يصف هذا البروتوكول طريقة لتوليد أنسجة رئوية هندسية قابلة للتكرار على نطاق صغير، عن طريق إعادة ملء شرائح الرئة الدقيقة المقطوعة بدقة مع الخلايا الظهارية السنخية من النوع 2، والخلايا الليفية، والخلايا البطانية.
هناك حاجة إلى تحسين نماذج الرئة ثلاثية الأبعاد (3D) التي تلخص التعقيد المعماري والخلوي للحويصلات الهوائية الرئوية الأصلية خارج الجسم الحي. سهلت النماذج العضوية التي تم تطويرها مؤخرا توسيع ودراسة السلف الظهاري الرئوي في المختبر ، ولكن هذه المنصات تعتمد عادة على مصفوفة و / أو مصل مشتق من ورم الفئران ، وتتضمن سلالة خلوية واحدة أو اثنتين فقط. هنا ، نصف بروتوكولا لتوليد أنسجة الرئة الهندسية (ELTs) استنادا إلى إعادة التجميع متعدد السلالات لشرائح الرئة المقطوعة بدقة (PCLS). تحتوي ELTs على هياكل تشبه السنخية تضم ظهارة سنخية ، ولحمة متوسطة ، وبطانة ، داخل ركيزة مصفوفة خارج الخلية (ECM) تشبه إلى حد كبير تلك الموجودة في الرئة الأصلية. لتوليد الأنسجة ، يتم تضخيم رئتي الفئران باستخدام الأغاروز ، وتقطيعها إلى شرائح بسماكة 450 ميكرومتر ، وتقطيعها إلى شرائح ، وإزالة خلاياها. ثم يتم إعادة زرع سقالات ECM اللاخلوية الناتجة بالخلايا البطانية الأولية والخلايا الليفية والخلايا الظهارية السنخية من النوع 2 (AEC2s). يمكن الحفاظ على AEC2s في ثقافة ELT لمدة 7 أيام على الأقل باستخدام وسط نمو خال من المصل ومحدد كيميائيا. طوال عملية تحضير الأنسجة وزراعتها ، يتم قص الشرائح في نظام كاسيت يسهل التعامل مع العديد من ELTs وبذرها بشكل موحد بالتوازي. تمثل ELTs هذه منصة استزراع عضوي من شأنها تسهيل التحقيقات في تفاعلات الخلايا الخلوية ومصفوفة الخلايا داخل الأسناخ بالإضافة إلى الإشارات الكيميائية الحيوية التي تنظم AEC2s ومكانتها.
الحويصلات الهوائية هي الوحدات الوظيفية للرئة البعيدة ، التي تضم شبكة من المساحات الهوائية المتبادلة للغاز التي تصطف على جانبيها الخلايا الظهارية السنخية من النوع 1 (AEC1s) وخلايا النوع 2 (AEC2s). يوجد وراء الظهارة شبكة كثيفة من الشعيرات الدموية بالإضافة إلى اللحمة المتوسطة الداعمة ، وكلها مدعومة بسقالة مصفوفة خارج الخلية (ECM) توفر القوة والمرونة لهذه الأكياس الهوائية الحساسة1. الحويصلات الهوائية هي أيضا موقع الإصابة في العديد من أمراض الرئة ، بما في ذلك التليف الرئوي مجهول السبب2 ، ومتلازمة الضائقة التنفسية الحادة3 ، ومرض فيروس كورونا الوخيم-19 (COVID-19)4. على الرغم من أن العمل على مدى العقد الماضي قد كشف عن مرونة ملحوظة داخل ظهارة الرئة ، إلا أن الآليات التي تمكن من إصلاح الرئة البعيدة في بعض البيئات – والتي تمنع الإصلاح في أماكن أخرى – لا تزال مجالا للتحقيق المكثف5. إن تطوير منصات محسنة في المختبر لنمذجة الحويصلات الهوائية من شأنه أن يسهل دراسات البيولوجيا السنخية والتجديد والعلاجات.
