Inferência genotípica do HIV-1 Tropismo Usando de base populacional de Seqüenciamento V3

Summary

Tropismo do HIV pode ser inferida a partir da região V3 do envelope viral. V3 é PCR amplificados em triplicata utilizando nested RT-PCR, sequenciado, e interpretados usando software de bioinformática. Amostras com a seqüência de um ou mais (s) com pontuações baixas são G2P classificados como não-R5 vírus.

Abstract

Background: Antes de receber uma droga antagonista de CCR5-classe em HIV terapia, o paciente deve passar por um teste de tropismo do HIV para confirmar que a sua população viral usa o co-receptor CCR5 para a entrada de celulares, e não um co-receptor alternativo. Uma abordagem para testes de tropismo é examinar a seqüência da região V3 do envelope HIV, que interage com o co-receptor.

Métodos: RNA viral é extraído do plasma do sangue. A região V3 é amplificado em triplicado com nested-PCR da transcriptase reversa. As amplificações são então seqüenciados e analisados ​​utilizando o software, RE_Call. Seqüências são então submetidos a um algoritmo de bioinformática, tais como Geno2pheno para inferir tropismo viral da região V3. Seqüências são inferidos a ser não-R5 se sua taxa de falsos positivos Geno2pheno cai abaixo de 5,75%. Se qualquer uma das três seqüências de uma amostra é inferida a ser não-R5, o paciente é improvável que responder a um antagonista do CCR5.

Protocol

Procedimento:

1. Extração:

Pelo menos 500 mL de plasma de sangue é necessária como entrada de amostra para este teste genotípico de tropismo do HIV.

1. Extrato de RNA do HIV a partir de 500μL de plasma usando um easyMAG (bioMérieux) extractor automático, ou o método de extração preferencial de seu laboratório.
   Eluir o RNA viral extraído em uma alíquota de 60 mL. Armazenar a -20 graus Celsius ou começar Transcriptase Reversa-PCR imediatamente após a extração.

2. RT-PCR:

4μL de extracto de amostra será ampliado em triplicata utilizando nested RT-PCR métodos. A reação de RT-PCR deve ser criado em uma sala de PCR-limpa.

1. Calcular a quantidade de reagente necessário para o número de amostras a ser ampliado. Siga a tabela abaixo indica os volumes de reagente para uma reação.
   

   Reagente	Volume (mL) (1X de reação)
   DEPC água tratada	10,56
   Tampão de reação 2x	20
   50% de sacarose e 0,04% mix de azul de bromofenol	4
   Cartilha para frente visando o HIV região V3	0,32
   Primer reverso	0,32
   Enzima - SuperScript III One-Step RT-PCR System com Platinum Taq DNA polimerase	0,8
   Total	36

   Volumes tabela 1. Reagente necessário para uma reação de One-Step RT PCR.
   Cada uma etapa de reação RT-PCR requer a seguinte receita:
   • 10,56 mL de água DEPC tratados
   • 20 mL de tampão de reação 2x
   • 4μL de sacarose 50% e 0,04% mix de azul de bromofenol
   • 0,32 mL do primer para a frente visando o HIV região V3
   • 0,32 mL do primer reverso
   • 0,8 mL de enzima
   Para um total de 36μL por reação.
2. Line up tubos de amostra extrato em uma linha ao lado de um vazio, rotulado de 96 poços placa de PCR.
3. Com uma pipeta repetidora, adicione 36 mL da mistura de amostra para cada poço da placa de PCR, de tal forma que há 3 poços preparado para cada extracto de amostra.
   * Nota: Este procedimento deve ser realizado em triplicata, no mínimo, para garantir a amostragem adequada da população viral.
4. Usando uma pipeta multicanal de 8 canais, adicione 4μL de extracto de amostra para cada um dos seus 3 poços. Alterar dicas entre cada adição.
5. Cobrir os poços com tampas de PCR tira.
6. Quando a transferência é comlete, colocar a placa PCR em um termociclador. Definir o termociclador para executar com o seguinte programa: 30 minutos a 52 ° C 2 minutos a 94 ° C 40 ciclos de (15 segundos a 94 ° C, 30 segundo a 55 ° C e 1,5 minutos a 68 ° C) 5 minutos a 68 ° C
7. Retire a placa PCR de termociclador. Placa pode ser armazenado em temperatura ambiente.

