许多植物组织，包括来自湿地松（Pinus taeda L.）的韧皮部和木质部，含有高水平的酚类物质和多糖，这些成分会干扰RNA的纯化。本介绍讨论了从田间采集植物组织并分离出适用于微阵列及其他基因组分析的高质量RNA的技术。
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摘要
摘要
从松科等针叶树种中分离的组织，特别是像火炬松（Pinus taedaL.) 含有高浓度的酚类化合物和多糖，这些物质会干扰 RNA 的纯化。从这些物种中分离高质量 RNA 需要在野外进行严格的组织采集，并采用包含多个有机萃取步骤的 RNA 提取方案，以获得足以用于微阵列及其他基因组分析的高质量 RNA。从野外采集的火炬松样品中提取高质量 RNA 可能具有挑战性，但对标准组织和 RNA 提取流程进行若干改进后可显著提高结果。如果样品在野外未被正确采集和运输，尤其是大规模采收时，总 RNA 的降解程度会明显增加。在 RNA 提取前，使用液氮冷冻研磨仪将样品粉碎，可显著提高总 RNA 产量，特别是当样品来源于木质组织时。这主要是因为氧化剂（如酚类化合物）和多糖在大多数针叶树种木质组织提取物中含量较高。若不彻底去除，这些污染物可能残留下来，导致 RNA 降解等问题，从而造成产量低下和 RNA 样品质量差。酚类化合物和多糖的残留还可能降低甚至完全抑制逆转录酶或其他常用于 cDNA 合成的聚合酶的活性。特别是，若 RNA 将用于双链 cDNA 文库构建、PCR 或 qPCR 的单链 cDNA 合成，或微阵列探针材料的制备，则其质量必须达到最高标准，研究人员才能获得最佳实验结果。常用于其他许多植物物种的 RNA 提取技术往往难以有效去除针叶树样品中的这些污染物，因此无法获得适用于下游操作的总 RNA 样品。在本视频中，我们演示了针叶树组织的野外采集方法，从砍伐一棵四十年生的树木开始，到采集韧皮部、次生木质部和反应木木质部。我们还展示了一种 RNA 提取方案，该方案 consistently 获得高质量 RNA，适用于后续的酶学操作。
方案
第1部分：树木采收
选定树木并将其砍伐后，应尽快仔细操作。每种不同类型的组织在采集后，应立即分别放入液氮容器中，以避免样品材料之间的交叉污染。该RNA提取方案具有可扩展性。
- 将原木截成约 0.5–0.75 m 长的段，并使用链锯沿原木纵轴方向在树皮上划开两到三处刻痕。
- 使用木凿从刻痕处开始撬动，使树皮逐渐与木材分离；一边继续用凿子操作，一边向后拉扯树皮，直至其完全从茎干上剥离。
- 用直边单面剃刀沿已去皮原木的纵轴方向刮取次生木质部。佩戴乳胶手套以尽量减少组织污染。
- 位于树皮内侧的韧皮部可通过手工剥离轻松获取。
- 反应木材从枝条的下侧采集，采集前需用喷漆标记以指示其相对于地面的原始方向。
- 将枝条截成 1–2 m 长的原木段，并沿纵轴方向在相对的两侧划痕，以大致标示出两种反应木材的位置：对侧木材（位于枝条上侧）和压应力木材（位于枝条下侧）。按上述方法将树皮从枝条上分离，但每次仅去除覆盖某一类反应木材的树皮。然后按上述方法采集次生木质部或韧皮部，并立即放入液氮中。
- 其他样品（如针叶、嫩梢和幼嫩球果）可根据需要用手或修枝剪采集。
- 采集后用液氮速冻的样品应放入标记好的袋子或合适的容器中，并用干冰包装后运回实验室。
第2部....
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讨论
从针叶树物种中获取高质量RNA可能是一项困难的任务，因为其木质组织中含有较高水平的酚类和多糖化合物。在Chang等人（1）所建立的实验方案基础上，我们发现，采用更为严格的提取和纯化步骤，能够从多种针叶树物种的不同木质和非木质组织样本中稳定地分离出极高纯度的总RNA。本视频不仅展示了我们改进后的RNA分离方案，还介绍了在进行RNA提取之前，用于长叶松的野外采样及样品处理技术的具体步骤。这些采样和制备步骤对于最大限度减少野外采集样本中RNA的降解，以及提高RNA的质量和总得率，具有同等重要的意义。尤为重要的是，我们发现，采用该方法制备的RNA在用于与PtGen2长叶松微阵列（2）杂交的微阵列探针制备时，相较于其他方法，能够显著提高cDNA的合成得率。
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致谢
我们谨向以下各位致以诚挚感谢，若无他们的帮助，松树组织的采集工作将无法完成：Dr. Joe Nairn、Matt Bryman、Michael Bordeaux、Ujwal Bagal、Huizhe Jin 和 Amanda Bouffier。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RNA提取缓冲液 | 2% CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），2% PVP（聚乙烯吡咯烷酮；分子量30-40,000），100 mM Tris-HCl（pH 8.0），25 mM EDTA，2.0 M NaCl，0.5 g/L 亚精胺 | ||
| 氯仿 | 菲舍尔科技公司 | C298-4 | |
| 超纯苯酚 | 英韦特罗根公司 | 15509-037 | |
| 10 M LiCl | 用DEPC处理水配制 | ||
| SSTE缓冲液 | 1 M NaCl，0.5% SDS，10 mM Tris-HCl（pH 8.0），1 mM EDTA（pH 8.0） | ||
| 3 M 醋酸钠（NaOAc），pH 4.8 | 用DEPC处理水配制 | ||
| 苯酚-氯仿（pH 8.0） | 120 mL 苯酚，160 mL 氯仿，用0.5 M Tris-Cl（pH 8.0）多次平衡 | ||
| 橡树岭高速特氟龙管 | 赛默飞世尔科技公司 | #05-562-16B | |
| 聚丙烯50 mL高速离心管 | 赛默飞世尔科技公司 | #05-562-10K | |
| BD Falcon，无菌带盖50 mL锥形一次性离心管 | VWR国际公司 | #21008-939 | |
| 相锁凝胶重型，2 mL | 赛默飞世尔科技公司 | #2302830 | |
| Ambion RNase-free微量离心管，2 mL | Ambion | #AM12425 |
参考文献
- Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 113-116 (1993).
- Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Siműes, M., Dean, J. F. D. Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microar....
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