AEC2s تجديد ذاتي وتمييز في AEC1s ، وبالتالي تعتبر الخلية الجذعية الأولية للرئة البعيدة6،7،8. ومع ذلك ، تشكل هذه الخلايا تحديا خاصا للدراسة في المختبر نظرا للصعوبات المرتبطة بزراعة AEC2s الأولية دون فقدان النمط الظاهري9. في الثقافة التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) ، تقوم AEC2s بتسطيح واعتماد بعض ميزات الخلايا الشبيهة ب AEC110. في المقابل ، تدعم استراتيجيات الاستزراع ثلاثي الأبعاد ، وهي الأكثر شيوعا من المواد العضوية ، الحفاظ على الميزات المتباينة في AEC2s الأولية 6,11,12 وتسمح بزراعة طويلة الأجل للخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSC) المشتقة من AEC2s13,14. تم استخدام المواد العضوية لنمذجة تطور الرئة البعيدة 15 ، والعدوى الفيروسية11،15 ، والأمراض الوراثية المرتبطة ب AEC213،16،17 ، مما يتيح رؤى مهمة في بيولوجيا AEC2 والتجديد. ومع ذلك ، فإن نماذج الثقافة هذه تتكون عادة من سلالة خلوية واحدة أو اثنتين فقط ، وتقوم بتضمين الخلايا في مصفوفات من نوع الهلام تفشل في تلخيص إما البنية أو الركيزة ECM للحويصلات الهوائية الرئوية الأصلية.
ECM هو منظم حاسم للنمط الظاهري للخلية والسلوك عبر الإشارات الجزيئية والطبولوجية والميكانيكية. يضم مكونا رئيسيا من المنافذ الخاصة بالأنسجة التي تنظم مصير الخلايا الجذعية ؛ ويعمل كخزان يعدل توافر عوامل النمو المفرزة محليا18،19،20،21. وبالتالي ، فإن زراعة الخلايا على ECM الأصلي قد تزيد من القدرة التنبؤية للأنظمة المختبرية لنمذجة بيولوجيا الأنسجة في الجسم الحي. يمكن أن تحافظ إزالة الخلايا ، وهي عملية تزيل المواد الخلوية من الأنسجة عبر المنظفات أو الإنزيمات أو الطرق الفيزيائية أو غيرها ، على سقالات ECM للعضو الأصلي ، عند تنفيذها بعناية22,23. يمكن إعادة توطين هذه السقالات بخلايا لثقافة المحاكاة الحيوية 3D. ومع ذلك ، في حين أن السقالات المنزوعة الخلايا تستخدم على نطاق واسع لتطبيقات هندسة الأنسجة ، إلا أن استخدامها لزراعة الخلايا الروتينية كان محدودا. وقد أبلغت العديد من الدراسات السابقة عن إزالة الخلايا وإعادة التوطين لشرائح الرئة أو أجزاء أنسجة الرئة الصغيرة. بالإضافة إلى دراسات إثبات المفهوم24،25،26 ، تم استخدام شرائح الرئة المعاد تجميعها لدراسة التصاق مصفوفة الخلايا الليفية 27،28 والتحقيق في تأثير مصفوفات الرئة المريضة على النمط الظاهري للخلايا الليفية27،29. مع التقنيات المحسنة المتاحة لتوليد شرائح الأنسجة المقطوعة بدقة ، يمكن أن توفر شرائح الرئة المنزوعة الخلايا منصة مريحة وصغيرة النطاق لزراعة الخلايا ، مع الحفاظ على الهياكل الفرعية السنخية ومجرى الهواء والأوعية الدموية. دمج أنواع متعددة من الخلايا من شأنه أن يمكن من دراسات التفاعلات بين الخلايا والخلايا داخل بيئة 3D ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى استراتيجيات محسنة لتسهيل التعامل مع الأنسجة طوال عملية الزراعة ، وضمان البذر المتحكم فيه والقابل للتكرار للأنسجة ذات الأعداد المعروفة من الخلايا.
