一种改进的从湿地松（P. taeda L.）及其他针叶树种中分离RNA的方法

摘要

许多植物组织，包括来自湿地松（Pinus taeda L.）的韧皮部和木质部，含有高水平的酚类物质和多糖，这些成分会干扰RNA的纯化。本介绍讨论了从田间采集植物组织并分离出适用于微阵列及其他基因组分析的高质量RNA的技术。

摘要

从松科等针叶树种中分离的组织，特别是像火炬松（Pinus taedaL.) 含有高浓度的酚类化合物和多糖，这些物质会干扰 RNA 的纯化。从这些物种中分离高质量 RNA 需要在野外进行严格的组织采集，并采用包含多个有机萃取步骤的 RNA 提取方案，以获得足以用于微阵列及其他基因组分析的高质量 RNA。从野外采集的火炬松样品中提取高质量 RNA 可能具有挑战性，但对标准组织和 RNA 提取流程进行若干改进后可显著提高结果。如果样品在野外未被正确采集和运输，尤其是大规模采收时，总 RNA 的降解程度会明显增加。在 RNA 提取前，使用液氮冷冻研磨仪将样品粉碎，可显著提高总 RNA 产量，特别是当样品来源于木质组织时。这主要是因为氧化剂（如酚类化合物）和多糖在大多数针叶树种木质组织提取物中含量较高。若不彻底去除，这些污染物可能残留下来，导致 RNA 降解等问题，从而造成产量低下和 RNA 样品质量差。酚类化合物和多糖的残留还可能降低甚至完全抑制逆转录酶或其他常用于 cDNA 合成的聚合酶的活性。特别是，若 RNA 将用于双链 cDNA 文库构建、PCR 或 qPCR 的单链 cDNA 合成，或微阵列探针材料的制备，则其质量必须达到最高标准，研究人员才能获得最佳实验结果。常用于其他许多植物物种的 RNA 提取技术往往难以有效去除针叶树样品中的这些污染物，因此无法获得适用于下游操作的总 RNA 样品。在本视频中，我们演示了针叶树组织的野外采集方法，从砍伐一棵四十年生的树木开始，到采集韧皮部、次生木质部和反应木木质部。我们还展示了一种 RNA 提取方案，该方案 consistently 获得高质量 RNA，适用于后续的酶学操作。

方案

第1部分：树木采收

选定树木并将其砍伐后，应尽快仔细操作。每种不同类型的组织在采集后，应立即分别放入液氮容器中，以避免样品材料之间的交叉污染。该RNA提取方案具有可扩展性。

1. 将原木截成约 0.5–0.75 m 长的段，并使用链锯沿原木纵轴方向在树皮上划开两到三处刻痕。
2. 使用木凿从刻痕处开始撬动，使树皮逐渐与木材分离；一边继续用凿子操作，一边向后拉扯树皮，直至其完全从茎干上剥离。
3. 用直边单面剃刀沿已去皮原木的纵轴方向刮取次生木质部。佩戴乳胶手套以尽量减少组织污染。
4. 位于树皮内侧的韧皮部可通过手工剥离轻松获取。
5. 反应木材从枝条的下侧采集，采集前需用喷漆标记以指示其相对于地面的原始方向。
6. 将枝条截成 1–2 m 长的原木段，并沿纵轴方向在相对的两侧划痕，以大致标示出两种反应木材的位置：对侧木材（位于枝条上侧）和压应力木材（位于枝条下侧）。按上述方法将树皮从枝条上分离，但每次仅去除覆盖某一类反应木材的树皮。然后按上述方法采集次生木质部或韧皮部，并立即放入液氮中。
7. 其他样品（如针叶、嫩梢和幼嫩球果）可根据需要用手或修枝剪采集。
8. 采集后用液氮速冻的样品应放入标记好的袋子或合适的容器中，并用干冰包装后运回实验室。

第2部分：样品的冷冻研磨机处理

1. 向SPEX 6850冷冻研磨机的储罐中加入液氮，并将冲击杆放入其中一个研磨瓶中，加入液氮进行预冷。倒出液氮后，将样品加入研磨瓶中。
2. 确保研磨腔内无残留的过量液氮，并在安装端盖密封腔体前，彻底排出多余的氮气。
3. 将研磨瓶插入研磨载体中并关闭盖子。
4. 对木质样品以14号速率设置进行两次研磨，每次1分钟。
5. 使用经液氮预冷的刮勺将研磨后的样品（木粉）转移至已预冷并含有少量液氮的烧杯中。
6. 将液氮与样品的混合物倒入储存容器中，并于-80°C保存，直至使用。

