Vi beskriver användningen av en roman, frekvens-domän luminiscens livstid kamera för kartläggning 2D O2 distributioner med optisk sensor folier. Kamerasystem och bildanalys förfaranden beskrivs tillsammans med förberedelse, kalibrering och tillämpning av sensor folier för att visualisera O2 mikromiljö i rhizosfären av vattenväxter.
Vi beskriver en metod för att bilden upplöst syre (O2), i 2D vid hög spatial (< 50-100 μm) och temporal (< 10 s) upplösning. Metoden sysselsätter O2 känsliga självlysande sensor folier (planar optodes) i kombination med ett specialiserat kamerasystem för avbildning luminiscens livstid i frekvens-domän. Planar Optoder bereds genom upplösning av O2-känsliga indikator färg i en polymer och sprider blandningen på ett stabilt stöd i en definierad tjocklek via kniv beläggning. Efter avdunstning av lösningsmedlet, är planar optode placerad i nära kontakt med urvalet av intresse-här demonstreras med rötterna av vattenlevande växt Littorella uniflora. Den O2 koncentrationsberoende förändringen i Luminescens livstid för indikator färgen inom planar optode är avbildad via baksidan av den genomskinliga bärarfolien och akvarium väggen med hjälp av en speciell kamera. Denna kamera mäter luminiscens livstid (μs) via en förskjutning i fasvinkel mellan en modulerad excitation signal och emissions signal. Denna metod är överlägsen luminiscens intensitet Imaging metoder, eftersom signalen är oberoende av färgämnes koncentrationen eller intensiteten i excitation källa, och enbart förlitar sig på luminiscens förfall tid, vilket är en egen refererade parameter. En ytterligare referens färg eller andra metoder för referering behövs därför inte. Vi visar användningen av systemet för makroskopisk O2 avbildning av växtrhizospheres, men kamerasystemet kan också enkelt kopplas till ett mikroskop.
Distribution och dynamik av lösta gaser och joner i sediment och jordar ger viktig information om biogeokemiska processer såsom mikrobiell andning1,2, eller radiell syre förlust från växternas rötter3,4,5, och den kemiska mikromiljön av mikrober6,7, växtrhizospheres5,8,9 och djurburrows10, 11,12. Biologisk och kemisk aktivitet i sådana diffusions begränsade miljöer kan skapa branta lutningar av kemiska substrat eller produkter av biogeokemiska processer. I synnerhet, O2 tillgängligheten har en enorm inverkan på biogeokemiska processer och därmed biologi och ekologi i ett system13. Därför, analysera O2 koncentrationer vid hög spatial och temporal upplösning är av största vikt i akvatiska och terrestra vetenskaper. För det första utvecklades elektrokemiska och optiska mikrosensorer14,15 för att mäta denna viktiga analyt. Senare introducerades 2 dimensionell (2D) avbildning av o2 med planar Optoder12,16,17,18,19, vilket möjliggjorde visualisering och kvantifiering av den heterogena O2 -fördelningen i jordar och sediment.
Planar O2 Optoder består av en O2-känslig indikator färg20, som löses upp i en lämplig polymer21. Indikatorn färg är upphetsad vid specifika optiska våglängder och avger rödförskjuten ljus vid avslappning i form av luminescence. I närvaro av O2, upphetsad indikator färgämne kan överföra sin energi till O2 molekylen vid kollision, som kallas kollision-baserade luminiscens kylning22. Därför reduceras Luminescens intensitet och Luminescens livstid med ökande O2 koncentration23. I ett idealfall följer förändringen i intensitet och livstid den Stern-Volmer ekvation (ekvation 1) med antingen luminiscens intensitet eller livstid i frånvaro (i0; τ0) eller närvaro (i, τ) av O2 vid en given koncentration [Q]. Den stränga-Volmer konstanten (Ksv) är en mäta för känsligheten av optoden in mot nolla2; Ksv är beroende av miljövariabler som temperatur och tryck.