هنا ، نقدم بروتوكولا لتوليد أنسجة الرئة الهندسية (ELTs) عن طريق إعادة ملء شرائح الرئة المقطوعة بدقة (PCLS) مع الخلايا البطانية الأولية ، AEC2s ، والخلايا الليفية. في تكييف لنظام أنسجة القلب الهندسيالموصوف سابقا 30 واستراتيجيات إزالة الخلايا وإعادة الخلية الكاملة للرئة 22,31 ، نصف إجراءات لقطع PCLS من رئتي الفئران وقص الشرائح إلى أشرطة زراعة الأنسجة القابلة لإعادة الاستخدام التي تبسط وتوحد التلاعب في المصب. يتم إزالة الشرائح المقطوعة لتشكيل سقالات ECM غير الخلوية ، والتي يتم إعادة تعبئتها في حمامات البذر المخصصة. تحافظ سقالات شرائح الرئة على مكونات وبنية ECM المهمة ، وتدعم نمو AEC2s داخل هياكل تشبه السنخية متعددة السلالات لمدة 7 أيام على الأقل. تمثل ELTs نظاما جديدا للزراعة المشتركة السنخية ضمن مصفوفة ثلاثية الأبعاد ذات صلة من الناحية الفسيولوجية ، والتي يجب أن تدعم تطوير استراتيجيات هندسة أنسجة الرئة ، مع تسهيل الدراسات البيولوجية الأساسية ل AEC2s والأسناخ.
تصف هذه الورقة استخدام شرائح الرئة المقطعة بدقة كمنصة لتوليد أنسجة رئوية هندسية في المختبر ، والتي تحتوي على هياكل تشبه السنخية متعددة السلالات. من خلال الجمع بين الاستراتيجيات التي طورناها سابقا لإعادة ملء سقالات الرئة ECM اللاخلوية عالية الدقة لهندسة الرئة الكاملة 22,31 ، مع نظامنا القوي لزراعة أنسجة القلب الهندسية على نطاق صغير 30 ، يتيح هذا البروتوكول استخدام ECM الرئوي ذي الصلة من الناحية الفسيولوجية كركيزة لزراعة الأنسجة ، بطريقة قابلة للتكرار ومعتدلة الإنتاجية.
الطرق المعروضة هنا تفصل إعداد سقالة ELT من رئتي الفئران ، والتي يمكن تحقيقها بسهولة ، ويمكن استخراجها بشكل جماعي مع إمكانية الوصول المباشر إلى الشعب الهوائية السليمة لتضخم الأغاروز ، وهي ذات حجم أكبر من رئة الفأر. ومع ذلك ، يمكن استخدام أي أنسجة رئوية يمكن نفخها باستخدام الأغاروز وشرائح إنتاجية لا يقل طولها عن 9 مم داخل هذا النظام. بغض النظر عن مصدر الأنسجة ، فإن التضخم الموحد لأنسجة الرئة مع الأغاروز هو الخطوة الأكثر أهمية لضمان نجاح تقطيع الأنسجة وقصها ومعالجتها. تميل أنسجة الرئة غير المنتفخة إلى التقطيع بشكل نظيف ، في حين أن الأنسجة المنتفخة بشكل مفرط قد تتمزق أثناء القطع. بعد هلام الأغاروز ، تكون مناطق الأنسجة المتضخمة بشكل مناسب ثابتة ولكنها توفر القليل من العطاء عند الضغط عليها بلطف باستخدام الملقط. بالنسبة لرئتي الفئران السليمين ، وجدنا أن النفخ المسبق للرئتين المستخرجتين بالهواء عدة مرات ، يليه تضخم الأغاروز في أقرب وقت ممكن بعد الاستخراج ، يؤدي إلى أفضل نتائج التقطيع وأفضل جودة لسقالات الأنسجة الناتجة. يجب تحسين الحجم المناسب من الأغاروز تجريبيا ؛ بالنسبة لرئة الفئران ، يبلغ الحجم المطلوب لتضخيم الرئة إلى إجمالي سعة الرئة حوالي 30 مل / كجم من الكتلة الحيوانية (على سبيل المثال ، 10.5 مل من الأغاروز للرئتين من فأر 350 جم). بالنسبة لأنسجة الرئة الأكبر حجما مع وصول أقل مباشرة إلى مجرى الهواء (مثل تلك الموجودة من متبرعين بشريين) ، قد يكون من الضروري إجراء بعض عمليات استكشاف الأخطاء وإصلاحها الإضافية لتضخيم الأنسجة عبر الشعب الهوائية32. أثناء تقطيع الرئة اللاحق ، يعد اختيار وتوجيه الأنسجة على المكبس خطوة مهمة أخرى ل 1) التأكد من أن الشرائح كبيرة بما يكفي لتوليد شرائط الأنسجة التي يمكن قصها في أشرطة زراعة الأنسجة و 2) زيادة مساحة الأنسجة المتنية (السنخية) ، باستثناء الشعب الهوائية الكبيرة أو الأوعية.
