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基于频率域相机系统的氧气O2发光寿命成像

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DOI：

10.3791/60191

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2019年12月16日

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1Marine Biological Section, Department of Biology, University of Copenhagen, 2Center for Electromicrobiology, Aarhus University, 3PCO AG, 4Climate Change Cluster, University of Technology Sydney, 5Aarhus University Centre for Water Technology, Section for Microbiology, Department of Bioscience, Aarhus University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们介绍了一种新型频域发光寿命相机在利用光学传感器薄膜进行二维 O2 分布成像中的应用。文中描述了该相机系统及图像分析流程，以及用于可视化水生植物根际微环境中 O2 分布的传感器薄膜的制备、校准和应用方法。

摘要

我们介绍一种用于二维成像溶解氧（O2）的方法，具有高空间分辨率（< 50–100 µm）和时间分辨率（< 10 s）。该方法采用对O2敏感的发光传感薄膜（平面光极），结合专用于频率域发光寿命成像的特殊相机系统。平面光极的制备方法是将对O2敏感的指示染料溶解于聚合物中，再通过刮刀涂布法将混合物以特定厚度涂覆于固体载体上。溶剂蒸发后，将平面光极紧密贴合于待测样品表面——本实验以水生植物Littorella uniflora的根部为例进行演示。利用特殊相机，通过透明载体薄膜及水族箱壁的背面，对平面光极内指示染料的发光寿命随O2浓度变化的情况进行成像。该相机通过测量调制激发信号与发射信号之间的相位角偏移，来测定发光寿命（µs）。该方法优于基于发光强度的成像技术，因为其信号不受染料浓度或激发光源强度的影响，仅依赖于发光衰减时间，而这是一个内在可参照的参数。因此，无需额外添加参考染料或其他校准手段。我们展示了该系统在植物根际宏观O2成像中的应用，但该相机系统也可轻松与显微镜耦合使用。

引言

沉积物和土壤中溶解气体与离子的分布及动态变化为生物地球化学过程提供了关键信息，例如微生物呼吸1,2、植物根系的径向释氧3,4,5，以及微生物的化学微环境6,7、植物根际5,8,9和动物洞穴10,11,12。在这些扩散受限的环境中，生物和化学活动可导致生物地球化学过程中的化学底物或产物形成显著的浓度梯度。特别是氧气（O2）的可利用性对生物地球化学过程具有重大影响，从而深刻影响系统的生物学与生态学特征13。因此，在水体和陆地科学中，以高空间和时间分辨率分析O2浓度至关重要。最初，人们开发了电化学和光学微传感器14,15用于检测这一重要分析物。随后，基于平面光极的二维（2D）O2成像技术被引入12,16,17,18,19，实现了对土壤和沉积物中非均一O2分布的可视化与定量分析。

平面O2 optodes 由一个 O2-敏感性指示染料20，该物质溶解于合适的聚合物中21指示染料在特定光学波长激发下，经弛豫后以发光形式发射红移光。在 O2，激发态的指示剂染料可将其能量转移至 O2 分子在碰撞时发生发光猝灭，称为基于碰撞的发光猝灭22因此，随着O₂浓度的增加，发光强度以及发光寿命均会降低2 浓度23在理想情况下，强度和寿命的变化遵循Stern-Volmer方程（公式1），该方程使用无（I₀）和有（I）0; τ0）或存在（I， τO的)2 在给定浓度下[Q]. 斯特恩-沃尔默常数（Ksv）是衡量光学传感器对 O 的灵敏度的指标2；KSV 取决于温度和压力等环境变量。

(1) figure-introduction-1

利用相机系统记录平面传感器箔上发光强度的变化，可用于可视化相应的 O₂ 分布变化2 分布。最初，基于简单发光强度的O2 成像被用于18然而，该方法对各种外部干扰极为敏感，由于平面光极内指示染料分布不均、激发光源或相机的波动以及照明不均等因素，会降低结果的可靠性。