第3部分：RNA提取，第1天

1. 将 20 mL RNA 提取缓冲液加入一个 50 mL 带盖 Falcon 管中，加入 400 μL β-巯基乙醇，短暂涡旋混匀，然后置于 60°C 水浴中加热。
2. 向每根管中加入 4 g 冷冻组织。盖紧管盖，手动剧烈振荡，随后涡旋 10 秒。
3. 向管中加入等体积的氯仿，轻轻颠倒混匀。将管子置于旋转轮上，进行头尾翻转混合 5 分钟。
4. 将混合物倒入 50 mL Oak Ridge 管中，在 SS34 固定角转子中以 12,000 rpm（17,200 ×g）离心 5 分钟。
5. 将水相转移至新的 Oak Ridge 管中，并加入半体积的氯仿。
6. 涡旋 1 分钟，然后在旋转轮上继续混合 5 分钟。在 SS34 固定角转子中以 12,000 rpm（17,200 ×g）离心 5 分钟。
7. 将水相转移至新的 Oak Ridge 管中，并加入半体积的氯仿。涡旋 1 分钟。在 SS34 固定角转子中以 12,000 rpm（17,200 ×g）离心 10 分钟。
8. 将水相转移至 50 mL 高速聚丙烯管中，在 SS34 固定角转子中以 10,000 rpm（11,900 ×g）离心 20 分钟。
9. 将上清液倾入 50 mL Falcon 管中，并向上清液中加入四分之一体积的 10 M LiCl 溶液。短暂涡旋后，于 4°C 放置过夜以进行沉淀。

第4部分：RNA提取，第2天

1. 开始实验前，将 SSTE 缓冲液在 65° C 水浴中预热。
2. 将经 LiCl 沉淀的样品倒入聚丙烯管中，在 4° C 条件下，使用 SS34 固定角转子以 11,000 rpm（14,450 ×g）离心 30 分钟，使 RNA 沉淀。
3. 离心后，倒掉并弃去上清液，将管子倒置于 Kimwipes 纸上约 1 分钟，用移液器吸除残留的上清液。
4. 使用移液器将每份沉淀重悬于 800 μL 预热的 SSTE 缓冲液中，充分混匀样品，然后将重悬后的样品转移至 2 mL Ambion 无 RNA 酶的微量离心管中。
5. 在 65° C 加热样品 2 分钟，随后剧烈涡旋振荡，以确保完全重悬。
6. 向每个样品管中加入等体积 pH 8 的苯酚-氯仿试剂，涡旋振荡 30 秒，然后在微量离心机中以 14,000 rpm 离心 3 分钟。
7. 将水相转移至新的 2 mL Ambion 无 RNA 酶的微量离心管中，加入等体积的氯仿，每个样品涡旋振荡 30 秒，再在微量离心机中以 14,000 rpm 离心 3 分钟。
8. 将水相转移至预先在 11,000 rpm 条件下离心 2 分钟处理过的 Phase-Lock Gel 管中，加入半体积的氯仿，轻轻吹打混匀。
9. 以 11,000 rpm 离心 5 分钟，然后将水相转移至新的 2 mL Ambion 无 RNA 酶的微量离心管中。

第5部分：RNA沉淀与乙醇洗涤

1. 向水相中加入 50 μL 3.0 M 醋酸钠（pH 4.8）和 1 mL 100% 乙醇。涡旋混匀后，在 -80°C 下沉淀 30 分钟，或在 -20°C 下过夜沉淀。
2. 在 4°C 下以 14,000 rpm 离心样品 30 分钟，小心吸除上清液，切勿扰动沉淀。
3. 用 1 mL -20°C 的 70%（v/v）乙醇洗涤 RNA 沉淀。在 14,000 rpm 下离心 1 分钟，然后吸除乙醇。
4. 重复步骤 5.3。
5. 打开管盖，在室温下晾干沉淀 3–5 分钟。

第6部分：最终重悬与定量

1. 每个沉淀物用 100 μL DEPC 处理水重悬。涡旋混匀后，于 65°C 孵育 2 分钟，然后置于冰上。必要时重复此步骤以确保样品充分重悬。
2. 如有需要可合并同类样品，并用 10 mM Tris（pH 7.5）将样品稀释至 1:10，总体积为 50 μL，用于分光光度法定量。260/280 和 260/230 的吸光度比值通常分别大于 2.1 和 2.2。RNA 提取产量范围为每克冻存组织 60–120 μg。
3. 取 1.5–2.5 μg RNA 在含 TAE 缓冲液的 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳分析。对于要求更高的样品，可按照制造商说明书使用 Agilent 2100 Bioanalyzer 进行 RNA 分析。