يمكن أن يكون قص PCLS في أشرطة زراعة الأنسجة خطوة صعبة في البداية ، ولكن الكاسيت يبسط إلى حد كبير التعامل مع الأنسجة أثناء إزالة الخلايا والبذر. هناك مشكلتان محتملتان قد تنشآن هما تمزق الأنسجة (إما أثناء عملية القطع ، أو أثناء إزالة الخلايا) ، أو وضع الأنسجة في المقاطع التي تؤدي إلى ضعف البذر في المصب (على سبيل المثال ، عدم البذر ، أو البذر فقط في النهايات). قد يكون التمزق نتيجة للتضخم المفرط في الأغاروز ، أو الإفراط في تمدد الأنسجة أثناء إدخال علامة التبويب ، أو ترك القليل جدا من التراكم لتوفير قبضة كافية على الأنسجة عند إدخال علامات التبويب. لاحظ أن الشرائح التي تمزق في نهاية مقطع واحد قد يتم زرعها بنجاح ، ومع ذلك ، يصعب تصورها تحت المجهر أثناء الزراعة لأن الأنسجة ليست مسطحة. من المحتمل أن يكون ضعف بذر الأنسجة (مثل ذلك الوارد في الشكل 6C) نتيجة لعدم وجود شريحة مسطحة بين المقطعين ، وبالتالي ضعف الاتصال بقاعدة حمام البذر جيدا عند قلبها رأسا على عقب. سبب آخر محتمل هو الجلوس غير السليم للكاسيت في الجزء السفلي من حمام البذر جيدا. من حيث القطع ، ضع المزيد من التوتر قليلا في الأنسجة عند وضع المقطع الثاني لمساعدته على الاستلقاء. بعض الشرائح لها تقعر طفيف. في هذه الحالات ، قم بقص الشريحة مع الجانب المحدب لأعلى. مع الممارسة ، عادة ما نواجه البذر الفاشل مع أقل من 2٪ من الشرائح.
أحد قيود هذا البروتوكول هو متطلبات بعض المعدات المتخصصة – قاطع ليزر وطابعة 3D – لتوليد المواد الأولية لإعداد ELT. ومع ذلك ، بمجرد إنشاء أشرطة زراعة الأنسجة وحمامات البذر ، لا يلزم وجود مواد خاصة إضافية. تستغرق خطوات تقطيع الرئة وإزالة الخلايا من إعداد سقالة ELT وقتا معتدلا. ومع ذلك ، يمكن تنفيذ هذه الخطوات مقدما ، أو بأعداد كافية للتحضير لتجارب متعددة في نفس الوقت. يمكن قطع العديد من PCLS (>100 إذا تم تحسينها للمناطق المتني) من رئة واحدة وتجميدها المفاجئة لاستخدامها لاحقا. في حين أن دورة تجميد ذوبان واحدة قد تسبب أضرارا طفيفة فوق الهيكلية ل ECM46 ، فقد ثبت أنه حتى دورات التجميد والذوبان المتعددة لا تسبب خسارة كبيرة في ECM23,47. يمكن أيضا قص PCLS وإزالة خلاياه قبل التجربة ، لاستخدامها في غضون شهر واحد. (والجدير بالذكر أن بروتوكول إزالة الخلايا الموصوف يمكن إنجازه في حوالي 6 ساعات ، مما يمثل ميزة كبيرة على الطرق الموصوفة سابقا والتي تتطلب يوما أو أكثر27,28.) بمجرد إعداد السقالات ، تكون عملية بذر الخلايا بسيطة وسريعة ، ولا تتطلب ثقافة ELTs تقنيات متخصصة.