使用平面光极进行比率成像可在一定程度上缓解这些局限性17,24，其中 O2-敏感指示染料与一种在不同于O₂的光谱范围内发射的非敏感参比染料共同固定在平面光极的聚合物层中2-指示剂。根据在两个光谱窗口中获取的发射图像，O2-敏感发射信号除以参考信号，生成比率图像，该图像对上述干扰因素的敏感性较低5,17该方法需要使用第二种染料，理想情况下该染料可由同一激发光源激发，但在相机的另一光谱窗口（例如，RGB相机的另一颜色通道）中于不同波长处发射荧光（无显著光谱重叠）。

或者，O2 成像可基于定量测定指示剂染料的发光寿命随 O2 浓度变化的情况，该方法不受照明不均或指示剂浓度分布不均的影响25。最早的基于发光寿命的 O2 成像系统采用时域测量方法，使用可门控的电荷耦合器件（CCD）相机系统26，通过脉冲激发光源，并在指示剂激发或发射过程中的特定时间间隔内采集发光图像8,23,27。通过此类图像可确定发光寿命，并通过校准将其与相应的 O2 浓度相关联。随后，将给定样品紧贴平面光学传感器时获得的发光寿命图像转换为对应的二维 O2 浓度分布图像。该系统已在实验室和原位多种应用中使用16,28，但关键的可门控 CCD 相机目前已不再商业化供应。

最近，一种不同的发光寿命成像相机系统被推出，该系统可在频域中采集图像8该系统依赖于连续调制的光源进行激发，可采用正弦波或方波，而非用于时域成像的时间分辨脉冲激发。这种调制会导致氧敏感探针的发光发射信号随之调制2 指示染料，其相位发生角度偏移， φ，这取决于指示剂染料的发光寿命（τ）（见公式2）。

(2) figure-introduction-2

激发光与发射光振幅之间的变化（即所谓的调制指数或调制深度，定义为振幅除以恒定的发光部分）也依赖于发光寿命。因此，通过设定已知的调制频率，相机内的专用CMOS图像传感器能够测量纳秒（ns）至 µs 范围，具体描述见其他文献 8,29,30操作原理的通用指南可通过以下链接获取 https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8).

在以下实验方案中，我们演示了如何使用新型相机系统对水生淡水植物Littorella uniflora根系周围氧气（O2）浓度分布进行二维成像9,31。需要强调的是，该方法绝不仅限于这一应用。氧敏感光学传感器或传感颗粒27结合多种成像技术，已被广泛应用于医学研究32、生物打印33、压力敏感涂料34,35，以及光合作用系统的研究2,36,37等领域，以上仅列举了部分应用方向。

方案

1. 平面O2光学传感器的制备

  1. 将1.5 mg发光O2指示染料铂(II)-5,10,15,20-四(2,3,4,5,6-五氟苯基)卟啉（PtTFPP）和100 mg聚苯乙烯（PS）溶解于1 g氯仿中，制得所谓的“传感混合液”。
    注意：该混合液可在密闭、气密的玻璃小瓶中于冰箱内避光保存数小时，以备后续使用。
  2. 借助水或70%乙醇薄膜，将一张洁净无尘的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）薄膜（尺寸根据应用而定）固定在清洁的玻璃板上（图1A）。
  3. 将清洁的刮刀涂布装置（120 µm）置于薄膜上，使用玻璃移液管在装置前方滴加一条传感混合液（图1B），然后缓慢且均匀地推动刮刀涂布装置在PET薄膜上移动，使混合液均匀铺展。
    注意：所有材料和工具必须彻底清洁，制备过程应在无尘环境中进行，例如通风橱、超净工作台或局部抽气装置下方。为避免最终传感器薄膜出现不均匀现象，在将传感混合液涂布至薄膜后，应迅速完成后续操作，因为氯仿挥发迅速。
  4. 将制备完成的平面O2敏感光学传感器在环境空气中干燥1小时，随后在50–60 °C的烘箱中过夜干燥，溶剂挥发后最终膜层厚度约为12 µm。将制得的光学传感器避光保存（例如置于纸信封中），以备后续使用（图1C）。
    注意：平面O2光学传感器可在干燥避光条件下保存数月甚至数年。实践表明，最终膜层厚度在1–20 µm范围内均可获得良好效果，兼具足够的发光信号强度和适当的响应时间。

