基于频率域相机系统的氧气O2发光寿命成像

摘要

我们介绍了一种新型频域发光寿命相机在利用光学传感器薄膜进行二维 O₂ 分布成像中的应用。文中描述了该相机系统及图像分析流程，以及用于可视化水生植物根际微环境中 O₂ 分布的传感器薄膜的制备、校准和应用方法。

摘要

我们介绍一种用于二维成像溶解氧（O₂）的方法，具有高空间分辨率（< 50–100 µm）和时间分辨率（< 10 s）。该方法采用对O₂敏感的发光传感薄膜（平面光极），结合专用于频率域发光寿命成像的特殊相机系统。平面光极的制备方法是将对O₂敏感的指示染料溶解于聚合物中，再通过刮刀涂布法将混合物以特定厚度涂覆于固体载体上。溶剂蒸发后，将平面光极紧密贴合于待测样品表面——本实验以水生植物Littorella uniflora的根部为例进行演示。利用特殊相机，通过透明载体薄膜及水族箱壁的背面，对平面光极内指示染料的发光寿命随O₂浓度变化的情况进行成像。该相机通过测量调制激发信号与发射信号之间的相位角偏移，来测定发光寿命（µs）。该方法优于基于发光强度的成像技术，因为其信号不受染料浓度或激发光源强度的影响，仅依赖于发光衰减时间，而这是一个内在可参照的参数。因此，无需额外添加参考染料或其他校准手段。我们展示了该系统在植物根际宏观O₂成像中的应用，但该相机系统也可轻松与显微镜耦合使用。

引言

沉积物和土壤中溶解气体与离子的分布及动态变化为生物地球化学过程提供了关键信息，例如微生物呼吸^1,2、植物根系的径向释氧^3,4,5，以及微生物的化学微环境^6,7、植物根际^5,8,9和动物洞穴^10,11,12。在扩散受限的环境中，生物和化学活动可导致生物地球化学过程中的化学底物或产物形成显著的梯度变化。特别是氧气（O₂）的可利用性对生物地球化学过程具有重大影响，从而决定系统的生物学与生态学特征¹³。因此，在水体和陆地科学研究中，以高空间和时间分辨率分析O₂浓度至关重要。最初，人们开发了电化学和光学微传感器^14,15用于检测这一重要分析物。随后，基于平面光极的二维（2D）O₂成像技术被引入^{12,16,17,18,19}，实现了对土壤和沉积物中非均一O₂分布的可视化与定量分析。

平面O₂ 光极由一个O₂-敏感性指示染料²⁰，该物质溶解于合适的聚合物中²¹指示剂染料在特定光学波长下被激发，弛豫时以发光形式发射红移光。在 O₂，激发态的指示剂染料可将其能量转移至 O₂ 分子在碰撞时发生发光猝灭，称为基于碰撞的发光猝灭²²因此，随着O₂浓度的增加，发光强度以及发光寿命均会降低。₂ 浓度²³在理想情况下，强度和寿命的变化遵循Stern-Volmer方程（公式1），该方程使用无（I₀；τ₀）或 O 的存在（I, τ）₂ 在给定浓度下 [Q]. 斯特恩-沃尔默常数（K_sv）是衡量光学传感器对 O 的灵敏度的指标₂；K_SV 取决于温度和压力等环境变量。

(1)

通过相机系统记录平面传感器箔上发光变化，可用于可视化相应的 O₂ 分布变化。最初采用的是基于发光强度的简单 O₂ 成像方法¹⁸。然而，该方法对外部干扰极为敏感，由于照明不均、激发光源或相机的波动，以及平面光极内指示染料分布不均，会影响结果的可靠性。

通过使用平面光极进行比例成像，可在一定程度上缓解上述部分局限性^17,24，其中将对 O₂ 敏感的指示染料与一种在不同光谱范围发射信号的、对 O₂ 不敏感的参比染料共同固定在平面光极的聚合物层中。基于在两个不同光谱窗口中获取的发射图像，将对 O₂ 敏感的发射信号除以参比信号，从而生成比例图像，该图像对上述干扰因素更为不敏感^5,17。该方法需要使用第二种染料，理想情况下该染料可由同一激发光源激发，但在不同波长处发射信号（无明显光谱重叠），并位于相机的另一个光谱窗口（例如，RGB 相机的另一个颜色通道）中。