1
Inspelning av sådana förändringar i Luminescens över en planar sensor folie med ett kamerasystem kan användas för att visualisera motsvarande förändringar i O2 distribution. Initialt användes enkel Luminescens intensitetsbaserad O2 -avbildning18. En sådan metod är dock mycket känslig för yttre interferenser, som äventyrar tillförlitligheten hos resultaten på grund av heterogen belysning, fluktuationer i exciteringskällan eller kameran, samt ojämn fördelning av indikator färg inom planar optode.
Några av dessa begränsningar kan lindras genom att använda planar Optoder för ratiometriska Imaging17,24, där O2-Sensitive indikator färg är co-immobilized i polymerskiktet av planar optode med en okänslig referens färg som avger i ett annat spektralområde än O2-indikatorn. Baserat på utsläpps bilder förvärvade i två spektrala fönster, den O2-känsliga emissions signal divideras med referens signalen, genererar en förhållande bild som är mindre benägna att de ovan nämnda interferenser5,17. Metoden kräver användning av en andra färg, som helst kan vara upphetsad av samma excitation källa, men avger på en annan våglängd (utan betydande spektrala överlappning), i ett annat spektralfönster av kameran (t. ex. i en annan färgkanal i en RGB-kamera).
Alternativt kan O2 avbildning baseras på att kvantifiera den o2-beroende förändringen i Luminescens livstid för indikator färgen, som inte påverkas av ojämn belysning eller heterogen i indikator koncentrationen25. Första luminiscens Lifetime-baserade O2 Imaging system baserades på tidsdomän mätningar med en grind-able laddade kopplad enhet (CCD) kamerasystem26, där en pulsad excitation källa används och luminiscens bilder tas över definierade tidsintervall inom excitation eller emission av indikatorn8,23,27. Från sådana bilder kan luminiscens-livstiden bestämmas och korreleras till motsvarande O2 -koncentration i en kalibrering. Därefter kan luminiscens livstids bilder för ett givet prov pressas mot planar optode omvandlas till bilder av motsvarande 2D-distribution av O2 koncentration. Detta system har använts i många tillämpningar både i laboratorium och på plats16,28, men den väsentliga porten-kan CCD-kamera är inte längre kommersiellt tillgänglig.
Nyligen släpptes en annan luminiscens livstid kamerasystem, som förvärvar bilder i frekvens-domän8. Systemet förlitar sig på en kontinuerligt modulerad ljuskälla för excitation. Detta kan antingen vara en sinusformad eller fyrkantig våg i stället för en pulsad excitation, som används för bild förvärv i tidsdomänen. Denna modulering resulterar i en modulerad luminiscens emission av O2 -indikatorn färgämne, som är fas förskjuten med en vinkel, φ, som är beroende av luminiscens livslängden för indikatorn färg (τ) (se ekvation 2).
2
Förändringen mellan excitation och emissions amplitud (dvs. det så kallade modulations indexet eller djupet (amplitud dividerat med konstanten luminiscens del)) är också beroende av luminiscens livstid. Så, genom att ställa in en känd modulerings frekvens den speciella CMOS-bildsensorn inom kameran kan mäta luminiscens livstid i NS till μs intervall som beskrivs i detalj någon annanstans 8,29,30. En allmän vägledning om Funktionsprincipen finns (med hjälp av följande länk https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8).
I följande protokoll visar vi användningen av det nya kamerasystemet för avbildning av distributionen av O2 -koncentrationen kring rötterna till den akvatiska sötvatten växten Littorella uniflora i 2D9,31. Vi vill betona att denna metod inte på något sätt är begränsad till denna ansökan. Syre känsliga Optoder eller sensor partiklar27 i kombination med olika avbildningsmetoder har använts i medicinsk forskning32, i bioprinting33, för tryckkänslig färg34,35, eller att studera fotosyntetiska system2,36,37, bara för att nämna några andra användningsområden.