Proceder à segunda etapa PCR rodada

3. Segunda rodada de PCR:

1. Calcular a quantidade de reagente necessário para o número de amostras a ser ampliado. Siga a tabela abaixo indica os volumes de reagente para uma reação.
   

   Reagente	Volume (mL) (1X de reação)
   DEPC água tratada	13,45
   60% de sacarose, 0,08% cresol mix vermelho	2
   Roche HiFi sistema de buffer 2	2
   MgCl 2	0,8
   dNTP	0,16
   Frente de primer PCR	0,15
   Primer PCR reverso	0,15
   Expandir HiFi enzima	0,29
   Total	19

   Tabela 2. Volumes de reagentes necessários para uma reação de 2 ^ª rodada PCR.
   Cada segunda reação de PCR rodada requer a seguinte receita:
   • 13,45 mL de água DEPC tratados
   • 2 mL de sacarose 60%, 0,08% cresol mix vermelho
   • 2 mL de tampão Roche sistema Hifi 2
   • 0,8 mL de 25 mM MgCl ₂
   • 0,16 mL de dNTP 25 mM
   • 0,15 mL de ambos os frente e verso PCR
   • 0,29 mL Expandir enzima HiFi
   Para um total de 19 mL por reação.
2. Em uma sala de PCR-clean, com uma pipeta repetidora, adicionar 19 mL de tampão de reação por poço de uma placa de PCR clean.
3. Em uma sala de amplificação post, usando uma pipeta multicanal de 8 canais, transferir 1 mL do modelo RT-PCR para o buffer de PCR segunda rodada. Alterar dicas entre cada adição.
4. Cobrir os poços com tampas de PCR tiras e transferir a segunda rodada placa PCR para um termociclador.
5. Definir o termociclador para executar com o seguinte programa: 2 minutos a 94 ° C 35 ciclos de (15 segundos a 94 ° C, 30 segundos a 55 ° C, 1 minuto a 72 ° C) 7 minutos a 72 ° C
6. Retire a placa de termociclador após a temperatura voltou a 25 ° C.

4. Eletroforese em gel:

A fim de confirmar que a região V3 foi amplificado com sucesso, um passo de eletroforese em gel é realizada.

1. Preparar um gel de agarose com 0,8 g de agarose em pó em 50 mL de tampão TAE 1X. Mexa e derreter no microondas por 1 minuto ~ ou até agarose esteja completamente dissolvido.
2. Adicionar 6 mL de SYBR gel segura mancha e agite para misturar.
3. Despeje em uma bandeja solução gel, gel e adicione o suficiente pentes para acomodar o número de poços PCR.
4. Uma vez que o gel é seco, remova os pentes e colocar o gel no aparelho de gel, certificando-se que esteja completamente submerso em tampão TAE 1X.
5. Usando uma pipeta multicanal 10 mL, adicione 8μL de cada amostra de PCR para o seu bem próprio no gel. Cobrir a placa PCR após as amplificações foram adicionados ao gel.
6. Adicionar 6 mL da escada de DNA com pelo menos um poço por linha.
7. Executar o aparelho gel em ~ 100V ~ por 10 minutos, certificando-se que as bandas não correr o gel.
8. Coloque o gel em uma trans-iluminador UV e tirar uma foto do gel.
   Poços com PCR-amplificado DNA vai aparecer a luz, indicando uma amplificação bem sucedida.
9. Tome nota de todas as amostras, onde três amplificações foram sucesso. Se necessário, repita RT-PCR para as amostras com menos de 3 amplificações.

Proceder a sequenciamento

5. Seqüenciamento:

Depois de amplificado viral cDNA, as amostras podem ser preparadas para o seqüenciamento. A reação de seqüenciamento deve ocorrer em uma sala de pós-amplificação.

1. Remover Big Dye do congelador e primers de seqüenciamento do frigorífico. Deixe o Big Dye descongelar em temperatura ambiente, por não mais de uma hora.
2. Calcular a quantidade de reagente necessário para o número de amostras a serem executados. Siga a tabela abaixo indica os volumes de reagente para uma reação.
   