或者，O₂ 成像可基于定量测定指示剂染料的发光寿命随 O₂ 浓度变化的情况，该方法不受照明不均或指示剂浓度分布不均的影响²⁵。最早的基于发光寿命的 O₂ 成像系统采用时域测量，依赖于可门控的电荷耦合器件（CCD）相机系统²⁶，该系统使用脉冲激发光源，并在指示剂激发或发射过程中的特定时间间隔内采集发光图像^8,23,27。通过此类图像可确定发光寿命，并通过校准将其与相应的 O₂ 浓度相关联。随后，将给定样品紧贴平面光学传感器时获得的发光寿命图像转换为对应的二维 O₂ 浓度分布图像。该系统已在实验室和现场多种应用中使用^16,28，但关键的可门控 CCD 相机目前已不再商业化供应。

最近推出了一种不同的发光寿命相机系统，该系统在频域中获取图像⁸。该系统依赖于持续调制的光源进行激发，这种调制可以是正弦波或方波，而非用于时域成像的脉冲激发。这种调制会导致氧（O₂）指示染料产生调制的发光发射，其相位偏移一个角度 φ，该角度取决于指示染料的发光寿命（τ）（见公式2）。

(2)

激发光与发射光振幅之间的变化（即所谓的调制指数或调制深度，定义为振幅除以恒定的发光部分）也依赖于发光寿命。因此，通过设定已知的调制频率，相机内的专用CMOS图像传感器能够测量纳秒（ns）至微秒（µs）范围内的发光寿命，其详细原理见其他文献^8,29,30。有关其工作原理的一般性介绍，可参考以下链接：https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8。

在以下实验方案中，我们演示了如何使用新型相机系统对水生淡水植物Littorella uniflora根系周围氧气（O₂）浓度分布进行二维成像^9,31。需要强调的是，该方法绝不仅限于这一应用。氧气敏感性光学传感器或传感颗粒²⁷结合多种成像技术，已被广泛应用于医学研究³²、生物打印³³、压力敏感涂料^34,35，以及光合作用系统的研究^2,36,37等领域，以上仅列举了部分应用方向。

方案

1. 平面O₂光学传感器的制备

1. 将1.5 mg发光O₂指示染料铂(II)-5,10,15,20-四(2,3,4,5,6-五氟苯基)卟啉（PtTFPP）和100 mg聚苯乙烯（PS）溶解于1 g氯仿中，制成所谓的“传感混合液”。
   注意：该混合液可在密闭、气密的玻璃小瓶中于冰箱内避光保存数小时，以备后续使用。
2. 借助水或70%乙醇薄膜，将一张洁净无尘的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）薄膜（尺寸根据应用而定）固定在清洁的玻璃板上（图1A）。
3. 将清洁的刮刀涂布装置（120 µm）置于薄膜上，使用玻璃移液管在装置前方施加一条传感混合液（图1B），然后缓慢且均匀地推动刮刀涂布装置在PET薄膜上移动，使混合液均匀铺展。
   注意：所有材料和工具必须彻底清洁，制备过程应在无尘环境中进行，例如通风橱、超净工作台或局部抽气装置下方。为避免最终传感器薄膜出现不均匀现象，在将传感混合液涂覆到薄膜后，后续步骤应迅速完成，因为氯仿挥发极快。
4. 将制备完成的平面O₂敏感光学传感器在环境空气中干燥1小时，随后在50–60 °C的烘箱中过夜干燥，溶剂蒸发后最终膜层厚度约为12 µm。将制得的光学传感器避光保存（例如置于纸信封中），以备后续使用（图1C）。
   注意：平面O₂光学传感器可在干燥避光条件下保存数月甚至数年。实践表明，最终膜层厚度在1–20 µm范围内均可获得良好效果，兼具足够的发光信号强度和适当的响应时间。