2. 根际三明治培养室

  1. 清洁两块玻璃板（24.5 × 14 cm）2，厚度：4 mm）用96%乙醇处理。
  2. 使用光固化丙烯酸酯类瞬干胶（参见 材料表) 用于粘合显微镜载玻片（76 × 26 mm）2，厚度：1 mm）沿第一块玻璃板的边缘（即后腔室侧）粘贴，留出一侧长边开口。根据需要使用玻璃切割刀裁剪显微镜载玻片。
    警告：切割玻璃可能产生锋利边缘，应小心操作。
    注意：载玻片在前后部分之间起到间隔作用，根据根系厚度和植株大小，可将多层载玻片相互粘合使用。
  3. 将平面光学传感器切割成所需的形状和大小，以适配粘合的显微镜载玻片之间的空间。将其放置在前侧玻璃板内侧，涂层面向上，以便在压紧时能与待测样品接触。
  4. 将氧敏薄膜的一边用胶带固定在玻璃板上，在玻璃板与氧敏薄膜之间滴加几滴自来水（图2A。缓慢将箔片降至这些水滴上，使其在玻璃表面自然展平。
  5. 使用柔软的纸巾小心去除平面光极与玻璃板之间滞留的气泡，避免划伤传感器涂层。将玻璃板擦干，并用胶带将光极膜的其余边缘固定在玻璃板上（图2B).
    注意：应选择一种在水下具有合适黏附性的胶带。
  6. 使用0.5 mm孔径的筛子过滤沉积物。取一勺湿沉积物置于第一块玻璃板上图2C).
    注意：网孔尺寸不应大于间隔层厚度的一半。
  7. 将沉淀物均匀铺开，并使用平板玻璃调节至与显微镜载玻片垫片相同的厚度。仔细清洁载玻片的上表面，以确保第二块玻璃片能够正确密封反应室。
  8. 在显微镜载玻片表面涂抹硅脂。用一层薄水膜覆盖沉淀物，同时小心避免产生气泡。
  9. 仔细清洗单根茎尖 Littorella uniflora 并将其置于沉积物上，使植物叶片从上方开口处伸出（图2D).
  10. 将第二块载玻片（其上附有光纤传感器）放置在沉积物上，并施加轻微压力，使光纤传感器与植物根系及周围沉积物紧密接触。
    注意：将玻璃板合拢时，可通过倾斜玻璃板去除沉积物中截留的气泡。
  11. 使用夹子将玻璃板固定在一起（图2E）。用纸巾擦干外缘。在整个根际三明治组装过程中保持叶片湿润（例如，通过频繁添加几滴水）。
  12. 使用乙烯基电工胶带固定根际三明治装置，用油泥密封边缘，并再用乙烯基电工胶带进一步封边。图2F).
    注意：如果沉积物中存在大量气泡，或间隔用显微镜载玻片与第二块玻璃板之间有沉积物颗粒，应重新组装装置，因为孔隙水可能泄漏（重复步骤 2.4 - 2.8）。
  13. 使用不透明塑料覆盖根际三明治，但在塑料膜上留一条缝隙，使植物叶片可以伸出。在塑料膜上剪一个窗口，以便通过打开窗口进行实验操作。在适应期间使用橡皮筋将窗口封闭。图2G以保护氧电极免受光漂白，同时孵育植物。
    注意：由于藻类生长可能会干扰 O2 在测量浓度时，我们建议尽量减少污染，可通过使用过滤水、预先清洗的实验设备以及在藻类形成后及时清除来实现。

3. 根际三明治培养室孵育

  1. 将根际三明治培养室以略微倾斜的位置放入盛水容器（32 x 7 x 28 cm3）中，以促进根系向平面光极方向生长。
  2. 向容器中加入足量水，使植物叶片完全浸没。
  3. 使用定时控制的光源，建立14小时光照、10小时黑暗的光周期，使植物适应环境。在容器中放置气石或水泵，以确保水体充分通气和混合（图 2H）。