I detta protokoll är hela arbetsflödet från optode förberedelse till O2 bildanalys täckt. Genom att följa detta protokoll, kemiska bilder kan erhållas med hjälp av den nya frekvens-domänbaserade luminiscens livstid kamera. Beroende på ansökan, kan planar Optoder tillverkas i olika storlekar och skikttjockleken på sensorn skikt från robust 50-100 μm tjocka plana Optoder av flera tiondelar av kvadratcentimeter till Mikroskop täcka glider med < 1 μm tjock sensorlager6,40. Potentialen för denna metod visades med en viss applikation, men är inte bara begränsad till O2 avbildning i växtrhizospheres12,28.
Denna metod har flera fördelar jämfört med ren luminiscens intensitetsbaserade kemiska avbildningsmetoder. Luminescence livstid avbildning är inte, eller åtminstone mycket mindre, påverkas av ojämn belysning, ojämn optode tjocklek, och foto blekning25. Denna metod undviker också användning av ytterligare en referens färg som är vanlig i ratiometriska bilder17,37. I jämförelse med andra livstids baserade kamerasystem, såsom vanligt förekommande gated Time-domän kameror8,26, den nya kamerasystem och protokoll som presenteras här kan ge jämförbara resultat. I en nyligen publicerades de analytiska egenskaperna hos dessa två system jämfördes och det konstaterades att frekvens-domänbaserade luminiscens livstid kamerasystem är minst jämförbar med den avvecklade tidsdomänbaserade föregångare8.
Vi har presenterat den enklaste O2 optode som endast består av en indikator i en polymermatris. Förutom flera andra möjliga O2 indikatorer20 som kan användas tillsatser kan inkluderas, dvs spridning agenter såsom tio2 eller diamant pulver2 för att öka sensorn signalen samtidigt minska insynen i optode. Ytterligare färgämnen kan också användas för att öka signalintensiteten via energiöverföring41.
För planar optode Fabrication, rekommenderar vi att använda en lucka i kniv-beläggning enhet av 75-120 μm för att ge en slutlig sensor skikttjockleken på cirka 7,5 till 12 μm efter lösningsmedels avdunstning (ca 10% av den använda klyftan), när du använder den beskrivna sensorn cocktail komposition. Detta är en bra kompromiss mellan signalintensitet, som kan ändras genom högre färgämne lastning, eller genom att välja indikator och referens färgämnen av högre ljusstyrka, och svarstid. En ökning av skikttjockleken resulterar i en ökning av svarstiden, eftersom den tidsperiod som krävs för analyten att nå en termodynamisk jämvikt i Avkännings skiktet med omgivande Media ökar12.
Optoder, som beskrivs här, reagerar på förändringar i O2 koncentrationen inom några sekunder17 medan den fortfarande har en tillräckligt stark luminiscens signal. Ultratunna sensor beläggningar med sub-Second responstid kan realiseras med spinn-Coating6. Om stödet eller kniv beläggnings anordningen inte är väl rengjorda, kan det resultera i inhomogena sensor skikt. Också, när cocktail är inte helt homogen eller appliceras för snabbt efter spridning framför beläggnings anordningen ett sådant oönskat resultat kan observeras. Därför kan det behöva lite övning för att förbereda optimala Optoder.
Metoden kan användas för att avbilda prover som kan sättas i nära kontakt med optode, såsom vissa marina djur42, biofilmer6 och jordar31 bara för att nämna några. Vi presenterar en fristående installation med hjälp av ett mål, men kameran kan enkelt kopplas till ett mikroskop för högre upplösning kemisk avbildning43.