   Reagente	Volume (mL) (1X de reação)
   Big Dye	0,3
   Big Dye buffer	2,1
   Cartilha	2,6
   Total	5,0

   Tabela 3 volumes. Reagente necessário para uma reação de seqüenciamento.
   * Nota: prepare uma mistura separada para cada primer.
   ** Nota: o Buffer de Big Dye usado na reação de sequenciamento pode ser preparada como segue: Mix 17,5 mL de solução tampão Trizma cloridrato (1 M) (pH9.0) e 0,125 mL de cloreto de magnésio (1 M). Trazer o volume final de 100 mL com água grau reagente. Este deve ser armazenado a 2-8 ° C.
3. Utilizando os cálculos de 3,3, prepare a reação de seqüenciamento misturas para cada primer e vortex por não mais que 5 segundos. Alíquota de 0,2 mL em tubos de strip.
4. ML alíquota 5 de seqüenciamento mistura de reacção para os poços da placa apropriada usando uma pipeta multicanal. Cobrir a placa (s) contendo mistura de reacção com um seqüenciamento Kimwipe e reserve.
5. Prepare uma diluição de 1:15 do produto amplificado PCR, adicionando 180 mL de água estéril Baxter ao produto PCR restantes.
6. Pipetar 1 mL da amostra diluída para o fundo dos poços da placa apropriado, trocar a ponteira.
7. Quando terminar de transferir amostra, selar a placa com tampas de tiras e vortex por 1 segundo
8. Coloque a placa em uma centrífuga. Definir a velocidade de 145g, quando a velocidade de rotação atinge 145g, pare o spin.
9. Coloque a placa em um termociclador (s) definido para o seguinte programa: 25 ciclos de (10 sec @ 96 ° C, 5 sec @ 50 ° C, 55 seg a 60 ° C...) O volume deve ser pelo menos 6μL . O ciclo deve levar cerca de 1,2 horas.

Proceder à precipitação

6. Precipitação:

Para "limpar" o cDNA viral após a reação de seqüenciamento, execute precipitação etanol utilizando etanol a 95%.

1. Recuperar placa do termociclador e levar a uma pós-amplisala de ficação.
2. Retire as tampas de tiras e coloque-os em ordem sobre uma toalha de papel ou Kimwipe.
3. Pipeta 4μL de Trabalho a solução de acetato de sódio-EDTA para o lado de cada amostra. Toque a placa com cuidado para que a solução de EDTA de sódio-cai para o fundo do poço. As dicas a mesma pode ser usado, contanto que não entre em contato a amostra no fundo do poço.
   * Nota: A solução de trabalho Acetato EDTA de sódio pode ser preparada como segue:
   1. Prepare 3M acetato de sódio, dissolvendo 246,1 g de acetato de sódio em 1 L de água grau reagente. Filtrar a solução através de um filtro de 0,45 micro e preparar 50 mL alíquotas.
   2. Prepare stock solução de acetato de sódio EDTA (1,5 M NaOAc, 250 mM EDTA) misturando volumes iguais de acetato de sódio (3 M) e solução de EDTA (500 mM) pH 8,0.
   3. Prepare trabalhando EDTA de Sódio-solução de acetato através da mistura de uma parte de ações EDTA de Sódio-solução de acetato com três partes de água grau reagente (10 mL + 30 mL).
4. 40μL pipeta de etanol a 95% refrigerados para para o lado oposto dos poços de amostras e substituir as tampas de strip.
5. Seal as tampas e vortex a placa por 10 segundos. Toque na placa para desalojar as bolhas.
6. Coloque o prato no freezer a -20 ° C por um período mínimo de 30 minutos e um máximo de 2 horas.
7. 1. Uma vez que a precipitação ocorreu, retire a placa do congelador e coloque em uma centrífuga por 20 minutos a 3.700 rpm.
   2. Remover a quantidade adequada de Hi-Di Formamida (Applied Biosystems) do congelador para permitir que a descongelar antes desnaturação.
   * Nota: A desnaturação de um prato cheio de 96 poços requer 960μL de Formamida Hidi e, portanto, é vantajoso para preparar ~ 1.1mL alíquotas de antemão.
8. Depois de girar a placa de remover e descartar as tampas de strip. Inverter a placa sobre o recipiente de resíduos (lixo bin por exemplo) e sobrenadante a decantar. Livrar de qualquer sobrenadante restante, secar as placas invertidas em papel toalha.
9. Dobre 2 folhas de papel toalha e coloque sobre a superfície do prato. Coloque o prato virado para baixo na centrífuga e giram em 145g, parando o giro quando chega 145g.
10. Remova a placa da centrífuga e certifique-se de poços estão vazias. 155μL pipeta de etanol a 95% refrigerados nos poços.
11. Descartar o sobrenadante para o recipiente de resíduos e secar em papel toalha e repita o centrifugação em 4.10.
12. Após a remoção da placa da centrífuga, descarte de papel toalha usado e deixar placa estar virada para cima por 2-5 minutos para permitir que qualquer etanol restantes para evaporar.