أحد التحذيرات من طريقة ELT الموصوفة هو عدم وجود بذر خاص بالمنطقة ، أي توصيل AEC2s على وجه التحديد إلى الفضاء السنخي ، أو الخلايا البطانية على وجه التحديد إلى الفضاء الوعائي. ومع ذلك ، على الرغم من أن الخلايا تزرع ببساطة فوق سقالات الأنسجة ، إلا أن نمط إعادة التكاثر غير عشوائي ، مع بعض مظاهر التنظيم الشبيه بالسنخية ، بما في ذلك الحلقات الظهارية. نحن نشك في أن التفاعلات بين الخلايا الخلوية ، وكذلك الاختلافات المحلية في تكوين ECM والهندسة20,21 ، من المحتمل أن تسهم في أنماط إعادة الخلية الملحوظة. ودعما لهذه الفرضية، أظهرت دراسة نشرت سابقا، حيث تم زرع الخلايا الليفية بشكل غير محدد على شرائح الرئة منزوعة الخلايا، أن نمط إعادة توطين الأنسجة والأنماط الظاهرية الخلوية المرتبطة بها يختلف اختلافا كبيرا حسب منطقة الأنسجة المجهرية ومصدر سقالة ECM (على سبيل المثال، صحي مقابل مريض)27. كما لوحظ أن الخلايا الليفية تغزو الخلالي – الموقع الذي تقيم فيه في أنسجة الرئة الأصلية 1,27. الطريقة البديلة الأساسية التي يمكننا تخيلها لزراعة الخلايا على شرائح الرئة بطريقة خاصة بالمنطقة حقا ستستلزم بذر رئتين منزوعة الخلايا سليمة عبر مجرى الهواء31,48 ومقصورات الأوعية الدموية 49,50 ، ثم تقطيع الأنسجة المعاد خلاياها. ومع ذلك، فإن هذا البديل 1) أكثر استهلاكا للتكلفة والوقت والموارد؛ 2) هو انخفاض الإنتاجية؛ 3) يتطلب زيادة أعداد الحيوانات ؛ و 4) يرتبط بزيادة خطر التلوث بسبب تحديات زراعة الرئة بأكملها والتقطيع اللاحق للرئة البذورية. على الرغم من أنها لا تلخص جميع جوانب التنظيم الخلوي الأصلي ، إلا أن منصة ELT تمكن من زراعة خلايا الرئة على ركيزة ECM ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ، بطريقة يمكن الوصول إليها من قبل العديد من المختبرات.
تعد مرونة نظام ELT ميزة رئيسية لهذه المنصة ، ويجب أن تسمح بزراعة أنسجة الرئة على نطاق صغير مع أي عدد من سقالات الأنسجة أو الخلايا أو وسائط الثقافة ذات الاهتمام. قد يسمح استخدام السقالات المشتقة من الأنسجة المريضة أو من نماذج الإصابة بدراسة تفاعلات الخلايا الخلوية أو مصفوفة الخلايا في إعداد ECM27,29,51 المعدل بالمرض. ومع ذلك، لاحظ أن بروتوكول إزالة الخلايا قد يحتاج إلى تكييف لمراعاة الاختلافات في المصفوفة بين الأنواع52. يمكن استخدام استراتيجية البذر الموصوفة لأي نوع من الخلايا ، ويتم تكييف الجدول الزمني للزراعة ليناسب احتياجات الباحث. كنقطة انطلاق ، يجب أن تنتج 1 × 106 خلايا لكل سقالة نسيجا عالي الخلايا في غضون 7 أيام من الزرع ، في حين أن 1 × 105 خلايا إجمالية تؤدي إلى ضعف الخلوية. في أي تكييف للجدول الزمني ، يجب إزالة أشرطة زراعة الأنسجة من حمام البذر 24 ساعة بعد آخر بذر للأنسجة. هنا ، بهدف نمذجة بعض التعقيد الخلوي لأسناخ الرئة ، نصف استراتيجية إعادة توطين ثلاثية الثقافات تدعم الحفاظ على AEC2s حديثي الولادة المتمايزة جيدا في هياكل تشبه السنخية لمدة 7 أيام على الأقل. تظهر نتائجنا أيضا نجاح تطعيم كل من الخلايا الليفية والخلايا البطانية داخل ELTs ، مع التأكيد على التطبيق الواسع للركيزة المستزرعة وملاءمتها لدراسات الزراعة المشتركة. قد يسهل بذر الخلايا البالغة في ELTs نمذجة الهياكل السنخية الأكثر هدوءا ، في حين أن بذر AEC2s البشري المشتق من PSC ، بما في ذلك تلك التي تحتوي على تعديلات وراثية ، يمكن أن يسهل الدراسات الانتقالية للأمراض البشرية13,53. بشكل عام ، يوفر النهج التصاعدي الذي تتيحه منصة ELT الفرصة للتحقيق في مساهمات أنواع معينة من الخلايا في القراءات ذات الأهمية – مثل انتشار AEC2 أو حالة التمايز.