代表性结果：

不同针叶树组织的RNA提取产量范围为60-120 μg/g 木质样品的冻组织通常可获得约70–80 g/g冻组织的产量。260/280和260/230的诊断比值通常均大于2.1，分别表明RNA样品中无显著的酚类或碳水化合物污染。经琼脂糖凝胶电泳分析并用EtBr染色后，样品应显示25S、18S和5S RNA三条清晰条带（图1）。在琼脂糖凝胶上判断28S与18S的化学计量比具有一定的主观性，凝胶电泳条件、染色方法及上样量等因素均可能影响结果。一般而言，28S:18S比值表现为 > 1.5. 然而，某些针叶树样品的比值较低。例如，在进行 Agilent 2100 分析后，我们已观察到多个来自不同组织类型的针叶树样品，其化学计量比接近 1.2:1。因此，通过琼脂糖凝胶电泳显示的明显偏低的 28S:18S 化学计量比并不一定表明样品质量差。叶片、嫩枝和球果样品常因含有叶绿体核糖体 RNA 而出现额外的清晰条带。无法从加样孔迁移或具有高分子质量的溴化乙锭染色物质（>8–10 kb）通常表明存在基因组DNA污染（图2）。在5S条带附近或低于5S条带处出现低分子质量弥散条带，以及核糖体条带染色减弱或明显的18S条带 > 28S 的化学计量比是判断 RNA 是否发生降解的良好指标（图3）。在 Agilent 2100 电泳图谱分析中，基线应较低且相对平滑，主要峰对应于 18S 和 28S 核糖体 RNA，其 28S:18S 比值范围通常在 1.2 至 2.0 之间。Agilent RNA 完整性数值（RIN）可能是评估 RNA 质量更可靠的指标，用于制备微阵列靶标的 RNA 其 RIN 值应至少为 7 或更高。图4 显示了典型的 Agilent 2100 木质部 RNA 电泳图谱，其 28S:18S 比值为 1.4，RIN 值为 8.6；而图5 显示的是质量较差的木质部 RNA 样品，其基线显著升高，并表现出明显降解，28S:18S 比值为 0.65，RIN 值为 3.4。

图1. 高质量松树RNA的琼脂糖凝胶分析。第1道：NEB 1 kb标准分子量标记；第2道：来自火炬松次生木质部的典型总RNA提取结果，显示特征性的核糖体28S、18S和5S条带，以及明显的28S:18S比值 >1.

图2. 松树RNA样品中基因组DNA污染的琼脂糖凝胶分析。泳道1，NEB 1 kb标准，泳道2，显示基因组DNA污染的木质部RNA样品。

图3. 松树样品的琼脂糖凝胶分析，显示RNA降解及基因组DNA污染。泳道1：NEB 1 kb标准，泳道2：木质部RNA样品，显示基因组DNA污染和严重的RNA降解。

图4. 使用所述方法从火炬松木质部分离的总RNA的Agilent 2100电泳图。28S:18S比值为1.4，RIN值为8.6

图 5. 顶端尖端总RNA的Agilent 2100电泳图，显示严重降解和基因组污染。28S:18S比值为0.65，RIN值为3.4

讨论

从针叶树物种中获取高质量RNA可能是一项困难的任务，因为其木质组织中含有较高水平的酚类和多糖化合物。在Chang等人（1）所建立的实验方案基础上，我们发现，采用更为严格的提取和纯化步骤，能够从多种针叶树物种的不同木质和非木质组织样本中稳定地分离出极高纯度的总RNA。本视频不仅展示了我们改进后的RNA分离方案，还介绍了在进行RNA提取之前，用于长叶松的野外采样及样品处理技术的具体步骤。这些采样和制备步骤对于最大限度减少野外采集样本中RNA的降解，以及提高RNA的质量和总得率，具有同等重要的意义。尤为重要的是，我们发现，采用该方法制备的RNA在用于与PtGen2长叶松微阵列（2）杂交的微阵列探针制备时，相较于其他方法，能够显著提高cDNA的合成得率。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RNA提取缓冲液			2% CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），2% PVP（聚乙烯吡咯烷酮；分子量30-40,000），100 mM Tris-HCl（pH 8.0），25 mM EDTA，2.0 M NaCl，0.5 g/L 亚精胺
氯仿	菲舍尔科技公司	C298-4
超纯苯酚	英韦特罗根公司	15509-037
10 M LiCl			用DEPC处理水配制
SSTE缓冲液			1 M NaCl，0.5% SDS，10 mM Tris-HCl（pH 8.0），1 mM EDTA（pH 8.0）
3 M 醋酸钠（NaOAc），pH 4.8			用DEPC处理水配制
苯酚-氯仿（pH 8.0）			120 mL 苯酚，160 mL 氯仿，用0.5 M Tris-Cl（pH 8.0）多次平衡
橡树岭高速特氟龙管	赛默飞世尔科技公司	#05-562-16B
聚丙烯50 mL高速离心管	赛默飞世尔科技公司	#05-562-10K
BD Falcon，无菌带盖50 mL锥形一次性离心管	VWR国际公司	#21008-939
相锁凝胶重型，2 mL	赛默飞世尔科技公司	#2302830
Ambion RNase-free微量离心管，2 mL	Ambion	#AM12425