2. 根际三明治小室

1. 清洁两块玻璃板（24.5 × 14 cm）²，厚度：4 mm）用96%乙醇处理。
2. 使用光固化丙烯酸酯类瞬干胶（参见 材料表) 用于粘合显微镜载玻片（76 × 26 mm）²，厚度：1 mm）沿第一块玻璃板的边缘（即后腔室侧）粘贴，留出一侧长边开口。根据需要使用玻璃切割刀裁剪显微镜载玻片。
   警告：切割玻璃可能产生锋利边缘，应小心操作。
   注意：载玻片在前后部分之间起到间隔作用，根据根系的厚度和植株大小，可将多层载玻片相互粘合使用。
3. 将平面光学传感器切割成所需的形状和大小，以适配粘合的显微镜载玻片之间的空间。将其放置在前侧玻璃板内侧，涂层面向上，以便在压紧时可与待测样品接触。
4. 将氧敏薄膜的一边用胶带固定在玻璃板上，在玻璃板与氧敏薄膜之间滴加几滴自来水（图2A缓慢地将箔片降至这些水滴上，使其在玻璃表面自然展平。
5. 使用柔软的纸巾小心去除平面光极与玻璃板之间滞留的气泡，避免划伤传感器涂层。将玻璃板擦干，并用胶带将光极膜的其余边缘固定在玻璃板上（图2B).
   注意：应选择一种在水下具有适当黏附性的胶带。
6. 使用0.5 mm孔径的筛子对沉积物进行筛分。将一勺湿沉积物置于第一块载玻片上图2C).
   注意：网孔尺寸不应大于间隔层厚度的一半。
7. 用一块平整的玻璃板将沉淀物均匀铺开，并调整其厚度至与显微镜载玻片间隔器相同。仔细清洁载玻片的上表面，以确保第二块玻璃板能够正确密封样品室。
8. 在显微镜载玻片表面涂抹硅脂。用一层薄水膜覆盖沉淀物，同时小心避免产生气泡。
9. 仔细清洗单个枝条 Littorella uniflora 并将其放置在沉积物上，使植物叶片从上方开口处伸出（图2D).
10. 将第二块载玻片（其上已固定有 optode）放置在沉积物上，并施加轻微压力，使 optode 与植物根系及周围沉积物紧密接触。
    注意：将玻璃板合拢时，可通过倾斜玻璃板去除沉积物中截留的气泡。
11. 使用夹子将玻璃板固定在一起（图2E）。用纸巾擦干外缘。在整个根际三明治组装过程中保持叶片湿润（例如，通过频繁添加几滴水）。
12. 使用乙烯基电工胶带收紧根际三明治装置。用油泥密封边缘，并用乙烯基电工胶带进一步封边。图2F).
    注意：如果沉积物中存在大量气泡，或间隔用显微镜载玻片与第二块玻璃板之间混入沉积物颗粒，则应重新组装装置，因为孔隙水可能泄漏（重复步骤 2.4 - 2.8）。
13. 使用不透明塑料覆盖根际三明治，但在塑料膜上留一条缝隙，使植物叶片可以伸出。在塑料膜上裁剪一个窗口，以便通过展开塑料膜在实验时打开。在适应期间使用橡皮筋将窗口封闭。图2G以保护氧电极免受光照漂白，同时孵育植物。
    注意：由于藻类生长可能会干扰 O₂ 在测量浓度时，我们建议尽量减少污染，可通过使用过滤水、预先清洗的实验设备以及在藻类形成后及时清除来实现。

3. 根际三明治培养室孵育

1. 将根际三明治培养室以略微倾斜的位置放入盛水容器（32 x 7 x 28 cm³）中，以促进根系向平面光学传感器方向生长。
2. 向容器中加水，直至完全淹没植物叶片。
3. 使用定时控制的光源，建立14小时光照、10小时黑暗的光周期，使植物适应环境。在容器中放置气石或水泵，以确保水体充分通气和混合（图2H）。

