske egenskaper uten noen fysisk eller kjemisk behandling.
Karakterisering av mekaniske og viskoelastiske egenskaper av hydrerte kollagen gels er en stor utfordring. I dette perspektivet beskriver den nåværende protokollen en original enkel og effektiv metode for å vurdere de mekaniske egenskapene rørformede bløtvev. Denne karakterisering kan utføres ikke bare i omkretsretningen, men også i lengderetningen, direkte på hele rørformede strukturen. Under mekanisk karakterisering, temperatur, vandig miljø, pH og ionestyrke er noen av miljøfaktorer som er kjent for å virke kraftig mekanisk oppførsel av biologiske vev 21. Derfor antyder en original oppsett og protokoll for mekanisk karakterisering av biologiske vev i en sterkt foreliggende arbeidreproduserbar pseudo-fysiologisk miljø (saltoppløsning ved 37 ° C og pH 7,4). Så langt vi kjenner til, har denne type karakterisering aldri blitt rapportert andre steder.
Konklusjonen er at den teknikk som foreslås i dette arbeidet demonstrerer den høye potensialet for direkte blanding av celler med kollagen til vaskulært vev tekniske anvendelser. Denne metoden sammen med den mekaniske karakterisering og endotelialisering prosess utgjør høye flerverdige protokoller. Derfor gjennom små modifikasjoner av set-ups og protokoller samtidig holde den samme begrunnelsen, viktigste kravene for ingeniør vaskulære vevsekvivalenter kan adresseres slik som rask og ukomplisert behandling, inkludert endotelialisering, og muligheten til å bli overført til et bredt spekter av myk vev med forskjellige lengder og diametere. Videre er forskjellig adherente celletyper, ECM-proteiner og støpte geometrier kan bli undersøkt for et antall målrettede applications, for eksempel ingeniør sener, hud grafts, hjerte patcher, nerver, blant andre. Selv om de mekaniske egenskapene til konstruksjonene er oppmuntrende, er de fortsatt lavere enn de innfødte vev. I denne sammenheng har vi overbevist om at en meget kort statisk modningstid er et viktig skritt mot den dynamiske stimulering i en bioreaktor, og dermed fører til en høyere strukturell integritet og mekanisk stabilitet. Men muligheten til raskt å produsere vev-konstruert cellularized kollagen-baserte konstruksjoner egnet for mekanisk og histologiske analyser gjør det statiske bioreaktor beskrevet her et nyttig og lovende verktøy for å gi innsikt i samspillet mellom celler og ECM under vekst og ombygging, eller til å brukes som en modell for terapi og medikament-leveringssystemer.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble finansiert av Natural Science and Engineering Research Council of Canada, den kanadiske Institute for Health Research og CHU de Québec Research Center.
CellTreat 50 mL Bio-Reaction tubes | CELLTREAT Scientific Products | 229-475 | Centrifuge tube |
Male luer with lock ring x 1/8" hose barb. PP. 25/pk | Cole Parmer | RK-45503-04 | Luer fittings for "gas-exchange port" |
Female luer x 1/8" hose barb adapter. PP. 25/pk | Cole Parmer | RK-45500-04 | Luer fittings for the "medium sampling port" |
Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 17. 25 ft. | Cole Parmer | RK-96410-17 | Tube 1 and 2 for the gauze grippers |
Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 16. 25 ft. | Cole Parmer | RK-96410-16 | Tube 3 for the gauze grippers |
Silastic Medical adhesive silicone, type A | Dow Corning | – | Silicon glue for the fabrication of the static bioreactor |
Polyvent 4 Vessel venting filters | Whatman | 6713-0425 | Filter for "gas exchange port" |
Rod. PP. stirring. 8’’ | Scienceware | 377660008 | Mandrel |
Stopper silicone rubber 00 PK12 | VWR | 59590-084 | Stopper for the insertion of the mandrel to the vented cap of the centrifuge tube |
Krytox PFPE/PTFE Greases | Dupont | GPL 202 | Medical grade grease for covering the mandrel |
Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 | Cell culture |
Xiameter RTV-4130-J base and curing agent | Dow Corning | – | C-shaped silicone support for endothelialization |
Dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco (Life Technology) | 11995-065 | Cell culture |
Pure acetone (99%) | Laboratoire Mat Inc. | AP0102 | Chemical for collagen extraction |
Isopropyl alcohol (HPLC grade, 99.9%) | Fisher Scientific | AC610080040 | Chemical for collagen extraction |
0.02 N acetic acid (glacial acetic acid, HPLC grade, 99%; Fisher Scientific, | Fisher Scientific | FL070494 | Chemical for collagen extraction |
Chloroform solution (99%) | Laboratoire Mat Inc. | CR 0179 | Chemical for collagen extraction |
Hepes | Sigma-Aldrich | 163716 | Chemical for construct preparation |
NaOH | Laboratoire Mat Inc. | SR-0169 | Chemical for construct preparation |
LaserMike 136 | LaserMike | Series 183B | Scanning laser interferometer |
ElectroPulse MicroTester | Instron Corporation | – | Micromechanical Tester |
HyClone Media M199/EBSS, 500 mL | GE Healthcare Life Sciences | SH30253.01 | Component of cell culture medium |
Fetal bovine serum HI – 500mL | Gibco | SH 30396.03 | Component of cell culture medium |
Porcine serum (PS) | Sigma-Aldrich | P9783 | Component of cell culture medium |
Penicillin-Streptomicin | Gibco | 15140-122 | Component of cell culture medium |
Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP661-50 | Saline solution |
Tissue culture flask T17CN Vent Cap Red | Sarstedt Inc. | 83.1812.002 | Cell culture |
ColorpHast- pH-indicator strips (pH=6.5-10.0) | EMD | 9583 | pH measurements |
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 mL vial | BD Biosciences – Discovery Labware | 356230 | Concentrate protein mixture for endothelialization process |
LifeCam VX-3000 | Microsoft | – | Thickness measurement |
Biochemical analyzer, DxC600 | Beckman Coulter Unicell Synchron | – | Glucose and lactate concentrations measurements |
Collagen fibers | Rat tails | – | Collagen was extracted in the laboratory |
Porcine smooth muscle cells (pSMCs) | Porcine aortas | – | pSMCs were isolated in the laboratory |
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Human umbilical veins | – | HUVECs were isolated in the laboratory |