4. 成像

  1. 成像装置设置
    1. 移除根际三明治培养室中平面光学传感器上的塑料保护膜。将培养室带有光学传感器的玻璃壁垂直紧贴水族箱壁放置。使用垫片将根际三明治培养室压紧固定在水族箱壁上。
      注意：水族箱壁与根际三明治培养室壁的总厚度不应过厚，但用于生物发光成像的水族箱壁玻璃厚度建议采用 > 1 厘米，以通过增强散射光的衰减来减少空间串扰。必须对两侧玻璃壁使用相同材料（相同的折射率），以尽量减少材料界面处的光散射；否则会导致图像模糊12.
    2. 将配备物镜的基于频域的发光寿命相机放置好（参见 材料表）置于水族箱前方，以及感兴趣区域（水生植物的根部） Littorella uniflora，与平面光极直接接触的）（图3).
      注意：可将相机置于实验架上，以便于调节相机高度。实验架的位置应做好标记并保持固定。此外，可使用胶带将相机固定在实验架上，以避免实验过程中相机发生意外移动。
    3. 为成像PtTFPP指示染料，安装合适的发射滤光片（参见 材料表) 安装在相机物镜上，以消除激发光源的干扰。
      注意：螺纹旋入式滤光片为理想选择，但也可使用方形滤光片，需配合合适的转接环，或小心地用胶带将其固定在物镜上。
    4. 连接LED激发光源（参见 材料表) 连接到相机的调制和暗门输出。
      注意：前者为光源提供调制信号，后者在图像传感器进行图像读出期间关闭光源。将LED激发光源和相机连接至计算机。在图像读出过程中，应尽量减少背景光，可通过将整个房间变暗，或用厚实的黑色布料覆盖整个装置来实现。后一种情况下，必须确保充分通风，以避免相机过热。
    5. 将光导管固定在LED激发光源上，并调整位置，使其均匀照射覆盖目标区域的平面光极膜。
      注意：所使用的LED激发光源可在3种不同的LED（460 nm、528 nm、625 nm）之间切换，其强度可通过控制软件进行调节。
  2. 设置与相机操作
    注意：在所述实验中，我们使用了一台基于频域的荧光寿命成像相机，并结合商业软件包中的专用寿命成像模块（参见 材料表).
    1. 在使用前，于所选软件中选择相机。
      注意：应根据制造商的指南，在成像前安装软件和相机驱动程序。
    2. 打开LED控制软件（该软件已在实验开始前安装），取消待机状态以选择合适的LED（此处为528 nm）。根据需要设置LED强度（此处设为30%）。确保LED由外部TTL信号触发，可通过勾选相应选项完成设置 模拟 和 同步 用于LED。
      注意：需要单独调整LED强度，因为过高的激光功率可能导致指示剂或参比染料加速光漂白。
    3. 手动调节物镜的焦距和光圈（本研究中使用 f = 2.8）。
      注意：应将相机对焦在平面光极上，而不是水族箱的玻璃上；可通过拍摄带有标尺（用于比例参照）的图像来确保正确对焦，此时应对焦于标尺在光极表面的投影阴影，而非标尺本身。
    4. 在软件的相机控制面板中设置以下参数：内部调制源；输出波形为正弦波；启用额外相位采样（是）；8 个相位采样点，相位顺序相反，Tap A + B 读出；调制频率为 5 kHz。
      注意：这些参数会影响图像质量，可根据需要进行调整。相机制造商提供了有关各个参数的指导说明（当软件更新时，相机会制造商将发布相应的指南和更新）。
    5. 实验前拍摄参考图像。
      注意：可通过成像校准标准品（具有已知寿命（纳秒或 µs），或利用LED的反射光。在后一种情况下，需从物镜处移除发射长通滤光片，并将已知寿命设置为1 ns。
    6. 在专用成像软件的校准部分调整曝光时间，直至 ROI 统计分析 归一化发光强度图像的读数（位于该图底部）范围为 0.68 - 0.72。
      注意：现在需将参考寿命（例如，1 ns）作为输入提供给软件。
    7. 按压 捕获参考 开始采集参考测量序列。
      注意：完成校准后，参考数据将被保存，随后可对样品进行单次测量或时间序列测量。
  3. O的校准2 光极
    1. 放置一块平面O2-敏感性光极置于（小型）玻璃水族箱中。按照前述方法（见第2.3节）将平面光极固定在校准室的玻璃壁上。将校准水族箱放置在相机前方，确保LED光源照明均匀，并使光极充满整个视野。
      注意：平面光极应与实际实验中使用的箔片来自同一片箔材，或使用与该箔片相同的传感器混合液制成。
    2. 用与实验中相同的液体培养基注满水族箱。
      注意：校准和实验使用不同的培养基可能影响测量结果（例如，通过改变传感器响应和/或O2 溶解度）。因此，校准应在与实际实验相同的介质和温度条件下进行。温度波动会影响发光信号，应尽量避免。然而，如果温度无法保持稳定，则需要通过在不同温度下对O₂进行校准来实现温度补偿。2-在不同（相关）温度下对敏感性光极（多点）进行校准，并对数值进行后续重新计算。
    3. 调节 O2 通过向校准水族箱中通入空气/N₂混合气体以调节浓度2 已知 O 的气体混合物2 浓度，使用气体混合装置。通过充分曝气（时间取决于流速和水族箱大小），确保水体与所用气体混合物充分平衡。
      注意：我们建议监测 O2 校准水族箱中的外部校准 O 水平2 带有温度补偿的传感器（例如，使用光纤或电化学 O2 传感器
    4. 在不同 O 下拍摄一系列图像2 校准室中的浓度。
      注意：至少需要五种不同的 O2 应测量相应浓度，以便对获得的校准数据进行适当的曲线拟合。必须在 0 hPa（缺氧条件）下进行测量，然后将其他数值分布在所用特定指示染料的动态范围内。本实验中采用 PtTFPP 作为 O2-敏感性指示染料固定在聚苯乙烯基质中。图像分别在 0、48、102、156 和 207 hPa 条件下采集；207 hPa 对应于给定盐度和压力下 100% 的空气饱和度。
  4. 对样品进行成像
    1. 将样本置于相机前方，并确保光照均匀。
    2. 在获取植物发光寿命图像之前，关闭照射植物的光源（以及其他所有光源）。根据强度图像调整采集时间，确保信号在寿命测定中既不饱和，又具有足够强的信噪比（S/N）。
    3. 将植物暴露于不同的光照条件下（例如，光照/黑暗），并采集一组图像。
    4. 打开房间的灯以进行采集 结构图像.
      注意：当背景光开启时，相机无法测量到真实的寿命图像。然而，此时强度图像会显示通过半透明传感器所观察到的整个视野。
    5. 在视野中放置一把尺子或类似物进行成像，以便后续对所获取的图像进行比例标定。