Fördriva tiden-domän baserat luminiscens livstid tänkbar sättet i stånd till undertryckande av bakgrunden fluorescens26, den här er en lämna ut när användande den ny frekvens-domän-baserat kamerasystem8. På grund av det kontinuerliga bild förvärvet kommer denna kamera att spela in alla bakgrundsfluorescens av provet som kan exciteras av den valda lysdioden och avger i det valda spektrala fönstret som definieras av utsläpps filtret på kamerans mål. Detta kommer att resultera i en till synes lägre livstid och följaktligen i felaktiga avläsningar. Om du arbetar med prover med en betydande inneboende fluorescens överlappar med O2 sensor excitation och emission, är det viktigt att tillämpa en extra optisk isolering ovanpå optode, genom att täcka ett ytterligare skikt som innehåller kimrök2,17. Således, endast luminiscens avges från planar optode kommer att nå kameran. För att kontrollera bakgrunden luminiscens en bild utan optode kan tas, som sedan skulle uteslutande Visa inneboende luminiscens av provet. Det är också möjligt att lägga till spridnings agenter som tio2 eller diamantpulver2,44, till sensorn cocktail, för att öka luminiscens intensiteten av indikatorn färgämne. Detta kan dock också leda till snabbare foto blekning och TiO2 är en känd foto-katalysator, som kan försämra foto stabilitet av ett färgämne41. En annan aspekt att tänka på är bakgrundsljus. Vid bild Luminescens livslängd måste bakgrundsbelysningen undvikas så effektivt som möjligt. Därför kräver denna avbildningsmetod att installationen placeras i en mörk miljö och att alla externa ljuskällor måste stängas av tillfälligt under bild anskaffningen.
Sammanfattnings, luminiscens Lifetime Imaging är en robust kemisk avbildning metod som kan anpassas till många olika tillämpningar. Detta protokoll (se avsnitt 1-5) omfattar alla väsentliga steg för att generera en O2 bild och använder den för närvarande mest flexibla frekvens-domän luminiscens Lifetime Imaging system, som kan ersätta den avvecklade gated Time-domän kamera för 2D O2 avbildning med planar optodes.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Sofie Lindegaard Jakobsen (Köpenhamns universitet) och Lars Borregaard Pedersen (Århus universitet) för teknisk assistans. Finansieringen av denna studie erhölls från en Sapere-aude Advanced Grant från den oberoende forskningsfonden Danmark (DFF-1323-00065B; MK), projektbidrag från den oberoende forskningsfonden Danmark | Naturvetenskap (DFF-8021-00308B; MK) & teknisk-och Produktionsvetenskap (DFF-8022-00301B och DFF-4184-00515B; MK), Danmarks nationella forskningsstiftelse (DNRF136) och Poul Due Jensen Foundation (KK).
Air pump with air stone and water pump | Local aquarium store | ||
Chloroform | Sigma Aldrich | 67-66-3 | |
DC4 silicone compound | Dow Corning GmbH | 2793695 | |
Gas mixer | Vögtlin Instruments GmbH | red-y compact meter GCM | This is just one possible instrument. Several companies offer gas mixing devices |
Glass plates and aquaria | Local aquarium or hardware store | ||
ImageJ Software | ImageJ | Freely available imaging software (imagej.nih.gov/ij/index.html) | |
Knife-coating device | BYK-GARDNER GMBH byk.com |
2021 | This is a four sided film applicator enabling easy variation of the film thickness. Other versions are also available. We recommend a thickness of the applied film between 75-120 µm, which yields a final sensor layer thickness of ~10% of the applied thickness before solvent evaporation. |
LED lamp, Reflector PAR38 | Megaman | MM17572 | |
LED LEDHUB | Omicon Laserage, Germany | Can be configured with a variety of LEDs. For the presented example, the green LED (528 nm) is essential | |
LOCTITE AA 3494 | Henkel AG & Co. KGaA | NA | Acrylic-based instant adhesive |
NIS Elements AR Software | Nikon Inc | Software package used for image acquisition | |
pco.flim | PCO AG, Germany | Frequency domain based luminescence lifetime camera | |
platinum(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentafluorphenyl)-porphyrin (PtTFPP) | Frontier Scientific | PtT975 | O2 indicator |
polyethylene terephthalate (PET) foil | Goodfellow | 320-992-72 | Such foils might also be found from other providers and serve as solid support |
Polystyrene (PS) | Sigma Aldrich | 9003-53-6 | Polymer matrix |
Schott RG610 filter | www.uviroptics.com | Here 52mm screw on Filters can obtained. Other sources offer square glass filters from Schott glass that can be fixed in front of the objective | |
Vinyl electrical tape | Scotch, Super 33+ | NA | |
Zeiss Makro Planar 2/100 with Hama C for Nikon adaptor | delivered with the camera | Here any other objective might also be used in combination with an adaptor if the objective does not have a C-mount |