4. 成像

1. 成像设置
   1. 移除根际三明治室中平面光极上的塑料薄膜。将该室带有光极的玻璃壁垂直紧贴水族箱壁放置，并使用垫片将根际三明治室压紧在水族箱壁上。
      注意：水族箱壁与根际三明治室壁的总厚度不宜过厚，但为减少散射光引起的空间串扰，建议用于发光成像的水族箱玻璃壁厚度应>1 cm。为最小化材料界面处的光散射（否则也会导致图像模糊），必须对两个玻璃壁使用相同材料（即相同的折射率）¹²。
   2. 将配备物镜的基于频域的荧光寿命相机（参见材料表）放置在水族箱前方，对准目标区域（与平面光极直接接触的水生植物Littorella uniflora的根部）（图3）。
      注意：可将相机置于实验台架上，以便于调节高度。应标记台架位置并保持固定。此外，可用胶带将相机固定在台架上，以避免实验过程中相机意外移动。
   3. 在相机物镜上旋入适用于成像PtTFPP指示染料的合适发射滤光片（参见材料表），以消除激发光源的干扰。
      注意：螺纹滤光片最为理想，但也可使用方形滤光片，配合合适的适配器或小心地用胶带固定在物镜上。
   4. 将LED激发光源（参见材料表）连接至相机的调制和暗门输出端。
      注意：前者提供光源的调制信号，后者在图像传感器读取图像期间关闭光源。将LED激发光源和相机连接至计算机。在图像读取期间，应通过完全遮蔽房间光线或将致密黑色布料覆盖整个装置来最小化背景光。若采用后者，需确保充分通风，以防相机过热。
   5. 将导光管固定在LED激发光源中，并调整其位置，使目标区域的平面光极薄膜得到均匀照明。
      注意：所用LED激发光源可切换三种不同LED（460 nm、528 nm、625 nm），其强度可通过控制软件调节。
2. 设置与相机操作
   注意：在所述实验中，我们使用了基于频域的寿命相机，并结合商业软件包中的专用寿命成像模块（参见材料表）。
   1. 在使用前，在所选软件中选择相机。
      注意：需按照制造商指南在成像前安装软件和相机驱动程序。
   2. 打开LED控制软件（同样需在实验开始前安装），取消待机状态以选择合适的LED（此处为528 nm），并根据需要设置LED强度（此处设为30%）。确保LED由外部TTL触发，方法是勾选LED的analog和sync选项。
      注意：LED强度需单独调节，过高的光强可能导致指示剂或参比染料加速光漂白。
   3. 手动对相机进行对焦，并调节物镜光圈（本研究中使用f = 2.8）。
      注意：必须将相机对焦于平面光极而非水族箱玻璃上；可通过拍摄带有标尺的图像并聚焦于标尺在光极上的投影阴影（而非标尺本身）来确保这一点。
   4. 在软件的相机控制面板中设置以下参数：内部调制源；输出波形为正弦波；附加相位采样（是）；8个相位采样点，相位顺序相反，Tap A + B读出；调制频率5 kHz。
      注意：这些参数影响图像质量，可根据需要调整。相机制造商提供了关于各参数的指导说明（每当软件更新时，制造商都会发布新的指南和更新）。
   5. 在实验前拍摄参考图像。
      注意：可通过成像校准标准品（具有已知寿命（ns或µs）的发光染料）或利用LED的反射光来完成。后者需从物镜上移除发射长通滤光片，并将已知寿命设为1 ns。
   6. 在专用成像软件的校准部分调节曝光时间，使ROI统计读数（该面板底部）在归一化发光强度图像中的数值处于0.68–0.72范围内。
      注意：此时需在软件中输入参考寿命（例如1 ns）。
   7. 点击采集参考以开始参考测量序列的采集。
      注意：完成后，参考数据将被存储，随后可在样品上进行单次或时间序列测量。
3. O₂光极的校准
   1. 将一块平面O₂敏感光极置于（小型）玻璃水族箱中。如前所述（见第2.3节），将平面光极固定在校准室的玻璃壁上。将校准水族箱置于相机前方。确保LED照明均匀，且光极充满整个视场。
      注意：该平面光极应与实际实验中所用光极来自同一片薄膜，或使用相同的传感器混合液制成。
   2. 用与实验中相同的液体介质填充水族箱。
      注意：校准与实验使用不同介质可能影响测量结果（例如改变传感器响应和/或O₂溶解度）。因此，校准应在与实际实验相同的介质和温度下进行。温度波动会影响发光信号，应尽量避免。若无法保持温度稳定，则需在不同（相关）温度下对O₂敏感光极进行多点校准，并对数值进行后续重新计算以实现温度补偿。
   3. 使用气体混合装置，向水中通入已知O₂浓度的空气/N₂混合气体，以调节校准水族箱中的O₂浓度。通过足够长时间的曝气（取决于流速和水族箱尺寸），确保水体与所用混合气体充分平衡。
      注意：建议使用带有温度补偿功能的外部校准O₂传感器（例如光纤或电化学O₂传感器）监测校准水族箱中的O₂水平。
   4. 在校准室中不同O₂浓度条件下拍摄一系列图像。
      注意：为获得良好的校准曲线拟合，至少应测量五个不同的O₂浓度。必须在0 hPa（缺氧条件）下测量，其余浓度值应分布于特定指示染料的动态范围内。本实验中使用固定在聚苯乙烯基质中的PtTFPP作为O₂敏感指示染料。图像采集点为0、48、102、156和207 hPa；207 hPa对应给定盐度和压力下的100%空气饱和度。
4. 样品成像
   1. 将样品置于相机前方，并确保照明均匀。
   2. 在采集植物荧光寿命图像前，关闭照射植物的光源（及其他所有光源）。根据强度图像调整采集时间，确保信号在寿命测定中既不过饱和也不过弱，以获得良好的信噪比（S/N）。
   3. 使植物暴露于不同的光照条件（如光照/黑暗），并采集一组图像。
   4. 打开室内灯光以获取结构图像。
      注意：当背景光开启时，相机无法测量出真实的寿命图像。但此时强度图像可显示通过半透明光极所见的整个视场。
   5. 在视场中放置标尺或其他参照物拍摄图像，以便后续对采集的图像进行比例标定。