باختصار ، يحدد هذا البروتوكول نظاما قويا لتوليد أنسجة رئوية هندسية لدراسات الزراعة المشتركة ل AEC2s والخلايا الليفية والخلايا البطانية داخل سقالات شرائح الرئة ECM اللاخلوية. تمثل ELTs استراتيجية جديدة للثقافة ثلاثية الأبعاد ل AEC2s الأولية ، والتي اعتمدت حتى الآن عادة على مصفوفات من نوع هلام أقل فسيولوجية للحفاظ على نمط ظاهري متمايز جيدا 6,11,12. تعتمد المنصة الحالية على العمل السابق في إعادة توطين شرائح الرئة الخالية من الخلايا 24،25،26،27،28،29 ، ولكنها توفر العديد من المزايا: 1) نظام كاسيت زراعة الأنسجة لتسهيل التعامل مع ELT أثناء إزالة الخلايا ، والبذر ، والثقافة. 2) حمام بذر مخصص لزرع عدد معروف من الخلايا بدقة على كل سقالة شريحة ؛ و 3) استراتيجية إعادة البذر الثلاثي التي تمكن من إعادة توطين الأنسجة السنخية مع الخلايا الظهارية والوسيطة والبطانية. وبالتالي ، تمثل ELTs خطوة مهمة إلى الأمام نحو إنشاء نماذج قابلة للتكرار في المختبر تلتقط التعقيد الخلوي والركيزة للحويصلات الهوائية الأصلية ومكانة الخلايا الجذعية AEC2.
The authors have nothing to disclose.
يود المؤلفون أن يشكروا لورينزو سيوانان وخورخي نونيز على عملهما في تطوير تصميم كاسيت زراعة الأنسجة المستخدم في هذا البروتوكول ، ومختبر كامينسكي لاستخدام الاهتزاز الخاص بهما ، وماوريتسيو تشيوتشيولي وجيسيكا نوس للمساعدة في تقطيع الرئة ، وآلي لاروكو للمساعدة في التجارب التجريبية الأولية ، وهونغ تشيان على القراءة المتأنية للبروتوكول. تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة F30HL143880 (K.L.L.) ، ومنحة تدريب برنامج تدريب العلماء الطبيين T32GM136651 (K.L.L.) ، و U01HL145567 (L.E.N.) ؛ ومن خلال هدية بحثية غير مقيدة من شركة Humacyte Inc. (L.E.N.).
3D Printer: Form 2 | Formlabs | ||
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
8-Bromo cAMP | Sigma | B7880 | |
Agarose, UltraPure LMP | Invitrogen | 15517-014 | |
Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
Barbed reducer fitting, 3/8 inch x 1/4 inch | McMaster-Carr | 5121K271 | |
Benzonase nuclease | Sigma | E1014 | |
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | Gemini | 700-104P | For AEC2 growth medium |
Bovine serum albumin (BSA), standard grade | Gemini | 700-100P | For benzonase buffer |
Check valve, polypropylene, 1/8 inch hose barb | Cole-Parmer | SK-98553-10 | |
CHIR99021 | PeproTech | 2520691 | |
Clear Resin, 1 L | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
Cyanoacrylate glue, such as Krazy Maximum Bond Permanent Glue | Any hardware, craft, or drug store | KG483 or similar | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
DMEM (low glucose) | Gibco | 11885-084 | |
DMEM (high glucose) | Gibco | 11965-092 | |
DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
EDTA, 0.5 M, pH 8.0 | AmericanBio | AB00502-01000 | |
EdU kit (Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647) | Invitrogen | C10340 | Used according to manufacturer's directions |
Elbow fitting, 3/8 inch | McMaster-Carr | 5121K907 | |
F12 | Gibco | 11765-054 | |
Fetal bovine serum (FBS), characterized | Hyclone | SH30071.03 | |
Gentamicin sulfate | Gemini | 400-100P | Reconstituted in diH2O for a stock solution at 50 mg/mL |
Hair clippers | Wahl | MiniArco | |
Hank's balanced salt solution (HBSS), Phenol Red Free | Gibco | 14175-095 | |
Heparin sodium injection, USP, 1000 U/mL | Sagent | NDC: 25021-400-30 | For intraperitoneal and intracardiac injection |
Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | For pulmonary artery perfusion; prepare stock solution at 100 U/mL in PBS |