5. 数据分析

  1. 使用相机制造商提供的宏，直接从专用成像软件中导出相位寿命和强度图像。
  2. 使用一款可免费获取的图像分析软件进行进一步的图像分析（参见材料表）。
  3. 在图像分析软件中打开校准用的相位寿命图像，并利用测量功能确定整幅图像的平均值。将测得的寿命值对已知的O2浓度作图，以确定校准函数（图4A）。
  4. 根据所有数据计算τ0/τ（其中τ0为无O2条件下测得的相位寿命），并将这些值对已知的O2浓度作图（图4B）。
  5. 利用动态碰撞猝灭的简化双位点模型（方程3）38,39，从校准曲线中确定参数Ksv和f，其中[Q]为O2浓度。在数据分析软件中定义拟合函数，由软件自动确定Ksv和f。

(3) figure-protocol-1

  1. 在图像分析软件中打开获取的样品图像，利用已确定的参数 Ksv, f 和 τ0，将成像的寿命数据转换为 O2 浓度。
    注意：作为替代方法，也可直接使用获取的校准相位寿命值（图 4A）。此时，使用曲线拟合功能进行指数拟合以完成校准。
  2. 在图像分析软件中打开带有标尺的图像，使用测量工具测量已知距离，并在 设置标尺 中将该测量值设为全局尺度。

结果

作为新型成像系统的应用示例，我们展示了复杂生物样品（即水生植物Littorella uniflora的根际）的二维O2成像。

首先，该方法描述了平面传感器膜（即所谓的平面光极）的制备过程。如图1所示，这种光极由涂覆在透明支撑材料上的聚合物基质中的光学指示剂薄层构成。通过遵循所述方案，可获得厚度均匀的均质传感膜，其厚度由刮刀涂布装置的间隙决定。如果制得的光极出现传感材料分布不均（例如涂层存在孔洞、条纹或染料聚集，可通过肉眼或在紫外灯辅助下观察判断），则需要重复该方案，并使用丙酮彻底清洗所有材料。