Proceder à desnaturação

7. Desnaturação

1. Recuperar o Formamida Hidi descongeladas e decantar em um recipiente grande o suficiente para uma pipeta multicanal,
   * Nota: Se estiver usando pré-aliquotado medidas como observado no 6.7b, um tubo é necessário para cada placa de 96 poços a ser executado.
2. Usando uma pipeta multicanal, distribuir 10μL de formamida Hidi em todos os poços na placa, incluindo aqueles que estão vazios.
3. Cobrir a placa com um tapete de septos para formar uma vedação.
4. Coloque a placa em um termociclador a 90 ° C por 2 minutos.
5. Após desnaturação, colocar a placa em um suporte da placa, em seguida, carregar no seqüenciador. Carregar um layout de seqüenciamento preparado. As placas podem ser mantidos a -20 ° C por até uma semana antes de executar a executar o seqüenciamento.

8. Analisando os dados resultantes utilizando Software Chamando Base.

1. Usando ReCall executar base de chamada automática, sem intervenção humana, a cobertura de primer é aceitável. ReCall é um software chamado custom base que pode ser encontrada no seguinte URL: http://pssm.cfenet.ubc.ca/
   * Nota: Uma conta é necessária para login. Para configurar uma conta, clique no botão "Registrar" na página de login. Uma vez que uma conta foi criada, você pode acessar a página de upload.
2. Quando logado, você pode selecionar arquivos de exemplo para upload. Usando a opção de navegar você pode encontrar seu seqüenciamento de dados brutos para upload com um máximo de upload de 20Mb.
   * Nota:.. Lembre-se Web só aceita arquivos de dados como ABI e arquivos SCF em um zip, tar ou tar.gz.
3. Uma vez que os arquivos para fazer upload de ter sido selecionada, escolha a seqüência de referência. Neste caso, certifique-se a seqüência de referência é definida como "V3". Agora você está pronto para clicar em "dados do processo."
4. Dados processados ​​serão exibidos no lado direito da página sob o título "Amostras Past". Cada conjunto de correr ou amostra processada será colocado em uma pasta chamada com a data. Estes podem ser re-rotulados, clicando no botão "Renomear".
5. Clique na pasta trará uma lista de amostras. Aqueles que são vermelhos não conseguiram, aqueles que são verdes passaram. Ao clicar em uma amostra específica eo botão "Exibir", você é capaz de rever a seqüência. Siga as instruções no lado direito da página para navegar through seqüência.
   * Nota: Para este método, é aceitável para exportar seqüências que passam recall (mostrado em verde) automaticamente, sem intervenção manual.
6. Se você estiver satisfeito com os resultados que você pode optar por baixar as seqüências de passagem, clicando em "Download". Arquivos serão baixados em uma pasta zipada.
   * Nota: em "Settings" você pode selecionar opções de download e e-mail, incluindo o tipo de arquivo.
7. Amostras não para produzir seqüências triplicado limpas devem ser reamplified em triplicado de extrato. Se RePCR não fornecer uma seqüência de limpeza, um mínimo de duas seqüências é aceitável para uso em inferência tropismo.

9. Inferir tropismo viral de seqüências geradas pelo sequenciamento de base populacional utilizando o algoritmo Geno2pheno Co-receptor.

1. Seqüências podem ser executadas através do serviço de co-receptor Geno2pheno no seguinte URL: http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php.
2. Amostras para fazer o upload pode ser rotulado como melhor lhes convier. A partir do menu drop-down da configuração significado, selecione a opção "cortes otimizados com base na análise de dados clínicos de MOTIVATE (2% e 5,75% FPR)"
3. Optar por fazer upload ou colar uma seqüência para a análise, arquivos fasta são aceitáveis.
4. A FPR Geno2pheno pode ser interpretado da seguinte forma: G2P FPR> 5,75 é representativa de uma população usando R5-viral; probabilidade de responder aos antagonistas do CCR5 G2P FPR <5,75 é representativa de uma população não-R5 viral; improvável para responder a antagonistas do CCR5. G2P <2 é muito improvável que tenha qualquer resposta a antagonistas do CCR5. Se qualquer uma das três seqüências de uma amostra é inferida a ser não-R5, o paciente não é susceptível de responder a um antagonista do CCR5.