5. 数据分析

1. 使用相机制造商提供的宏，直接从专用成像软件中导出相位寿命和强度图像。
2. 使用一款可免费获取的图像分析软件进行进一步的图像分析（参见材料表）。
3. 在图像分析软件中打开校准用的相位寿命图像，并利用测量功能确定整幅图像的平均值。将测得的寿命值对已知的O₂浓度作图，以确定校准函数（图4A）。
4. 根据所有数据计算τ₀/τ（其中τ₀为无O₂条件下测得的相位寿命），并将这些值对已知的O₂浓度作图（图4B）。
5. 利用动态碰撞猝灭的简化双位点模型（方程3）^38,39，从校准曲线中确定参数K_sv和f，其中[Q]为O₂浓度。在数据分析软件中定义拟合函数，由软件自动计算出K_sv和f。

(3)

6. 在图像分析软件中打开获取的样品图像，利用已确定的参数 K_sv, f 和 τ₀，将成像的寿命数据转换为 O₂ 浓度。
   注意：作为替代方法，也可直接使用获取的校准相位寿命值（图 4A）。此时，使用曲线拟合功能进行指数拟合以完成校准。
7. 在图像分析软件中打开带有标尺的图像，使用测量工具测量已知距离，并在 设置标尺 中将该测量值设为全局标尺。

结果

作为新型成像系统的应用示例，我们展示了复杂生物样品（即水生植物Littorella uniflora的根际）的二维O₂成像。

首先，该方法描述了平面传感器膜（即所谓的平面光极）的制备过程。如图1所示，这种光极由涂覆在透明支撑材料上的聚合物基质中的光学指示剂薄层构成。通过遵循所述方案，可获得厚度均匀的均质传感膜，其厚度由刮刀涂布装置的间隙决定。如果制得的光极出现传感材料分布不均（例如涂层存在孔洞、条纹或染料聚集体，可通过肉眼或在紫外灯辅助下观察判断），则需要重复该方案，并使用丙酮彻底清洗所有材料。