平面光极制备完成后，可将样品与平面光极的传感层紧密接触。如图所示，平面光极已集成于根际三明治培养室（rhizo-sandwich chamber）中，使植物根系及其周围的沉积物基质能够与平面光极紧密贴合（图2）。若制备得当，该根际三明治培养室应可轻松地在两个水族箱（一个用于孵育，另一个用于测量）之间转移。若构建不当，则可能导致培养室结构不稳定、沉积物脱落或产生气泡。因此，建议在组装完成后立即对根际三明治培养室进行目视检查。

本方案利用基于频率域的发光寿命成像相机，实现对与平面光极接触的样品进行基于频率域的发光寿命成像。有关该相机系统的更多细节，例如图像采集模式和科学级互补金属氧化物半导体（SCMOS）相机特性，已在近期的出版物中详细描述8,29。

该装置本身相当简单，仅包括控制光源（本例中为LED激发光源）的相机以及带有传感器的样品（图3）。确保所有部件正确连接，并使样品被均匀照射。在进行测量时需避免背景光干扰。

在对样品成像之前，需要对光学传感器进行校准。如图4A所示，测得的荧光寿命随着O2浓度的增加而呈准指数衰减。该关系也可用简化的双位点模型描述（图4B和公式3）。在给定示例中，后续用于计算O2浓度的参数如下：τ0 = 56.26 µs，Ksv = 0.032 hPa-1，f = 0.86。

执行校准也是检验系统是否正常工作的理想方法。如果所有组件均按照本文所述（或制造商指南中规定）的方式安装，测得的寿命应表现出相同的O2 依赖性，如所见 图4此外，对于相同的O组合2 传感材料（聚合物和染料），所测得的 τ0 应处于相同范围内（± 少数 µs如本文所述（主要受实验温度影响）。若无法获得相似的校准曲线，请确保所有步骤均正确执行。有时传感器可能意外地将敏感面朝向玻璃壁而非样品，或所获取的图像曝光过度或不足。

利用校准参数，可通过成像氧探针的发光寿命（τ）来确定 O2 浓度。如图5A,B 所示，在黑暗条件下以及在 500 µmol 光子 m-2 s-1 光照下 12 小时后，对 Littorella uniflora 根际区域的 O2 浓度分布进行了成像。由于植物的光合作用活性，光照后根际区域的 O2 浓度升高。除了寿命图像外，还可以在外部照明条件下获取“结构”图像，同时保持成像几何结构不变。通过这种方式，O2 图像可与结构图像（图5C）、横截面或感兴趣区域实现精确定位关联。例如，分别从黑暗和光照条件下获取的图像中提取了穿过单根的 O2 浓度分布剖面（图5D）。

figure-results-1
图1：平面O2光学传感器的制备。（A）将PET薄膜固定在玻璃板上，并将刮刀涂布装置置于薄膜上。（B）将配制好的传感混合液作为一条细线涂布在刮刀涂布装置前方的PET薄膜上。（C）向下移动刮刀涂布装置，将传感混合液在PET薄膜上均匀涂布成一层薄膜，待溶剂挥发后即得到可直接使用的平面光学传感器。请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：集成平面O2光极的根际三明治培养室组装示意图。（A）利用水膜将光极固定在其中一块玻璃板上。（B）使用电工胶带将光极粘附在玻璃板上。（C）在另一块带有间隔物（即显微镜载玻片）的玻璃板中填充沉积物。（D）将植物根系放置于均匀铺展的沉积物表面。（E）合上根际三明治培养室，并用夹具临时固定。（F）完全闭合并组装好的根际三明治培养室。（G）为防止培养光源照射光极以及抑制藻类生长，将塑料遮光罩覆盖在组装好的根际三明治培养室上。（H）将根际三明治培养室置于水族箱中进行培养。请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：成像装置示意图，包含基于频域的发光寿命相机，物镜通过透明水族箱和根际三明治培养室壁从背面聚焦于样品上的传感探针（optode）。 发光二极管（LED）激发光源的导光管已定位，以实现对样品的均匀照明。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-4
图4：平面O2 光学传感器的校准曲线。 （A）在充满水的校准室中，于不同O2 浓度下测得的相应磷光寿命。（B）利用简化的双位点模型拟合校准数据得到的Stern-Volmer图（动态碰撞猝灭，公式3）。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-5
图5：O的寿命成像2 水生植物根际的分布 Littorella uniflora. (A) O2 光照约12小时后植株内的分布情况 500 µmol 光子 m-2 s-1. (B) O2 在将植物置于黑暗中1小时后的分布情况。C通过平面光极观察到的植物根系结构图像。D) 横截面 O2 浓度分布（位置由图A和图B中的黄线指示）在光照12小时（红色）和黑暗1小时（黑色）后的结果。经许可改编自（Koren, K., Moßhammer, M., Scholz, V. V., Borisov, S.M., Holst, G., Kühl, M. 化学传感器的发光寿命成像——基于时间域与频率域相机系统的比较）。 分析化学. 91 (5), 3233-3238, doi: 10.1021/acs.analchem.8b05869 (2019)。版权所有 (2019) 美国化学会。 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