10. Resultados representante

Quando o protocolo é realizado corretamente deve-se esperar com sucesso seqüência de 2 ou 3 repetições para cada amostra. Negativos correr ao lado de amostras deve ter nenhuma indicação de RNA. A maioria das sequências devem "passar" por basecalling ReCall.

Com base na distribuição de R5 e não-R5 dentro da população viral comunidade, a maioria das amostras de pacientes selecionados aleatoriamente seria de esperar para ter R5 usando vírus. Portanto, a menos que a concepção do projeto iria sugerir o contrário, deve-se esperar ter mais de R5 não R5 amostras.

Tabela 1. A) Os volumes de reagentes necessários para uma reação de One Step RT-PCR e B) do programa do termociclador necessária para realizar a reação de RT-PCR.

A)

Reagente	Volume (mL) (1X de reação)
DEPC água tratada	10,56
Tampão de reação 2x	20
50% de sacarose e 0,04% mix de azul de bromofenol	4
Frente cartilha SQV3F1	0,32
Reverso primário CO602	0,32
Enzima - SuperScript III One-Step RT-PCR System com Platinum Taq DNA polimerase	0,8
Total	36

* Nota:
SQV3F1 seqüência de primer: 5 'GAG CCA CCC ATT ATA CAT TAT TGT 3'
CO602 seqüência de primer: 5 'GCC CAT AGT TGC TGC GCT TCC TCC CAA GAA CC 3'

B)

N º de Ciclos	Tempo	Temperatura
1	30 minutos	52 ° C
1	2 minutos	94 ° C
40	15 segundo	94 ° C
	30 segundo	55 ° C
	1,5 minutos	68 ° C
1	5 minutos	68 ° C

Tabela 2. A) Os volumes de reagentes necessários para uma reação de PCR segunda rodada e B) do programa do termociclador necessária para realizar a segunda reação de PCR rodada.

A)

Reagente	Volume (mL) (1X de reação)
DEPC água tratada	13,45
60% de sacarose, 0,08% cresol mix vermelho	2
Roche HiFi sistema de buffer 2	2
MgCl 2	0,8
dNTP	0,16
Frente cartilha SQV3F2	0,15
CD4R primer reverso	0,15
Expandir HiFi enzima	0,29
Total	19

* Nota:
SQV3F2 seqüência de primer: 5 'GCC CCA GCT TGT TTT GGT GCG AT 3'
CD4R seqüência de primer: 5 'TAT AAT TCA CTT CTC CAA TTG TCC 3'

B)

N º de Ciclos	Tempo	Temperatura
1	2 minutos	94 ° C
35	15 segundo	94 ° C
30 segundo	55 ° C
Um minuto	72 ° C
1	7 minutos	72 ° C

Tabela 3. A) Os volumes de reagentes necessários para uma reação de seqüenciamento e B) do programa do termociclador necessária para realizar a reação de seqüenciamento.

A)

Reagente	Volume (mL) (1X de reação)
Big Dye	0,3
Big Dye buffer	2,1
Cartilha Frente V3FO2F Reversa SQV3R1	2,6
Total	5,0

* Nota: NÃO combinam primers; uma mistura separada deve ser preparado para cada primer
V3O2F seqüência de primer: 5 'AAT GTC Agy ACA GTA CAA TGT ACA C 3'
SQV3R1 seqüência de primer: 5 'AAA GAA CCT TTC TCC ACA ATT AAA 3'

B)

N º de Ciclos	Tempo	Temperatura
25	10 segundo	96 ° C
5 segundo	50 ° C
55 segundo	60 ° C

Discussion

O método apresentado aqui é um método de seqüenciamento padrão aplicado a testes de tropismo. A aplicação clínica do HIV V3 loop envelope seqüenciamento de prever tropismo viral tem sido limitado até tarde. Este método tem se mostrado, em análises retrospectivas do maraviroc (ViiV Healthcare) ensaios clínicos, para ser, no mínimo, igualmente capaz de prever tropismo viral, em comparação com outros ensaios validados usada clinicamente.