平面光极制备完成后，可将样品与平面光极的传感层紧密接触。如图所示，平面光极已集成于根际三明治培养室（rhizo-sandwich chamber）中，使植物根系及其周围沉积物基质能够与平面光极紧密贴合（图2）。若制备得当，该根际三明治培养室应可轻松地在两个水族箱之间转移（一个用于孵育，另一个用于测量）。若构建不当，则可能导致培养室结构不稳定、沉积物脱落或产生气泡。因此，建议在组装完成后立即对根际三明治培养室进行目视检查。

本方案利用基于频率域的荧光寿命成像相机，实现对与平面光学传感器接触的样品进行基于频率域的荧光寿命成像。有关该相机系统的更多细节，例如图像采集模式和科学级互补金属氧化物半导体（SCMOS）相机特性，已在近期的出版物中详述^8,29。

该装置本身相当简单，仅包括一个控制光源（本例中为LED激发光源）的相机以及带有传感器的样品（图3）。确保所有部件正确连接，并使样品被均匀照射。在进行测量时需避免背景光干扰。

在对样品成像之前，需要对光学传感器进行校准。如图4A所示，测得的荧光寿命随着O₂浓度的增加而呈准指数衰减。该关系也可用简化的双位点模型描述（图4B和公式3）。在给定示例中，后续用于计算O₂浓度的参数如下：τ₀ = 56.26 µs，K_sv = 0.032 hPa^-1，f = 0.86。

进行校准也是检验系统是否正常工作的理想方法。如果所有组件均按照本文所述（或制造商指南中规定）的方式安装，所测得的寿命应表现出与图4中相同的O₂依赖性。此外，对于相同的O₂传感材料组合（聚合物和染料），测得的τ₀应处于与本文测量结果相近的范围内（±几微秒），主要受实验温度影响。若无法获得相似的校准曲线，请确认是否正确执行了所有步骤。有时传感器可能被错误地固定，导致敏感面朝向玻璃壁而非样品，或者所获取的图像曝光过度或不足。

利用校准参数，可通过成像氧探针的发光寿命（τ）来确定 O₂ 浓度。如图5A,B 所示，在黑暗条件下以及在 500 µmol 光子 m^-2 s^-1 光照 12 小时后，对Littorella uniflora 根际区域的 O₂ 浓度分布进行了成像。由于植物的光合作用活性，光照后根际区域的 O₂ 浓度升高。除了寿命成像外，还可以在外部光照下获取“结构”图像，同时保持成像几何结构不变。通过这种方式，O₂ 图像可与结构图像（图5C）、横截面或感兴趣区域实现精确对应。例如，分别从黑暗和光照条件下获取的图像中提取了单根周围 O₂ 浓度的分布剖面（图5D）。