本方案涵盖了从光学传感器制备到 O2 图像分析的完整工作流程。按照本方案操作，可利用基于频域的荧光寿命成像相机获取化学图像。根据具体应用需求，平面光学传感器可制备成不同尺寸，其传感层厚度范围广泛，既可制备成面积达数十分之一平方厘米、坚固耐用的 50–100 µm 厚平面传感器，也可制备成传感层厚度 <1 µm 的显微镜盖玻片6,40。该方法的潜力已在特定应用中得到验证，但其应用不仅限于植物根际的 O2 成像12,28。

与基于纯发光强度的化学成像方法相比，该方法具有多项优势。发光寿命成像不受或至少极少受到照明不均、传感膜厚度不均以及光漂白的影响25。此外，该方法避免了在比率成像中通常需要使用额外参比染料的问题17,37。与其他基于寿命的相机系统（如常用的门控时间域相机8,26）相比，本文所介绍的新型相机系统及实验方案能够提供可比的结果。在最近的一项研究中，两种系统的分析特性被进行了比较，结果表明，基于频域的发光寿命相机系统至少可与已停产的时间域前代系统相媲美8。

我们已展示了最简单的O2光学子传感器，其仅由一种指示剂嵌入聚合物基质中构成。除了其他多种可能的O2指示剂20外，还可加入添加剂，例如散射剂如TiO2或金刚石粉末2，以增强传感器信号，但会降低光学子传感器的透明度。此外，也可使用其他染料，通过能量转移来增强信号强度41。

在平面光极的制备过程中，当使用文中所述的传感器混合溶液配方时，建议刀涂设备的间隙设置为75–120 µm，以便在溶剂蒸发后（约为所用间隙的10%）获得约7.5至12 µm的最终传感层厚度。这一厚度在信号强度（可通过提高染料负载量或选择更亮的指示剂和参比染料来调节）与响应时间之间达到了良好平衡。传感层厚度的增加会导致响应时间延长，因为分析物在传感层与周围介质之间达到热力学平衡所需的时间随之增加12。

如文中所述，光学传感器（optodes）对氧气（O2）浓度变化的响应时间在数秒内17，同时仍能保持足够强的发光信号。通过旋涂法可制备响应时间小于一秒的超薄传感涂层6。如果基底或刮刀涂覆装置未彻底清洁，可能导致传感器涂层不均匀。此外，若传感混合液未充分均质，或在涂覆装置前方铺展后过快进行涂覆操作，也可能出现此类不良结果。因此，制备理想的光学传感器可能需要一定经验与练习。

该方法可用于成像能够与传感膜紧密接触的样品，例如某些海洋动物42、生物膜6和土壤31等。本文展示了一种使用物镜的独立装置，但该相机也可轻松与显微镜耦合，以实现更高分辨率的化学成像43。