Há muitos benefícios para a realização de análises genotípicas do loop V3 para a previsão do tropismo. Em primeiro lugar, este procedimento pode ser realizado em qualquer instalação com equipamentos de seqüenciamento operacionais, aumentando a acessibilidade e reduzindo o tempo de resposta de teste de tropismo. Em comparação, o Ensaio Trofile fenotípica melhorada Sensibilidade (ESTA) (Monogram Biosciences), que serviu como padrão-ouro para o teste de tropismo, é realizada em um centro no sul da Califórnia. Os benefícios adicionais incluem a exigência de menos matéria-prima e uma carga viral plasmática mínima necessária de 500copies/mL. Assim, os custos operacionais de executar o ensaio genotípicas são relativamente baixos em comparação com aqueles de ensaios fenotípicos. O uso do software ReCall em particular elimina a necessidade de revisão seqüência manual, que tende a ser uma parte do trabalho intensivo de análises genótipo.

O método aqui apresentado é bastante simples, sem nenhuma outra etapa específica superam em importância. Sugerimos execução PCR e seqüenciamento em triplicado para aumentar as chances de capturar espécies minoria dentro da população viral de uma amostra. Replica maior do que três podem ser realizadas, no entanto, temos encontrado triplicatas para ser eficiente e confiável. Sugerimos também usando o One Step-Reverse Transcriptase PCR Kit (Qiagen), que realiza tanto RT-PCR e PCR em primeiro turno a mesma reação, mantendo alta sensibilidade e especificidade.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Extração > < RNA usando NucliSens easyMAG versão 1.0
NucliSens easyMAG Magnetic Silica	bioMerieux	cat. # 280133	(48 x 0,6 ml)
NucliSens easyMAG Lysis Buffer	bioMerieux	cat. # 280134	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 1	bioMerieux	cat. # 280130	4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Tampão de Extração 2	bioMęmieux	cat. # 280131	(4 x 1000 ml)
NúcliSens easyMAG Tampão de Extração 3	bioMęrieux	cat. # 280132	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG versão 1.0	bioMērieux
Classe II A2 gabinete
PCR de Via Transcriptase Reversa em uma Etapa e PCR de Segunda Rodada.
		# 9922
Sistema RT-PCR de uma etapa SuperScrip III com Platinum Taq High Fidelty	Invitrogen	cat#12574-035	Componentes do kit usados: - SuperScript III RT/ Platinum Taq High Fidelty Enzyme Mix - 2X Reaction Mix (um tampão contendo 0,4mM de cada dNTP, 2,4mM MgSO4)
Expand High Fidelity Sistema de PCR	Roche Group	cat. # 1 759 078	Componentes do kit usados:- Expanda o tampão de alta fidelidade 10X conc. com 15 mM MgCl2 (tampas rotuladas como 2)- Expanda a mistura enzimática de PCR HF (3,5U/μ l)- Solução estoque de MgCl2 (25mM) (tampas rotuladas 4)
dNTPs: dATP, dGTP, dCTP, dTTP	Roche Group	cat. # 11969064001	(100 mM)
Sacarose	Sigma-Aldrich	cat. # S0389-500G
Sal de sódio azul de bromofenol	Sigma-Aldrich	cat.# B5525
Cresol Red	Sigma-Aldrich	cat.# 114472-5G	grau indicador
Termociclador
Eletroforese em Gel
50X tampão TAE	Invitrogen	cat. # 24710030	(1000 ml)
SYBR Safe DNA gel stain	Invitrogen	cat. # S33102
Agarose (ultra puro)	Invitrogen	cat. # 15510-027
E-Gel Low Range Quantitative DNA Ladder	Invitrogen	cat. # 12373-031
Reagente Grau Tipo II água
Gel aparelho
Sequencing
ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit	Applied Biosciences	cat. # 4337458	(25000 reações)
Hi-Di Formamida	Aplicada #	4311320
Acetato de Sódio (NaOAc)	Sigma-Aldrich	cat. # S-2889
EDTA	Sigma-Aldrich	Cat.# 03690-100ML	0.5M, pH=8.0
Tampão de Cloridrato de TRIZMA	Sigma-Aldrich	cat. # T-2819	1 M, pH 9.0
Cloreto de Magnésio (MgCl2)	Sigma-Aldrich	cat. # M-1028	1 M
Tampão de Funcionamento de Etanol
(10X) com EDTA	Applied Biosystems	cat. # 4335613	500 mL
Polímero Pop-7 (25mL) Ou Polímero Pop-7 (10mL)	Applied Biosystems	cat. # 44363929 ou cat. # 4352759
3700/3730 BigDye Terminator v3.1 Kit Padrão de Sequenciamento	Applied Biosciences	Cat# 4336943
Thermocycler
Centrífuga com porta-placas
3730xl DNA Analyzer	Applied Biosciences