可以推断出艾滋病毒嗜性病毒包膜V3区。 V3是一式三份,采用巢式RT – PCR扩增,测序,PCR扩增,并解释使用生物信息学软件。被列为非R5病毒与G2P分数低1个或多个序列(S)的样品。
背景:收到CCR5拮抗剂类艾滋病毒治疗的一个药物之前,患者必须接受艾滋病毒嗜性测试,以确认他或她的病毒的人口使用蜂窝进入了CCR5辅助受体,而不是替代辅助受体。向性测试的方法之一,是研究HIV包膜,与辅助受体相互作用的V3区序列。
方法:从血浆中提取病毒RNA。 V3区是一式三份嵌套逆转录PCR扩增。的扩增,测序和分析软件,RE_Call。如geno2pheno生物信息学算法推断病毒嗜从V3区序列,然后提交。推断序列被非R5,如果他们geno2pheno的假阳性率低于5.75%。如果从样品中的三个序列中的任何一个推断非R5,病人是不会回应一个CCR5拮抗剂。
这里介绍的方法是一个标准的测序方法应用于向性测试。 HIV包膜V3循环测序预测病毒嗜性的临床应用,直到深夜被限制。 maraviroc(欢跃医疗)临床试验的回顾性分析,此方法已被证明至少同样能够预测病毒嗜性,在临床上常用的其他验证分析比较。
有许多好处执行向性预测V3环的基因型分析。首先,这个程序可以在任何设施进行经营的测序设备,大大增加了获取和减少周转时间向性测试。相比较而言,表型增强敏感性Trofile含量(ESTA)(的Monogram Biosciences公司),其中有向性测试的黄金标准,是在南加州的一个中心。其他好处包括要求的起始原料和最低要求的血浆病毒载量的500copies/mL。同时,运行的基因型检测的营运成本相对较低的表型检测的比较。召回的软件的使用,特别是消除了手动顺序审查的要求,这往往是一个劳动力密集的基因型分析。
这里介绍的方法非常简单,没有特别的又一步骤抵销的重要性。我们建议运行PCR和测序,一式三份,以增加病毒样本人口内捕捉少数物种的可能性。可进行复制大于3,但是我们已经发现一式三份,高效,可靠的。我们也建议采用一步到位逆转录PCR试剂盒(QIAGEN)执行同样的反应,同时保持高灵敏度和特异性都RT – PCR和第一轮PCR。
The authors have nothing to disclose.
这个实验的发展是支持欢跃医疗保健和卫生研究所(CIHR)加拿大研究所和葛兰素史克公司在临床病毒学博士哈里根/ CIHR主席通过。
由辉瑞和Viiv医疗提供支持。
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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RNA extraction using NucliSens easyMAG version 1.0 | ||||
NucliSens easyMAG Magnetic Silica | bioMerieux | cat. # 280133 | (48 x 0.6 ml) | |
NucliSens easyMAG Lysis Buffer | bioMerieux | cat. # 280134 | (4 x 1000 ml) | |
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 1 | bioMerieux | cat. # 280130 | (4 x 1000 ml) | |
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 2 | bioMerieux | cat. # 280131 | (4 x 1000 ml) | |
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 3 | bioMerieux | cat. # 280132 | (4 x 1000 ml) | |
NucliSens easyMAG version 1.0 | bioMerieux | |||
Class II A2 biological safety cabinet | ||||
One-Step Reverse Transcriptase PCR and Second Round PCR | ||||
DEPC-treated water | Ambion Corp. | cat. # 9922 | ||
SuperScrip III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq High Fidelty | Invitrogen | cat#12574-035 | Kit components used: – SuperScript III RT/ Platinum Taq High Fidelty Enzyme Mix – 2X Reaction Mix (a buffer containing 0.4mM of each dNTP, 2.4mM MgSO4) |
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Expand High Fidelity PCR System | Roche Diagnostics | cat. # 1 759 078 | Kit components used: – Expand High Fidelity Buffer 10X conc. with 15 mM MgCl2 (lids labelled 2) – Expand HF PCR Enzyme Mix (3.5U/μl) – MgCl2 Stock Solution (25mM) (lids labelled 4) |
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dNTPs: dATP, dGTP, dCTP, dTTP | Roche Diagnostics | cat. # 11969064001 | (100 mM) | |
Sucrose | Sigma | cat. # S0389-500G | ||
Bromophenol blue sodium salt | Sigma | cat.# B5525 | ||
Cresol Red | Sigma | cat.# 114472-5G | indicator grade | |
Thermocycler | ||||
Gel Electrophoresis | ||||
50X TAE buffer | Invitrogen | cat. # 24710030 | (1000 ml) | |
SYBR Safe DNA gel stain | Invitrogen Life Technologies | cat. # S33102 | ||
Agarose (ultra pure) | Invitrogen | cat. # 15510-027 | ||
E-Gel Low Range Quantitative DNA Ladder | Invitrogen Life Technologies | cat. # 12373-031 | ||
Reagent Grade Type II water | ||||
Gel apparatus | ||||
Sequencing | ||||
ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit | Applied Biosciences | cat. # 4337458 | (25000 reactions) | |
Hi-Di Formamide | Applied Biosciences | cat. # 4311320 | ||
Sodium Acetate (NaOAc) | Sigma | cat. # S-2889 | ||
EDTA | Sigma-Aldrich | Cat.# 03690-100ML | 0.5M, pH=8.0 | |
TRIZMA Hydrochloride Buffer Solution | Sigma | cat. # T-2819 | 1 M, pH 9.0 | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | cat. # M-1028 | 1 M | |
95% Ethanol | ||||
Running Buffer (10X) with EDTA | Applied Biosystems | cat. # 4335613 | 500 mL | |
Polymer Pop-7 (25mL) Or Polymer Pop-7 (10mL) | Applied Biosystems | cat. # 44363929 or cat. # 4352759 | ||
3700/3730 BigDye Terminator v3.1 Sequencing Standard Kit | Applied Biosciences | Cat# 4336943 | ||
Thermocycler | ||||
Centrifuge with plate holders | ||||
3730xl DNA Analyzer | Applied Biosciences |