尽管基于时域的发光寿命成像能够抑制背景荧光26，但在使用新型基于频域的相机系统时，这一问题仍然存在8。由于该相机持续进行图像采集，它会记录样品中任何可被所选LED激发、并在相机物镜上的发射滤光片所定义的光谱窗口内发射的背景荧光。这将导致测得的寿命值偏低，从而产生错误读数。如果所处理的样品具有显著的内源性荧光，且该荧光与O2传感器的激发和发射波段重叠，则必须在光学传感器表面额外施加光学隔离层，即涂覆一层含炭黑的材料2,17，以确保只有来自平面光学传感器的发光信号能够到达相机。为检测是否存在背景发光，可采集一张不包含光学传感器的图像，该图像将仅显示样品自身的内源性发光。此外，也可在传感器混合液中添加散射剂（如TiO2或金刚石粉末）2,44，以增强指示染料的发光强度。然而，这种方法也可能导致染料更快发生光漂白，且TiO2是一种已知的光催化剂，可能损害染料的光稳定性41。另一个需要考虑的因素是环境光干扰。在进行发光寿命成像时，应尽可能避免环境光的影响。因此，该成像方法要求将实验装置置于黑暗环境中，并在图像采集期间临时关闭所有外部光源。

总之，发光寿命成像是一种可靠的化学成像方法，可适用于多种不同应用。本实验方案（见第1至第5节）涵盖了生成 O2 图像所需的全部关键步骤，并采用了目前最灵活的频域发光寿命成像系统，可替代已停产的门控时域相机，用于基于平面光学传感器的二维 O2 成像。

披露

作者 Gerhard Holst 是 PCO AG 的员工，该公司生产了本文所使用的相机系统。PCO AG 为本文的出版和开放获取费用提供了资金支持。

致谢

我们感谢哥本哈根大学的Sofie Lindegaard Jakobsen和奥胡斯大学的Lars Borregaard Pedersen提供的技术协助。本研究经费来自丹麦独立研究基金（DFF-1323-00065B；MK）的Sapere Aude高级资助，以及丹麦独立研究基金 | 自然科学（DFF-8021-00308B；MK）的项目资助。 & 技术与生产科学（DFF-8022-00301B 和 DFF-4184-00515B；MK）、丹麦国家研究基金会（DNRF136）以及保罗·杜·耶森基金会（KK）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
带气石和水泵的空气泵当地水族用品商店
氯仿Sigma Aldrich67-66-3
DC4 硅胶化合物Dow Corning GmbH2793695
气体混合器Vögtlin Instruments GmbHred-y compact meter GCM这只是其中一种可能的仪器。多家公司提供气体混合装置
玻璃板和水族箱当地水族或五金商店
ImageJ 软件ImageJ免费提供的图像处理软件（imagej.nih.gov/ij/index.html）
刮涂设备

BYK-GARDNER GMBH byk.com		2021这是一种四边可调的涂膜器，便于轻松调节薄膜厚度。其他型号也可使用。我们建议涂布薄膜的厚度在 75–120 µm 之间，溶剂蒸发前所得薄膜厚度约为最终传感器层厚度的 ~10%。
LED 灯，反射器 PAR38MegamanMM17572
LED LEDHUBOmicon Laserage, Germany可配置多种 LED。在本示例中，绿色 LED（528 nm）至关重要
LOCTITE AA 3494Henkel AG & Co. KGaANA丙烯酸基瞬干胶
NIS Elements AR 软件Nikon Inc用于图像采集的软件包
pco.flimPCO AG, Germany基于频率域的发光寿命成像相机
铂(II)-5,10,15,20-四(2,3,4,5,6-五氟苯基)卟啉（PtTFPP）Frontier ScientificPtT975O2 指示剂
聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）薄膜Goodfellow320-992-72此类薄膜也可从其他供应商处获得，用作固体支撑材料
聚苯乙烯（PS）Sigma Aldrich9003-53-6聚合物基质
Schott RG610 滤光片www.uviroptics.com此处可获取 52 mm 螺纹安装滤光片。其他来源提供 Schott 玻璃制成的方形玻璃滤光片，可安装在物镜前方
乙烯基电工胶带Scotch, Super 33+NA
Zeiss Makro Planar 2/100 配 Hama C 转 Nikon 接环随相机提供若物镜无 C 接口，也可使用其他物镜配合转接环

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氧微电极频域成像相机平面光学传感器氧浓度根际成像传感器混合液刀片涂布法校准程序结构成像
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