Ein verbessertes Verfahren zur RNA-Isolierung aus Loblolly Pine ( P. taeda L.) und andere Nadelbaumarten
Summary
Viele pflanzliche Gewebe, einschließlich Phloem und Xylem von loblolly Kiefer (<em> Pinus taeda</em> L.), einen hohen Gehalt an Phenolen und Polysaccharide, die mit RNA Aufreinigung stören. Diese Präsentation beschreibt Techniken für die Ernte im Freiland Gewebe und Isolierung von RNA in ausreichender Qualität für Microarrays und andere genomische Analysen.
Abstract
Gewebe aus Nadelbaumarten, insbesondere den Angehörigen der Pinaceae Familie, wie loblolly Kiefer isoliert (<em> Pinus taeda</em> L.), enthalten hohe Konzentrationen an Phenolverbindungen und Polysaccharide, die mit RNA Aufreinigung stören. Isolation von hochwertigen RNA aus diesen Arten sind strenge Gewebe Mahnverfahren in das Feld und die Beschäftigung eines RNA-Isolierung Protokoll von mehreren organischen Extraktion Schritte umfasst, um RNA in ausreichender Qualität für die Microarray-und andere genomische Analysen zu isolieren. Die Isolierung von hochwertigen RNA aus Feld-gesammelt loblolly Kiefer Proben kann eine Herausforderung sein, aber einige Anpassungen an Standard-Gewebe und RNA-Isolierung Verfahren erheblich besseren Ergebnissen führen. Das Ausmaß der allgemeinen RNA-Abbaus erhöht, wenn die Proben nicht ordnungsgemäß gesammelt und transportiert werden aus dem Feld, vor allem während große Ernten. Gesamt-RNA-Ausbeuten deutlich durch Pulverisieren Proben erhöht werden in einer mit flüssigem Stickstoff Gefrierschrank Mühle vor der Isolierung RNA, besonders wenn Proben aus holzigen Gewebe kommen. Dies ist vor allem auf die Anwesenheit von Oxidationsmitteln, wie Phenol-Verbindungen, und Polysaccharide, dass beide vorhanden sind, in hohen Konzentrationen in Extrakten aus den holzigen Gewebe der meisten Nadelbaumarten. Wenn sie nicht entfernt, können diese Verunreinigungen über zu Problemen führen, wie RNA-Abbaus, dieses Ergebnis in geringen Ausbeuten und eine schlechte Qualität RNA-Probe zu tragen. Verschleppung von Phenolverbindungen sowie Polysaccharide, können auch verringern oder sogar ganz beseitigen die Aktivität der reversen Transkriptase oder andere Polymerasen allgemein zur cDNA-Synthese verwendet. Insbesondere bestimmt RNA als Vorlage für doppelsträngigen cDNA-Synthese in der Generierung von cDNA-Bibliotheken, einzelsträngige cDNA-Synthese für PCR oder qPCR ist, oder für die Synthese von Microarray-Target-Materialien verwendet werden, müssen von höchster Qualität sein, wenn Forscher erwarten, um optimale Ergebnisse zu erzielen. RNA-Isolierung Techniken, die üblicherweise für viele andere Pflanzenarten eingesetzt werden, oft in ihrer Fähigkeit, diese Verunreinigungen aus Nadelholz Proben zu entfernen und somit nicht Ertrag Gesamt-RNA-Proben geeignet für nachgeschaltete Manipulationen nicht aus. In diesem Video zeigen wir Methoden für Feld-Sammlung von Koniferen Gewebe, beginnend mit dem Einschlag eines 40 Jahre alten Baum, um die Ernte von Phloem-, Sekundar-Xylem und Reaktion Holz Xylem. Wir zeigen auch ein RNA-Isolation-Protokoll, das eine gleichbleibend hohe Qualität RNA für nachfolgende enzymatische Manipulationen nachgegeben hat.
Protocol
Discussion
Die Beschaffung qualitativ hochwertiger RNA aus Nadelbaumarten kann eine schwierige Aufgabe angesichts der hohen Phenol-und Polysaccharid-Verbindungen in holzigen Gewebe gefunden werden. Beginnend mit dem Protokoll, das von Chang et al. (1), haben wir, dass strengere Extraktion gefunden und bereinigen Stufen führen auf die konsequente Trennung von sehr hoher Qualität Gesamt-RNA aus verschiedenen holzigen und nicht verholzte Gewebe von einer Vielzahl von Nadelbaumarten abgetastet. Dieses Video hat nicht nur unsere modi…
Acknowledgements
Wir möchten den folgenden Personen ohne deren Hilfe die Sammlung von Kiefer Gewebe wäre nicht möglich gewesen danken: Dr. Joe Nairn, Matt Bryman, Michael Bordeaux, Ujwal Bagal, Huizhe Jin, und Amanda Bouffier.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| RNA Isolation Buffer | 2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine | |||
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-4 | ||
| Phenol, Ultrapure | Invitrogen | 15509-037 | ||
| 10M LiCl | Made with DEPC-treated water | |||
| SSTE Buffer | 1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0) | |||
| Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8 | Made with DEPC-treated water | |||
| Phenol-chloroform (pH8.0) | 120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0 | |||
| Oak Ridge High Speed Teflon Tubes | Thermo-Fisher | #05-562-16B | ||
| Polypropylene 50mL High Speed Tubes | Thermo-Fisher | #05-562-10K | ||
| BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes | VWR | #21008-939 | ||
| Phase Lock Gel Heavy, 2mL | Thermo-Fisher | #2302830 | ||
| Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL | Ambion, Inc. | #AM12425 |
Referências
- Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 113-116 (1993).
- Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Siműes, M., Dean, J. F. D. Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray. Journal of Visualized Experiments. 25, (2009).