图1：平面O₂光学传感器的制备。（A）将PET薄膜固定在玻璃板上，并将刮刀涂覆装置置于薄膜上。（B）将配制好的传感器混合液作为一条细线涂布在刮刀涂覆装置前方的PET薄膜上。（C）将刮刀涂覆装置向下移动，使传感器混合液在PET薄膜上铺展成一层薄膜，溶剂蒸发后即得到可直接使用的平面光学传感器。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：集成平面 O₂ 光学传感器的根际三明治培养装置组装示意图。 （A）利用水膜将光学传感器固定在其中一块玻璃板上。（B）使用电工胶带将光学传感器粘附固定在玻璃板上。（C）在另一块带有间隔物（即显微镜载玻片）的玻璃板中填充沉积物。（D）将植物根系放置于均匀铺展的沉积物表面。（E）合上根际三明治培养装置，并用夹具临时固定。（F）完全闭合并组装好的根际三明治培养装置。（G）为防止培养光源照射损坏光学传感器并抑制藻类生长，将塑料遮光罩覆盖在组装好的根际三明治培养装置外部。（H）将根际三明治培养装置置于水族箱中进行培养。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：成像装置，包含基于频域的荧光寿命相机，物镜通过透明水族箱及根际夹心室壁从背面聚焦于带有传感器膜的样品上。 LED激发光源的导光管已定位，以实现对样品的均匀照明。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：平面 O₂ 光学传感器的校准曲线。（A）在充满水的校准室中，于不同 O₂ 浓度下测得的磷光寿命值。（B）利用简化的双位点模型拟合校准数据得到的 Stern-Volmer 图（动态碰撞猝灭，公式 3）。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：水生植物 Littorella uniflora 根际中 O₂ 分布的寿命成像。（A）植物在约 500 µmol photons m^-2 s^-1 光照条件下培养 12 小时后的 O₂ 分布。（B）植物在黑暗中放置 1 小时后的 O₂ 分布。（C）通过平面光学传感器观察到的植物根部结构图像。（D）横截面 O₂ 浓度剖面（位置由 A 和 B 图中的黄线指示），光照 12 小时（红色）和黑暗 1 小时（黑色）后的结果。经许可改编自（Koren, K., Moßhammer, M., Scholz, V. V., Borisov, S.M., Holst, G., Kühl, M. Luminescence Lifetime Imaging of Chemical Sensors - A Comparison between Time-Domain and Frequency-Domain Based Camera Systems. Analytical Chemistry. 91 (5), 3233-3238, doi: 10.1021/acs.analchem.8b05869 (2019)）。版权所有 (2019) 美国化学学会。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本方案涵盖了从光学传感器制备到 O₂ 图像分析的完整工作流程。按照本方案操作，可利用基于频域的荧光寿命成像相机获取化学图像。根据具体应用需求，平面光学传感器可制备成不同尺寸，其传感层厚度范围广泛，既可制备成面积达数十分之一平方厘米、坚固耐用的 50–100 µm 厚平面传感器，也可制备成传感层厚度 <1 µm 的显微镜盖玻片^6,40。该方法的潜力已在特定应用中得到验证，但其应用不仅限于植物根际的 O₂ 成像^12,28。

与基于纯发光强度的化学成像方法相比，该方法具有多项优势。发光寿命成像不受或至少极少受到照明不均、传感膜厚度不均以及光漂白的影响²⁵。此外，该方法避免了在比率成像中通常需要使用额外参比染料的问题^17,37。与其他基于寿命的相机系统（如常用的门控时间域相机^8,26）相比，本文所介绍的新型相机系统及实验方案能够提供可比的结果。在最近的一项研究中，两种系统的分析特性被进行了比较，结果表明，基于频域的发光寿命相机系统至少可与已停产的时间域前代系统相媲美⁸。

我们已展示了最简单的O₂光学子传感器，其仅由一种指示剂嵌入聚合物基质中构成。除了其他多种可能的O₂指示剂²⁰外，还可加入添加剂，例如散射剂如TiO₂或金刚石粉末²，以增强传感器信号，但会降低光学子传感器的透明度。此外，也可使用其他染料，通过能量转移来增强信号强度⁴¹。

在平面光极的制备过程中，当使用文中所述的传感器混合溶液配方时，建议刀涂设备的间隙设置为75–120 µm，以便在溶剂蒸发后（约为所用间隙的10%）获得约7.5至12 µm的最终传感层厚度。这一厚度在信号强度（可通过提高染料负载量或选择更亮的指示剂和参比染料来调节）与响应时间之间达到了良好平衡。传感层厚度的增加会导致响应时间延长，因为分析物在传感层与周围介质之间达到热力学平衡所需的时间随之增加¹²。

如文中所述，光学传感器（optodes）对氧气（O₂）浓度变化的响应时间在数秒内¹⁷，同时仍能保持足够强的发光信号。通过旋涂法可制备响应时间小于一秒的超薄传感涂层⁶。如果基底或刮刀涂覆装置未彻底清洁，可能导致传感器涂层不均匀。此外，若传感混合液未充分均质，或在涂覆装置前方铺展后过快进行涂覆操作，也可能出现此类不良结果。因此，制备理想的光学传感器可能需要一定经验与练习。