HEPES Buffer | Corning | 25-060-Cl | |
Inline tee fitting, 3/8 inch x 1/8 inch | McMaster-Carr | 5121K851 | |
Inoculating loop, disposable | Fisherbrand | 22-363-600 | |
Insulin from bovine pancreas | Sigma | I6634 | |
Ketamine injection, 100 mg/mL | Covetrus (Butler Animal Health) | 010177 | |
KGF, recombinant human | PeproTech | 100-19 | |
Laser cutter, VLS 3.50 30 watt | Universal Laser Systems | ||
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
Luer-lock, female, 3/32 inch | Cole-Parmer | 45508-02 | |
Luer-lock, male, 1/8 inch | Cole-Parmer | 30800-24 | |
Luer-lock, male, 1/4 inch | McMaster-Carr | 51525K146 | |
MCDB-131 Complete without serum | VEC Technologies | MCDB-131 WOFBS | |
Magnesium chloride (MgCl2), 1 M | AmericanBio | AB09006-00100 | |
NaCl | American Bioananalytical | AB01915 | |
Phosphate buffered saline (PBS), without Ca2+ and Mg2+, 10X | Sigma | D1408 | Reconstitute to 1X with diH2O |
Phosphate buffered saline (PBS), with Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 21300-058 | |
PDMS – SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 4019862 | |
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL penicillin/10,000 μg/mL streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
Petri dish, 150 mm | Falcon | 351058 | |
Plastic film (parafilm) | Bemis | PM-996 | |
Pharmed BPT tubing, LS 16 | Masterflex | 06508-16 | |
Pharmed BPT tubing, LS 17 | Masterflex | 06508-17 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 14 | Masterflex | 96420-14 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 16 | Masterflex | 96420-16 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 36 | Masterflex | 96410-36 | |
Poloxamer 407 (Pluronic F-127) | Sigma | P2443 | |
Povidone/iodine prep pads, 10% | Dynarex Corporation | 1108 | |
PTFE sheet, 0.060 inch (1/16 inch) thick | ePlastics | PTFENAT0.060X12X12 | For tissue culture cassette tabs |
PTFE sheet, 0.093 inch (3/32 inch) thick | ePlastics | PTFENAT0.093X12X12 | For tissue culture cassette frames and clips |
Peristaltic pump drive: Masterflex L/S Variable-Speed Digital Drive | Cole-Parmer | ZM-07528-30 | |
Peristaltic pump head: Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head | Cole-Parmer | EW-77202-60 | |
Rat, Sprague Dawley | Charles River | Strain Code: 400 | |
Razor blade | Any hardware or craft store | Personna 94-120-71 or similar | |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
Rotary blades, 28 mm | Omnigrid | 2046 | |
Rotary cutter, 28 mm | Olfa | Model 9551 | |
Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma | D6750 | |
Sodium nitrorusside (SNP) | Sigma | 71778 | |
Stopcock, 4-way | Edwards | 594WSC | |
Suture, 4-0 monofilament polypropylene | Covidien | VP-557-X | |
Syringe, 10 mL | BD | 302995 | |
Syringe, 50 mL | BD | 309653 | |
Tissue culture dish, 35 mm | Falcon | 353001 | |
Tissue culture dish, 100 mm | Corning | 430167 | |
Tissue culture plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
Tissue culture plate 12-well | Falcon | 353043 | |
Transferrin human | Sigma | T8158 | |
Tris, 1 M solution, pH 8.0 | AmericanBio | AB14043-01000 | |
Triton X-100 | American Bioanalytical | AB02025-00500 | |
Vibratome, Compresstome VF-300-0Z | Precisionary Instruments LLC | ||
Xylazine, 100 mg/mL | Henry Schein | NDC: 11695-4022-1 | |
Y-connector, 1/16 inch barbed | Cole-Parmer | 30614-43 |