该方法可用于成像能够与传感膜紧密接触的样品，例如某些海洋动物⁴²、生物膜⁶和土壤³¹等。本文展示了一种使用物镜的独立装置，但该相机也可轻松与显微镜耦合，以实现更高分辨率的化学成像⁴³。

尽管基于时域的发光寿命成像能够抑制背景荧光²⁶，但在使用新型基于频域的相机系统时，这一问题仍然存在⁸。由于该相机持续进行图像采集，它会记录样品中任何可被所选LED激发、并在相机物镜上的发射滤光片所定义的光谱窗口内发射的背景荧光。这将导致测得的寿命值偏低，从而产生错误读数。如果所处理的样品具有显著的内源性荧光，且该荧光与O₂传感器的激发和发射波段重叠，则必须在光学传感器表面额外施加光学隔离层，即涂覆一层含炭黑的材料^2,17，以确保只有来自平面光学传感器的发光信号能够到达相机。为检测是否存在背景发光，可采集一张不包含光学传感器的图像，该图像将仅显示样品自身的内源性发光。此外，也可在传感器混合液中添加散射剂（如TiO₂或金刚石粉末）^2,44，以增强指示染料的发光强度。然而，这种方法也可能导致染料更快发生光漂白，且TiO₂是一种已知的光催化剂，可能损害染料的光稳定性⁴¹。另一个需要考虑的因素是环境光干扰。在进行发光寿命成像时，应尽可能避免环境光的影响。因此，该成像方法要求将实验装置置于黑暗环境中，并在图像采集期间临时关闭所有外部光源。

总之，发光寿命成像是一种可靠的化学成像方法，可适用于多种不同应用。本实验方案（见第1至第5节）涵盖了生成 O₂ 图像所需的全部关键步骤，并采用了目前最灵活的频域发光寿命成像系统，可替代已停产的门控时域相机，用于基于平面光学传感器的二维 O₂ 成像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带气石和水泵的空气泵	当地水族用品商店
氯仿	Sigma Aldrich	67-66-3
DC4 硅胶化合物	Dow Corning GmbH	2793695
气体混合器	Vögtlin Instruments GmbH	red-y compact meter GCM	这只是其中一种可能的仪器。多家公司提供气体混合装置
玻璃板和水族箱	当地水族或五金商店
ImageJ 软件	ImageJ		免费提供的图像处理软件（imagej.nih.gov/ij/index.html）
刮涂设备	BYK-GARDNER GMBH byk.com	2021	这是一种四边可调的涂膜器，便于轻松调节薄膜厚度。其他型号也可使用。我们建议涂布薄膜的厚度在 75–120 µm 之间，溶剂蒸发前所得薄膜厚度约为最终传感器层厚度的 ~10%。
LED 灯，反射器 PAR38	Megaman	MM17572
LED LEDHUB	Omicon Laserage, Germany		可配置多种 LED。在本示例中，绿色 LED（528 nm）至关重要
LOCTITE AA 3494	Henkel AG & Co. KGaA	NA	丙烯酸基瞬干胶
NIS Elements AR 软件	Nikon Inc		用于图像采集的软件包
pco.flim	PCO AG, Germany		基于频率域的发光寿命成像相机
铂(II)-5,10,15,20-四(2,3,4,5,6-五氟苯基)卟啉（PtTFPP）	Frontier Scientific	PtT975	O2 指示剂
聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）薄膜	Goodfellow	320-992-72	此类薄膜也可从其他供应商处获得，用作固体支撑材料
聚苯乙烯（PS）	Sigma Aldrich	9003-53-6	聚合物基质
Schott RG610 滤光片	www.uviroptics.com		此处可获取 52 mm 螺纹安装滤光片。其他来源提供 Schott 玻璃制成的方形玻璃滤光片，可安装在物镜前方
乙烯基电工胶带	Scotch, Super 33+	NA
Zeiss Makro Planar 2/100 配 Hama C 转 Nikon 接环	随相机提供		若物镜无 C 接口，也可使用其他物镜配合转接环